苗勤 吳香菊 齊靜 叢曉燕 李均同 王林 杜以軍

關(guān)鍵詞：口蹄疫病毒：3D蛋白；真核表達(dá)：I型IFN信號(hào)通路

口蹄疫（foot-and -mouthdisease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease VLrLLS，F(xiàn)M-DV）引起的一種急性、高度接觸性人畜共患傳染病，主要感染牛、羊、豬等偶蹄動(dòng)物，給畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，被世界衛(wèi)生組織列為A類動(dòng)物疫病之首，我國也將其列為一類傳染病?？谔阋卟《緦傩NA病毒科，是單股正鏈RNA病毒，呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)。FMDV基因組全長約8500bp，僅有一個(gè)開放閱讀框（open readingframe，ORF），約6.5 kb，編碼一個(gè)大的多聚蛋白，在L、2A和3C的作用下裂解產(chǎn)生了病毒的4種結(jié)構(gòu)蛋白[VP4（1A）、VP2（1B）、VP3（1C）和VPl（1D）]和8個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D）。FMDV有7種血清型，分別為A型、O型、C型、亞洲I型、SAT1型、SAT2型和SAT3型，且各血清型之間無交叉保護(hù)。

I型IFN是機(jī)體抵抗病毒天然免疫的核心，F(xiàn)MDV感染細(xì)胞后，病毒復(fù)制產(chǎn)生的RNA被宿主細(xì)胞的模式識(shí)別受體所識(shí)別，激活下游信號(hào)通路，刺激產(chǎn)生I型IFN和促炎細(xì)胞因子，從而啟動(dòng)抗病毒反應(yīng)。已有研究表明，F(xiàn)MDV多種蛋白，如前導(dǎo)蛋白L、蛋白水解酶3C、非結(jié)構(gòu)蛋白2B、2C等，參與調(diào)節(jié)先天性免疫信號(hào)通路，拮抗宿主天然免疫，促進(jìn)病毒增殖。

FMDV 3D蛋白是病毒的RNA聚合酶，介導(dǎo)FMDV基因組的合成，且核苷酸和氨基酸序列高度保守。此外，3D蛋白具有T細(xì)胞表位，是一種潛在的免疫增強(qiáng)劑，還可以作為免疫佐劑使用。但3D蛋白在天然免疫中的作用尚不明確，本研究旨在構(gòu)建FMDV 3D基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，并探索3D蛋白對(duì)I型IFN信號(hào)通路的影響，為FMD的防控提供新的靶向分子。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞與質(zhì)粒HEK-293T細(xì)胞、PK-15細(xì)胞、pXJ41真核表達(dá)載體、熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pIFN-Luc和內(nèi)參報(bào)告質(zhì)粒pRL-TK均由山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑PrimeSTAR⑩HS DNA Polymer-ase、DL5000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker，pMD18-T載體購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；Lipofectamine3000 Reagent、Alexa Flu-or 488-羊抗鼠IgG（H+L）購自Invitrogen公司；Western一抗稀釋液購自碧云天生物技術(shù)有限公司；NC膜購自BIO-RAD公司；辣根過氧化物（HRP）標(biāo)記的羊抗兔抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；Sparkjade ECL super（極超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒）購自山東思科捷生物技術(shù)有限公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5a、雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒、RNA-easy Isolation Reagent試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司：限制性內(nèi)切酶HindⅢ、Kpn I及T4 DNA Ligase購自Thermo FisherScientific公司；質(zhì)粒小提試劑盒、通用型DNA純化回收試劑盒購自北京天根生物工程有限公司：DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶一EDTA均購自Gibco公司：抗熒光衰減封閉劑購自Solarbio公司；鼠源、兔源Myc抗體購自Sigma -Aldrich公司；actin抗體購自上海泊灣生物科技有限公司。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1FMDV 3D基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

根據(jù)GenBank公布的FMDV O/BY/CHA/2010（GenBank accession no. JN998085） 3D基因序列，由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成3D基因并連接到pMD18-T載體上。結(jié)合真核表達(dá)載體pXJ41上的酶切位點(diǎn)序列，加入保護(hù)性堿基及Myc標(biāo)簽序列，利用分子生物學(xué)軟件Primer Premier5.0設(shè)計(jì)了一對(duì)擴(kuò)增3D基因的特異性引物：Myc-3D-Fwd（HindⅢ）和Myc-3D-Rev，引物削匕京擎科生物技術(shù)有限公司合成，序列見表1。

以pMD18-T-3D克隆質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系（總體系為25uL）如下：上、下游引物（10pmol/uL）各1uL，模板（200ng/uL）0.5uL，dNTP 2uL，5xPrime STAR buffer 5uL，PrimeSTARHS DNA Polyerase（2.5 U/卜LL） 0.25uL，ddH，0補(bǔ)足至25uL。反應(yīng)條件如下：98℃預(yù)變性2min；98℃變性10s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min；4℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用DNA純化回收試劑盒進(jìn)行回收。

將回收純化的3D基因和pXJ41載體用Hindm/Kpn I雙酶切，酶切產(chǎn)物膠回收純化后用T4DNA Ligase進(jìn)行16℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞，37℃過夜培養(yǎng)16h，挑取單菌落接種于含有氨芐西林抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃、200r/min過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行HindⅢlKpn I雙酶切鑒定，鑒定為陽性的質(zhì)粒送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序，命名為pXJ41 -Myc-3D。

1.2.2Western blotting檢測(cè)FMDV 3D蛋白的表達(dá)

將HEK-293T細(xì)胞接種于6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%時(shí)，用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑按說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pXJ41-Myc-3D和pXJ41空載體各2ug。培養(yǎng)24h后，棄去上清，用等體積預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，將6孑L板置于冰上，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞20min后，4℃12000r/min離心10min。取上清液與上樣緩沖液混合后煮沸10min。將處理好的樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳后，采用濕法（100V，70min）將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜。將NC膜轉(zhuǎn)移至5%脫脂奶粉封閉液中，室溫輕搖封閉1h，用一抗稀釋液稀釋的兔抗Myc和兔抗actin于4℃過夜孵育，二抗為用5%脫脂奶粉稀釋的辣根過氧化物（HRP）標(biāo)記的羊抗兔抗體，室溫孵育1h，洗膜后用Sparkjade ECL super（極超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒）顯色，BIO-RAD凝膠成像儀進(jìn)行曝光。

1.2.3IFA檢測(cè)FMDV 3D蛋白的細(xì)胞定位用無菌鑷子夾取細(xì)胞爬片置于24孔板內(nèi)，接種PK-15細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到40%～50%時(shí)，用Lipo-fectamine3000轉(zhuǎn)染試劑按說明書進(jìn)行操作，各孔分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pXJ41-Myc-3D和pXJ41空載體各0.5ug。培養(yǎng)24h后棄上清，用4%多聚甲醛固定45min;PBS洗10minx3次后，加入0.1%TritonX-100室溫通透30min;PBS洗10min×3次后，加入1：600稀釋的鼠源Myc抗體室溫孵育2h;PBS洗10minx3次后，加入1：1000稀釋的Alexa Fluor488-羊抗鼠抗體，室溫避光孵育1h：PBS洗10minx3次后，加入1：10000稀釋的DA-PI室溫孵育5min;PBS洗10minx3次后，取出爬片置于滴有抗熒光衰減封閉劑的載玻片上，封片后于熒光顯微鏡下觀察3D蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。

1.2.4Luciferase檢測(cè)FMDV 3D蛋白對(duì)IFN啟動(dòng)子的影響

將HEK-293T細(xì)胞接種于12孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%時(shí)，用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑按說明書進(jìn)行操作，分別轉(zhuǎn)染pXJ41-Myc-3D和空載體pXJ41各0.4ug，同時(shí)分別轉(zhuǎn)染IFN啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK 0.04ug。24 h后感染水皰性口炎病毒（Versicular sto-matLtLs VLrUS，VSV）（MOI=0.1），10h后，按雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒說明書方法收取細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5Real-time PCR檢測(cè)FMDV 3D蛋白對(duì)IFN-mRNA的影響將HEK-293T細(xì)胞接種于24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%時(shí)，用Lipofectamine⑩3000轉(zhuǎn)染試劑按說明書進(jìn)行操作，分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pXJ41-Myc-3D和空載體pXJ41各0.5ug，24h后感染VSV（MOI=0.1），10h后，收集細(xì)胞使用RNA-easy Isolation Reagent試劑盒提取總RNA，以其為模板反轉(zhuǎn)錄得到cD-NA，以GAPDH作為內(nèi)參基因檢測(cè)IFN mRNA水平，Real-time PCR引物序列詳見表2。

1.2.6Real-time PCR檢測(cè)病毒拷貝數(shù)將HEK-293T細(xì)胞接種于24孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%時(shí)，用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑按說明書進(jìn)行操作，分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pXJ41-Myc-3D和空載體pXJ41各0.5ug，24h后感染VSV（MOI=0.1），10h后，細(xì)胞及其上清反復(fù)凍融后，一部分用于病毒滴度檢測(cè)；一部分使用RNA-easyIsolation Reagent試劑盒提取總RNA，以其為模板反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，絕對(duì)熒光定量檢測(cè)VSV拷貝數(shù)。

1.2.7TCID50測(cè)定病毒滴度將HEK-293T細(xì)胞接種于96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，將1.2.6中的樣品12000r/min離心10min后取上清，用2%細(xì)胞維持液按10倍梯度稀釋，共10個(gè)梯度，每個(gè)梯度4個(gè)重復(fù)，將稀釋好的樣品加入96孔板中，每孔100uL，并設(shè)置8個(gè)孔加入等體積細(xì)胞維持液做陰性對(duì)照，觀察并記錄細(xì)胞病變情況，按照Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用GraphPad Prism 5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2結(jié)果與分析

2.1pXJ41-Myc-3D真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

以pMD18-T-3D克隆質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增獲得3D基因。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳可見大小約1500bp的特異性目的片段，與預(yù)期大小相符（圖1）。重組質(zhì)粒pXJ41-Myc-3D經(jīng)HindⅢ/Kpn I雙酶切后得到預(yù)期大小的片段（圖2），測(cè)序結(jié)果表明pXJ41-Myc-3D真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2Western blotting檢測(cè)3D蛋白的表達(dá)

經(jīng)Western blotting檢測(cè)到pXJ41-Myc-3D在HEK-293T細(xì)胞中成功表達(dá)，大小約55kDa左右（圖3）。

2.3IFA檢測(cè)FMDV 3D蛋白的細(xì)胞定位

IFA結(jié)果顯示，F(xiàn)MDV 3D蛋白在PK-15細(xì)胞中的表達(dá)主要定位在細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞胞漿中也有少量表達(dá)（圖4）。

2.4雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)FMDV 3D蛋白對(duì)IFN啟動(dòng)子的影響

雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，VSV感染后，pXJ41-Myc-3D轉(zhuǎn)染組的IFN啟動(dòng)子活性極顯著低于空載體pXJ41轉(zhuǎn)染組，表明FMDV3D蛋白抑制了VSV誘導(dǎo)的IFN啟動(dòng)子活性（圖5）。

2.5Real-time PCR檢測(cè)FMDV 3D蛋白對(duì)IFNmRNA的影響

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，VSV刺激后，pXJ41-Myc-3D轉(zhuǎn)染組的IFN mRNA表達(dá)水平極顯著低于空載體pXJ41轉(zhuǎn)染組，表明FMDV 3D蛋白抑制了VSV誘導(dǎo)的IFN mRNA表達(dá)水平（圖6）。

2.6FMDV 3D蛋白對(duì)VSV增殖的影響

Real-time PCR檢測(cè)VSV拷貝數(shù)結(jié)果顯示，pXJ41-Myc-3D轉(zhuǎn)染組極顯著高于空載體組（圖7）。TCID50結(jié)果顯示，pXJ41-Myc-3D轉(zhuǎn)染組VSV TCID50明顯高于空載體轉(zhuǎn)染組（圖8）。表明FMDV 3D蛋白通過抑制I型IFN的產(chǎn)生促進(jìn)了VSV的復(fù)制。

3討論與結(jié)論

口蹄疫是一種急性、高度接觸性人畜共患傳染病，我國主要以0型口蹄疫為主，A型口蹄疫呈點(diǎn)狀散發(fā)，加之境外疫情傳人的影響，給我國的畜牧業(yè)帶來嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。FMDV 3D蛋白作為RNA病毒依賴的RNA聚合酶，催化病毒RNA合成，在不同血清型中高度保守，且有研究表明3D在病毒復(fù)制早期產(chǎn)生，感染后1.5h首先檢測(cè)到3D瞬時(shí)表達(dá)，在核仁中均勻分布。本試驗(yàn)成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pXJ41-Myc-3D，并在HEK-293T細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)驗(yàn)證。通過IFA檢測(cè)到3D蛋白在PK-15胞核和細(xì)胞胞漿中都有表達(dá)，且胞核內(nèi)表達(dá)明顯，顯示3D主要定位于細(xì)胞核，與畢研麗等的研究結(jié)果一致。

天然免疫又稱先天性免疫或固有免疫，是機(jī)體對(duì)抗病毒感染的第一道防線，當(dāng)病毒感染機(jī)體后模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識(shí)別病原相關(guān)模式分子（pathogen associat-ed molecule patterns，PAMPs），激活下游信號(hào)通路，誘導(dǎo)產(chǎn)生I型IFN等細(xì)胞因子，進(jìn)而啟動(dòng)免疫應(yīng)答。PRRs家族包括Toll樣受體（TLRs）、RIG-I樣受體（RLRs）、Nod樣受體（NLRs）．C型凝集素受體（CLRs），其中TLRs和RLRs主要識(shí)別病毒RNA。FMDV在長期進(jìn)化中形成了一系列策略逃逸宿主的天然免疫，從而促進(jìn)自身復(fù)制，維持對(duì)宿主的持續(xù)感染。已有研究表明，F(xiàn)MDV編碼的多種蛋白可參與調(diào)控先天性免疫信號(hào)通路，例如Lb蛋白可以通過去除ISG15的泛素化阻斷天然免疫的啟動(dòng)，裂解LGP2抑制IFN的表達(dá)。3C蛋白通過溶酶體路徑降解蛋白激酶PKR，也能通過抑制NF-KB信號(hào)通路促進(jìn)病毒復(fù)制。3A蛋白與RIG-I、MDA5和MAVS互作并抑制蛋白表達(dá)，抑制RLR介導(dǎo)的IFN產(chǎn)生。2B通過降解RIG-I和MDA5調(diào)節(jié)IFN信號(hào)通路。2B和2C蛋白協(xié)同作用，影響MHC-I復(fù)合物的形成，逃避機(jī)體的天然免疫。3B與RIG-I互作，抑制RIG-I介導(dǎo)的信號(hào)通路。本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)FMDV3C通過阻斷STATl/STAT2核易位來拮抗干擾素信號(hào)通路。FMDV L通過與sRNaseL的N末端結(jié)構(gòu)域相互作用，抑制細(xì)胞凋亡，拮抗OAS/RNase L通路，抑制抗病毒天然免疫。有研究表明FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白3D作為一種反式作用元件調(diào)控TLR3信號(hào)通路的激活，促進(jìn)TLR3通路介導(dǎo)的I型干擾素的產(chǎn)生。但天然免疫反應(yīng)交錯(cuò)復(fù)雜，不同的PAMPs可能激活多條信號(hào)通路，通過不同分子間相互作用共同完成天然免疫應(yīng)答。本試驗(yàn)選用HEK-293T作為研究細(xì)胞，由于該模式細(xì)胞中不含TLR3受體，可排除TLR3信號(hào)通路的影響，探究3D蛋白對(duì)I型IFN信號(hào)通路的作用。

水皰性口炎病毒是一種負(fù)鏈RNA病毒，屬彈狀病毒科水皰病毒屬，是研究I型IFN信號(hào)通路常用的模式病毒，細(xì)胞感染VSV后可激活I(lǐng)型IFN信號(hào)通路。本研究采用VSV模擬病毒感染，通過雙熒光素酶報(bào)告基因、Real-time

PCR及TCID50試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)3D蛋白能夠通過抑制I型IFN信號(hào)通路的活化抑制先天性免疫，進(jìn)而促進(jìn)VSV的復(fù)制。

綜上，F(xiàn)MDV 3D蛋白抑制了VSV誘導(dǎo)的IFN啟動(dòng)子的活性和IFN mRNA水平，促進(jìn)了VSV的復(fù)制，提示FMDV 3D蛋白是病毒抵抗先天性免疫的重要因子，為其在I型IFN信號(hào)通路的作用及機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。