孫 露,張燦偉,宋玉雯,李建新,段 練,高 陽(yáng),謝月美,王露萍,黨光福

?AIM：To identify transcriptional differences between the ocular surface ectoderm (OSE) and surface ectoderm (SE) using RNA-seq, and elucidate the OSE transcriptome landscape and the regulatory networks involved in its development.

?METHODS：OSE and SE cells were differentiated from human embryonic stem (hES) cells. Differentially expressed genes (DEGs) between OSE and SE were analyzed using RNA-seq. Based on the DEGs, we performed gene ontology (GO) analysis, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis, and protein-protein interaction (PPI) network analysis. Transcription factors (TFs) and hub genes were screened. Subsequently, TF-gene and TF-miRNA regulatory networks were constructed using the NetworkAnalyst platform.

?RESULTS：A total of 4 182 DEGs were detected between OSE and SE cells, with 2 771 up-regulated and 1 411 down-regulated genes in OSE cells. GO-BP analysis revealed that up-regulated genes in OSE were enriched in the regulation of ion transmembrane transport, axon development, and modulation of chemical synaptic transmission. Down-regulated genes were primarily involved in nuclear division, chromosome segregation, and regulation of cell cycle phase transition. KEGG analysis indicated that up-regulated genes in OSE cells were enriched in signaling pathways such as cocaine addiction, axon guidance, and amphetamine addiction, while down-regulated genes were enriched in proteoglycans in cancer, ECM-receptor interaction, protein digestion and absorption, and cytokine-cytokine receptor interaction. Additionally, compared with SE, 204 TFs (including FOS, EGR1, POU5F1, SOX2, and PAX6) were up-regulated, and 80 TFs (including HAND2, HOXB6, HOXB5, HOXA5, and HOXB8) were down-regulated in OSE cells. Furthermore, we identified 6 up-regulated and 9 down-regulated hub genes in OSE cells, and constructed TF-gene and TF-miRNA regulatory networks based on these hub genes.

?CONCLUSIONS：The transcriptome characteristics of OSE and SE cells were elucidated through RNA-seq analysis. These findings may provide a novel insight for studies on the development and in vitro directed induction of OSE and corneal epithelial cells.

0 引言

眼表外胚層(ocular surface ectoderm,OSE)屬于表面外胚層(surface ectoderm,SE),是眼表上皮(即角膜和結(jié)膜上皮)在胚胎時(shí)期的前體細(xì)胞[1],其對(duì)眼表正常發(fā)育及出生后正常視覺(jué)功能的維持至關(guān)重要。在胚胎發(fā)育過(guò)程中,前神經(jīng)板發(fā)育而來(lái)的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞向覆蓋在其表面的表面外胚層延伸,然后該區(qū)域的表面外胚層增厚并產(chǎn)生假定的角結(jié)膜上皮[2]。因此,眼表外胚層在發(fā)育過(guò)程中受到表面外胚層以及來(lái)自視網(wǎng)膜前體細(xì)胞等神經(jīng)外胚層的雙重信號(hào)調(diào)控。目前表面外胚層細(xì)胞發(fā)育調(diào)控機(jī)制已較明確[3],分析眼表外胚層與表面外胚層細(xì)胞基因表達(dá)差異,有助于闡明眼表外胚層發(fā)育調(diào)控機(jī)制?；诖?本研究通過(guò)對(duì)人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells,hES)來(lái)源的眼表外胚層和表面外胚層進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA sequencing,RNA-seq)分析,篩選出眼表外胚層與表面外胚層的差異表達(dá)基因(differential expressed genes,DEGs)、轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor, TF)及Hub基因,并進(jìn)行基因本體(gene ontology, GO)分析、京都基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes, KEGG)分析及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)分析,還針對(duì)Hub基因構(gòu)建了TF-gene調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和TF-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò),在轉(zhuǎn)錄組水平揭示了二者表型及信號(hào)調(diào)控的差異,可為眼表外胚層轉(zhuǎn)錄組特征及發(fā)育調(diào)控機(jī)制研究提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1材料本研究中所用到的人胚胎干細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)康寧公司,且相關(guān)實(shí)驗(yàn)工作均已獲得山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并按照相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2方法

1.2.1人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化人胚胎干細(xì)胞H1細(xì)胞株接種于1%濃度的matrigel包被的培養(yǎng)板,采用mTeSRTM 1或mTeSRTM plus培養(yǎng)基(StemCell Technologies)培養(yǎng)。每5-6 d按1∶10的比例傳代一次。眼表外胚層細(xì)胞誘導(dǎo)參照以往文獻(xiàn)報(bào)道的方法[4-5]。首先,將 hES 細(xì)胞接種于LN511包被的培養(yǎng)皿,mTeSRTM 1或mTeSRTM plus培養(yǎng)基培養(yǎng)4-7 d,然后將培養(yǎng)基改為分化培養(yǎng)基,成分見(jiàn)表1。培養(yǎng)3 wk后,在誘導(dǎo)的細(xì)胞中即可同時(shí)形成神經(jīng)外胚層、眼表外胚層和其他表面外胚層細(xì)胞,在顯微鏡下手動(dòng)刮除神經(jīng)外胚層和其他表面外胚層后即可獲取眼表外胚層細(xì)胞。表面外胚層細(xì)胞誘導(dǎo):每平方厘米6.2×103個(gè)人胚胎干細(xì)胞接種于1%濃度的matrigel包被的培養(yǎng)板上。第2 d,將培養(yǎng)基改為含1 μmol/L RA(Sigma)和5 ng/mL重組人BMP-4(R&D Systems)的E6培養(yǎng)基培養(yǎng),2 d換液1次,培養(yǎng)7 d。

表1 細(xì)胞分化培養(yǎng)基成分表

1.2.2免疫熒光染色4%多聚甲醛固定細(xì)胞后,用PBS緩沖液沖洗。然后山羊血清孵育30 min,一抗在4 ℃孵育過(guò)夜。PBS緩沖液沖洗后加入二抗在37 ℃孵育1 h。PBS緩沖液沖洗后DAPI染色,PBS緩沖液沖洗后在熒光顯微鏡下采集細(xì)胞免疫熒光圖像。

1.2.3定量實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶PCR 使用RNeasy Mini Kit (QIAGEN)提取人胚胎干細(xì)胞及人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的眼表外胚層、表面外胚層細(xì)胞的總RNA。隨后使用PrimeScript Real-Time Master Mix Kit (Takara)合成cDNA后進(jìn)行定量實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(qRT-PCR)。PCR程序:95 ℃變性3 min,然后進(jìn)入熱循環(huán)程序:95 ℃變性5 s和60 ℃退火和延伸30 s,重復(fù)40個(gè)循環(huán)。

1.2.4轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及RNA-Seq數(shù)據(jù)分析提取的眼表外胚層和表面外胚層細(xì)胞的總RNA,檢測(cè)質(zhì)量合格后,使用 TruSeq Stranded mRNA Library Prep kit試劑盒構(gòu)建文庫(kù)。隨后總RNA使用NextSeq 500(Illumina)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。差異基因及GO、KEGG分析:使用R4.1.2版進(jìn)行基因表達(dá)分析,并應(yīng)用DEseq2分析眼表外胚層、表面外胚層細(xì)胞中基因水平的差異表達(dá),篩選出|log2(fold change)|>1和Padj<0.05的DEGs,使用R軟件進(jìn)行火山圖譜繪制。隨后,利用GO分析和KEGG分析對(duì)DEGs進(jìn)行功能富集分析,以確定DEGs的主要生物學(xué)功能和相關(guān)的信號(hào)通路。轉(zhuǎn)錄因子分析:通過(guò)hTFtarget database 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget)獲取人類轉(zhuǎn)錄因子基因集,將差異基因與轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行比較、篩選和校正。用R軟件篩選|log2(fold change)|>1和Padj<0.05的轉(zhuǎn)錄因子,并繪制熱圖。

1.2.5PPI網(wǎng)絡(luò)搭建及模塊分析為了進(jìn)一步探討DEGs之間的相互作用,我們使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org/)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),設(shè)置相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值大于0.4[6-7]。使用Cytoscape 軟件繪制 PPI 網(wǎng)絡(luò)。另外,使用Cytoscape插件Cytoscape MCODE篩選關(guān)鍵功能基因模塊。

1.2.6Hub基因的篩選應(yīng)用Cytoscape軟件中的cytoHubba 插件篩選Hub基因。然后,我們選擇7種算法(MCC、MNC、Degree、EPC、Closeness、Radiality、Stress)的交集,最終得到Hub基因。最后,通過(guò)GeneMANIA10 (http://www.genemania.org/) 構(gòu)建了Hub基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)[6]。

1.2.7TF-gene調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和TF-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過(guò)Networkanalyst數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.networkanalyst.ca/)構(gòu)建了TF-gene和TF-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。隨后通過(guò)Cytoscape軟件可視化。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:使用GraphPad Prism(GraphPad, San Diego, CA)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析對(duì)各組間數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化及相關(guān)標(biāo)記物的鑒定人胚胎干細(xì)胞在分化培養(yǎng)基中被誘導(dǎo),逐漸形成了3個(gè)同心細(xì)胞團(tuán)(神經(jīng)外胚層、眼表外胚層和其他表面外胚層細(xì)胞),見(jiàn)圖1A,定向分化成表面外胚層細(xì)胞,見(jiàn)圖1C。誘導(dǎo)的眼表外胚層細(xì)胞高表達(dá)PAX6、p63、K18、K8,而在神經(jīng)外胚層細(xì)胞高表達(dá)PAX6,表面外胚層細(xì)胞高表達(dá)p63、K18、K8(圖1B、D)。相對(duì)定量的qRT-PCR結(jié)果顯示與免疫熒光染色的結(jié)果相一致(圖1E)。選取一些眼表外胚層標(biāo)記物,包括KRT8、KRT18、KRT19、PAX6、TP63、CDH1、TFAP2A、FOXC1,繪制成熱圖,見(jiàn)圖1F。

圖1 hES細(xì)胞誘導(dǎo)分化及特異性標(biāo)記物鑒定圖 A:hES細(xì)胞在角膜分化培養(yǎng)基分化后顯微鏡下照相; B:對(duì)分化的多胚層細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物PAX6(紅色)和角膜上皮發(fā)育相關(guān)標(biāo)志物p63(綠色)、K18(紅色)和 K8(綠色)的免疫熒光染色結(jié)果。細(xì)胞核藍(lán)色;C:顯微鏡觀察定向分化的SE細(xì)胞;D:對(duì)SE細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物PAX6(紅色)和角膜上皮發(fā)育相關(guān)標(biāo)志物p63(綠色)、K18(紅色)和K8(綠色)的免疫熒光染色;E:以 hES 為對(duì)照組,OSE和SE細(xì)胞中TP63、PAX6、KRT8、KRT18基因的表達(dá)情況;F:常見(jiàn)眼表外胚層標(biāo)記物基因熱圖。

2.2DEGs分析對(duì)眼表外胚層與表面外胚層之間的RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析。相對(duì)于表面外胚層,眼表外胚層共有4 182個(gè)基因發(fā)生差異性表達(dá),包含2 771個(gè)上調(diào)基因和1 411個(gè)下調(diào)基因(圖2A),Padj值<0.05。按log2(fold change)值大小排序,前100位差異基因見(jiàn)圖2B。

圖2 RNA-Seq數(shù)據(jù)分析圖 A:OSE與SE的 DEGs火山圖。紅色點(diǎn)代表上調(diào),綠色點(diǎn)代表下調(diào);B:OSE與SE的前100個(gè)差異基因熱圖;C:OSE與SE差異基因的GO功能富集的氣泡圖;D:OSE與SE差異基因的KEGG Pathway分析;E:OSE與SE差異基因的轉(zhuǎn)錄因子分析熱圖。

2.3GO和KEGG富集分析利用基因本體進(jìn)行了GO分析。GO富集分析包括3個(gè)分支,即生物學(xué)過(guò)程 (biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)。在GO-BP分析中,眼表外胚層上調(diào)的DEGs主要富集在離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)(regulation of ion transmembrane transport)、軸突發(fā)育(axon development)、調(diào)節(jié)化學(xué)突觸傳遞(modulation of chemical synaptic transmission)等相關(guān)生物學(xué)過(guò)程,下調(diào)的DEGs主要富集在核分裂(nuclear division)、染色體分離(chromosome segregation)、細(xì)胞周期相變的調(diào)控(regulation of cell cycle phase transition)等生物學(xué)過(guò)程。在GO-CC分析中,眼表外胚層細(xì)胞上調(diào)的DEGs多定位在神經(jīng)元細(xì)胞體(neuronal cell body)、含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)(collagen-containing extracellular matrix)、突觸膜(synaptic membrane)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)中,下調(diào)DEGs主要定位在染色質(zhì)區(qū)域(chromosomal region)、轉(zhuǎn)軸(spindle)、濃縮染色質(zhì)(condensed chromosome)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。在GO-MF分析中,眼表外胚層細(xì)胞上調(diào)的DEGs富集于信號(hào)受體調(diào)節(jié)活動(dòng)(signaling receptor regulator activity)、信號(hào)受體激活劑活性(signaling receptor activator activity)、受體配體活性(receptor ligand activity)等分子功能,而下調(diào)的DEGs則更多地富集于微管蛋白結(jié)合(tubulin binding)、微管結(jié)合(microtubule binding)、細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)活性(cytoskeletal motor activity)等分子功能(圖2C)。在KEGG分析中,我們篩選了DEGs富集的20條通路(上調(diào)10條、下調(diào)10條),其中可卡因成癮(cocaine addiction)、軸突導(dǎo)向(axon guidance)、苯丙胺成癮(amphetamine addiction)、cAMP 信號(hào)(cAMP signaling pathway)等信號(hào)通路顯著上調(diào),癌癥中的蛋白聚糖(proteoglycans in cancer)、ECM-受體相互作用(ECM-receptor interaction)、蛋白質(zhì)消化和吸收(protein digestion and absorption)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)等信號(hào)通路顯著下調(diào)(圖2D)。

2.4轉(zhuǎn)錄因子分析轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控其他基因的表達(dá)在細(xì)胞表型決定及生物學(xué)功能中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。因此進(jìn)一步分析了眼表外胚層和表面外胚層的差異轉(zhuǎn)錄因子,共篩選了284個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。FOS、EGR1、POU5F1、SOX2以及PAX6等204核心轉(zhuǎn)錄因子在眼表外胚層中高表達(dá),HAND2、HOXB6、HOXB5、HOXA5以及HOXB8等80個(gè)核心轉(zhuǎn)錄因子在表面外胚層中高表達(dá)。在眼表外胚層高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子中,FOS表達(dá)差異最大。圖2E展示了眼表外胚層細(xì)胞相對(duì)于表面外胚層細(xì)胞表達(dá)上調(diào)及下調(diào)的前25位轉(zhuǎn)錄因子。

2.5PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和模塊分析將|log2(fold change)|>2的DEGs輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)以獲取蛋白互作信息,并進(jìn)一步利用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化分析,分別篩選出前6個(gè)Degree值最大的DEGs蛋白,見(jiàn)圖3A。利用Ctoscape Mcode插件篩選DEGs相關(guān)功能模塊基因(包含33個(gè)上調(diào)功能模塊基因、13個(gè)下調(diào)功能模塊基因),見(jiàn)圖3B。發(fā)現(xiàn)上調(diào)功能模塊基因在趨化作用(chemotaxis、taxis)、MAPK級(jí)聯(lián)的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of MAPK cascade)等生物過(guò)程中顯著富集(圖3C),富集于1型糖尿病(type I diabetes mellitus)、炎癥性腸病(inflammatory bowel disease)等信號(hào)通路(圖3D)。

圖3 PPI分析及功能模塊分析圖 A:PPI網(wǎng)絡(luò)圖(差異表達(dá)基因之間的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò), 左為上調(diào),右為下調(diào)); B:功能基因模塊(左為上調(diào),右為下調(diào));C:上調(diào)功能模塊基因GO-BP功能富集的氣泡圖(前十位);D:上調(diào)功能模塊基因KEGG Pathway分析圖(前五位)。

2.6Hub基因的選擇與分析通過(guò)插件cytoHubba的7種算法,在眼表外胚層細(xì)胞上調(diào)和下調(diào)差異基因中分別計(jì)算出了排名前30的Hub基因(表2、3)。用venny進(jìn)行交集后,我們發(fā)現(xiàn)了6個(gè)常見(jiàn)的上調(diào)Hub基因,包括FOS、IL1B、SOX2、IL6、JUN、MMP9,以及9個(gè)常見(jiàn)的下調(diào)Hub基因,包括COL1A1、POSTN、LUM、PDGFRA、VCAM1、IGF1、FGF10、ENG、BDNF?；贕eneMANIA數(shù)據(jù)庫(kù),我們分析了這些基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)和相關(guān)功能,其中上調(diào)Hub基因物理相互作用為48.20%、共表達(dá)為26.40%、預(yù)測(cè)為23.35%、共定位為1.20%、途徑為0.85%,下調(diào)Hub基因共表達(dá)為86.58%、共定位為9.19%、途徑為2.31%、共享蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域?yàn)?.92%,但未富集到已知的生物學(xué)功能(圖4A)。

圖4 Hub基因鑒定及TF-gene、TF-miRNA信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖 A:通過(guò)GeneMANIA分析Hub基因及其共表達(dá)基因圖;B:TF-gene相互作用和TF-miRNA共同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(左側(cè)為上調(diào)基因,右側(cè)為下調(diào)基因)。紅色節(jié)點(diǎn)代表Hub基因,藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表 TF; C:Venny圖(OSE高表達(dá)TF與上調(diào)Hub基因互作TF取交集,篩選共表達(dá)TF);D:共表達(dá)TF熱圖;E:TF-miRNA 共同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(左側(cè)為上調(diào),右側(cè)為下調(diào))。

表2 cytoHubba 中上調(diào)DEGs前 30 個(gè) Hub 基因排名

表3 cytoHubba 中下調(diào)DEGs前 30 個(gè) Hub 基因排名

2.7TF-gene相互作用和TF-miRNA共同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)基于NetworkAnalyst數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)可與Hub基因相互作用的轉(zhuǎn)錄因子,設(shè)置最小網(wǎng)絡(luò)數(shù),然后使用Cytoscape對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化(圖4B)。上調(diào)網(wǎng)絡(luò)包括150 個(gè)節(jié)點(diǎn)和 164個(gè)邊, 其中受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)最多的基因是JUN,共有73個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄過(guò)程。隨后,我們利用Venny將眼表外胚層高表達(dá)TF與上調(diào)Hub基因互作TF取交集,篩選出23個(gè)共表達(dá)TF(圖4C),并制成熱圖見(jiàn)圖4D。下調(diào)網(wǎng)絡(luò)包括69個(gè)節(jié)點(diǎn)和72個(gè)邊,其中受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)最多的基因是COL1A1,共有21個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄過(guò)程。此外,我們還使用NetworkAnalyst構(gòu)建了TF-miRNA共調(diào)控網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)了miRNA、TF和Hub基因之間的相互作用,設(shè)置最小網(wǎng)絡(luò)數(shù),最終篩選出由11個(gè)節(jié)點(diǎn)和24個(gè)邊組成的上調(diào)網(wǎng)絡(luò)圖及由24個(gè)節(jié)點(diǎn)和40個(gè)邊組成的下調(diào)網(wǎng)絡(luò)圖(圖4E)。

3 討論

眼表外胚層屬于表面外胚層,其發(fā)育過(guò)程中受到表面外胚層發(fā)育調(diào)控信號(hào)和來(lái)自神經(jīng)外胚層調(diào)控信號(hào)的雙重調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn),眼表外胚層除了表達(dá)表面外胚層重要轉(zhuǎn)錄因子TP63外,還高表達(dá)神經(jīng)外胚層核心轉(zhuǎn)錄因子PAX6[4],而角結(jié)膜上皮也與表面外胚層來(lái)源的皮膚表現(xiàn)出不同的表型[8]。近年來(lái)已有研究闡明了表面外胚層發(fā)育調(diào)控機(jī)制,而眼表外胚層和角結(jié)膜上皮發(fā)育調(diào)控機(jī)制仍不明確[3, 5]。

隨著干細(xì)胞及眼發(fā)育領(lǐng)域研究的深入,人胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)已被廣泛應(yīng)用于眼部器官發(fā)育的研究,其在眼部發(fā)育調(diào)控機(jī)制及遺傳性眼病治療方案的開(kāi)發(fā)中發(fā)揮重要作用[9-11]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是一種高通量測(cè)序技術(shù),能夠全面、快速地篩選差異表達(dá)基因,研究特定組織的基因表達(dá)情況,目前已成為疾病及胚胎發(fā)育機(jī)理研究不可或缺的技術(shù)手段。本研究通過(guò)對(duì)眼表外胚層和表面外胚層轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,共篩選出4 182個(gè)DEGs, 包含2 771個(gè)上調(diào)基因和1 411個(gè)下調(diào)基因。從轉(zhuǎn)錄組水平闡明了眼表外胚層的轉(zhuǎn)錄組特征,明確了眼表外胚層細(xì)胞高表達(dá)的基因及信號(hào)通路。轉(zhuǎn)錄因子在決定細(xì)胞表型及命運(yùn)中發(fā)揮關(guān)鍵用。既往研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞核心轉(zhuǎn)錄因子PAX6 通過(guò)促進(jìn)角膜上皮標(biāo)記物K3、K12等基因的表達(dá)決定角膜上皮細(xì)胞命運(yùn)[12]。此外,FOS家族的成員(cFos、Fra-1、Fra-2及 FosB)與JUN家族(c-Jun、JunB和JunD)可以結(jié)合形成異二聚體AP1因子,參與調(diào)節(jié)角膜上皮細(xì)胞的分化及維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[13-14],在差異基因分析中,我們發(fā)現(xiàn)PAX6和FOS高表達(dá)于眼表外胚層細(xì)胞。據(jù)此,我們推測(cè)PAX6、FOS可能參與眼表外胚層發(fā)育調(diào)控,但其具體作用及機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。以往研究還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞及干細(xì)胞標(biāo)志物及重要轉(zhuǎn)錄因子SOX2在角膜上皮前體細(xì)胞中與p63共表達(dá),參與角膜上皮細(xì)胞分化調(diào)控[15]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)眼表外胚層細(xì)胞SOX2表達(dá)明顯高于表面外胚層,這與以往研究結(jié)果相一致。另外,在眼表外胚層相對(duì)于表面外胚層高表達(dá)DEGs中,PRDM14表達(dá)量最大,以往研究發(fā)現(xiàn)PRDM14能夠維持干細(xì)胞干性和多能性[16],但其在眼表外胚層中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道,仍待進(jìn)一步研究。

本研究還篩選了決定眼表外胚層和表面外胚層差異的Hub基因,共篩選出了6個(gè)上調(diào)的Hub基因,包括FOS、IL1B、SOX2、IL6、JUN、MMP9,9個(gè)下調(diào)Hub基因,包括COL1A1、POSTN、LUM、PDGFRA、VCAM1、IGF1、FGF10、ENG、BDNF。除FOS、JUN、SOX2外,上調(diào) Hub基因IL1B、IL6、MMP9在外傷、炎癥方面的研究較為深入,既往文獻(xiàn)中提到它們參與角膜上皮損傷愈合過(guò)程,而其在角膜上皮發(fā)育中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道[17-19]。此外,以往研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)Hub基因多參與上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程,在癌癥轉(zhuǎn)移和多種纖維化疾病中發(fā)揮了重要作用[20-21]。

GO分析結(jié)果顯示,眼表外胚層細(xì)胞上調(diào)基因主要與神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān),下調(diào)的DEGs主要與細(xì)胞增殖過(guò)程相關(guān)。在KEGG分析中,我們發(fā)現(xiàn)眼表外胚層上調(diào)DEGs富集在軸突導(dǎo)向(axon guidance)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、cAMP信號(hào)(cAMP signaling pathway)通路等。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)小鼠Gpr48基因缺失通過(guò)cAMP信號(hào)通路導(dǎo)致角膜上皮細(xì)胞增殖和分化不良[22],表明cAMP信號(hào)通路在角膜上皮發(fā)育中發(fā)揮調(diào)控作用。眼表外胚層下調(diào)差異基因主要富集在癌癥中的蛋白聚糖(proteoglycans in cancer)、ECM-受體相互作用(ECM-receptor interaction)、蛋白質(zhì)消化和吸收(protein digestion and absorption)等信號(hào)通路。既往研究表明,下調(diào)通路參與調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程,與下調(diào)Hub基因功能基本相符,但它們?cè)谘郾硗馀邔影l(fā)育中的調(diào)控機(jī)制尚未得到研究[21, 23]。

miRNA是基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,具有通過(guò)抑制信使RNA(mRNA)翻譯或促進(jìn)mRNA降解的作用,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)。本研究中我們利用Hub基因構(gòu)建了TF-miRNA共同調(diào)控網(wǎng)絡(luò),在上調(diào)網(wǎng)絡(luò)中篩選出1個(gè)高相關(guān)miRNA,即has-miR-21。Kalaimani等[24]已在角膜緣干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)has-miR-21-5p高表達(dá),該miRNA可能在角膜上皮細(xì)胞再生中發(fā)揮作用,但其在角膜上皮發(fā)育及再生中的具體通路尚未闡明。在下調(diào)網(wǎng)絡(luò)中,我們篩選出4個(gè)高相關(guān)miRNA,即has-miR-586、has-miR-301、has-miR-181a、has-miR-30e。目前,下調(diào)網(wǎng)絡(luò)中miRNA的研究多見(jiàn)于腫瘤細(xì)胞中,它們通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移來(lái)發(fā)揮致癌基因的作用,但在眼表外胚層及表面外胚層發(fā)育中的作用仍尚不清楚[25-27]。

綜上所述,本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析了人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的眼表外胚層和表面外胚層轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異,篩選了眼表外胚層和表面外胚層差異基因富集的GO terms及信號(hào)通路,并篩選了決定這種表型差異的Hub基因以及相關(guān)的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這可為眼表外胚層及角結(jié)膜上皮發(fā)育調(diào)控機(jī)制研究及角膜上皮相關(guān)遺傳性疾病的防治提供理論參考。我們將在以后的研究中進(jìn)一步探索二者的差異基因及相關(guān)信號(hào)通路在眼表外胚層和表面外胚層發(fā)育調(diào)控中的作用,力爭(zhēng)闡明眼表外胚層發(fā)育調(diào)控信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。