劉運(yùn)超,陳玉梅,楊蘇珍,魏 薔,郝慧芳,柴書軍

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南鄭州 450002)

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)主要引起母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙,已在全世界廣泛流行,給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失[1]。我國豬場PPV感染率可高達(dá)90%以上,該病毒常常與豬瘟病毒(Classical swine fever virus,SCFV)、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、豬偽狂犬病毒(Porcine pseudorabies Virus,PRV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)等混合感染[2]。本文對PPV的病原特征、流行病學(xué)、疫苗研究和防控策略進(jìn)行綜述,為豬細(xì)小病毒病的防控工作提供參考。

1 PPV病原特征

1.1 病毒分類與形態(tài)

PPV屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)、細(xì)小病毒屬(Parvovirus),細(xì)小病毒屬主要包括豬細(xì)小病毒(PPV)、犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus,CPV)、鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus,GPV)、貓泛白細(xì)小病毒(Feline white parvovirus,FPV)、人細(xì)小病毒B19 (Human parvovirus B19)等,各病毒之間具有較高同源性[3-4]。PPV屬于無囊膜病毒,直徑25 nm,由病毒衣殼蛋白和基因組DNA組成,病毒衣殼呈20面體等軸對稱結(jié)構(gòu)[5]。成熟的PPV病毒粒子呈現(xiàn)六角形對稱結(jié)構(gòu),病毒衣殼結(jié)構(gòu)的核心是3種對稱軸:3重軸、5重軸和2重軸,圍繞對稱軸分別形成了“突起”、“峽谷樣”、和“酒窩樣”結(jié)構(gòu),5重軸的頂端處形成有一個(gè)孔道,是病毒基因與外界交流的通道。

1.2 PPV病毒基因組

PPV是自主復(fù)制型、單股負(fù)鏈DNA病毒,基因組全長約5 000 bp?；蚪M兩端各有120～200 bp的回文序列,在3′端形成一個(gè)“Y”形發(fā)卡結(jié)構(gòu),在5′端形成一個(gè)“U”型發(fā)夾結(jié)構(gòu),這兩種發(fā)卡結(jié)構(gòu)與病毒的復(fù)制密切相關(guān)[6]。PPV基因組含有2個(gè)啟動子p4、p38和2個(gè)開放閱讀框(ORF)。p4啟動子在PPV感染細(xì)胞后首先啟動,驅(qū)動R1、R2轉(zhuǎn)錄本的合成和5′端Cap結(jié)構(gòu)的形成,并合成NS1和NS2蛋白。NS1蛋白與啟動子p38結(jié)合,并合成R3轉(zhuǎn)錄本和Cap結(jié)構(gòu),R3轉(zhuǎn)錄本通過選擇性剪接編碼VP1或VP2和SAT蛋白[7]。PPV ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2,大小分別為84 ku和18 ku,這兩個(gè)蛋白均參與了病毒DNA的復(fù)制和調(diào)節(jié)。其中,NS1蛋白參與ATP結(jié)合、水解等酶促反應(yīng),具有解旋酶功能,同時(shí)該蛋白與p38啟動子結(jié)合調(diào)節(jié)病毒DNA轉(zhuǎn)錄。

1.3 PPV衣殼蛋白

ORF2編碼PPV的衣殼蛋白VP1、VP2,蛋白分子量分別為83 ku和64 ku。衣殼蛋白VP1和VP2具有共同的C端氨基酸序列,VP2蛋白由VP1蛋白通過mRNA選擇性剪接而產(chǎn)生[8]。因此,VP1蛋白的N端氨基酸序列與VP2蛋白完全相同,另外包括一段的150aa序列。衣殼蛋白VP3是VP2蛋白翻譯后修飾的產(chǎn)物,由VP2蛋白N端水解約25aa后產(chǎn)生,大小約60 ku。VP1蛋白參與病毒感染,其構(gòu)象結(jié)構(gòu)的改變對PPV的感染具有重要影響。VP2蛋白與受體的識別、病毒吸附、進(jìn)入等關(guān)系密切,且單獨(dú)的VP2蛋白,具有自組裝形成病毒樣顆粒(virus-like particles,VLP)的特性,具有凝血活性,可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)性應(yīng)答[9]。VP3蛋白作為衣殼蛋白的支架,參與VLP的形成和維持病毒的穩(wěn)定性。

VP2蛋白是PPV的主要衣殼蛋白,在病毒衣殼中占60%以上,含有病毒重要的中和抗原表位,是主要的免疫原性蛋白。有人篩選12株識別PPV和PPV VP2蛋白的特異性單克隆抗體,其中6株為識別線性B細(xì)胞表位的單抗,6株為識別構(gòu)象型表位的單抗,且2株構(gòu)象型單抗8E11和10A9具有中和標(biāo)準(zhǔn)毒株P(guān)PV7909的能力,中和效價(jià)可達(dá)到1∶2 048和1∶1 024[10]。該研究對PPV VP2蛋白的線性B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)89ESGVAGQMV97是抗體識別的一個(gè)優(yōu)勢表位。丙氨酸突變研究結(jié)果顯示,89E、90S、91G、92V和94G是參與抗體識別的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。該表位位于病毒衣殼表面,具有較高的抗原指數(shù),但親水性較弱,在91G、92V和93A處容易發(fā)生突變。

2 PPV流行病學(xué)

2.1 PPV的傳播

PPV在全世界廣泛分布,無明顯發(fā)病季節(jié),可感染各品種和年齡段的豬,后備母豬的發(fā)病率高于經(jīng)產(chǎn)母豬。該病的傳染源主要是發(fā)病豬的糞便、分泌物、尸體,發(fā)病公豬的精液,被污染的飼料、水和用具等。PPV在環(huán)境中高度穩(wěn)定,患病豬的豬舍在空置數(shù)月之后仍能引起病毒擴(kuò)散[11]。PPV患病豬的血清、肝、肺、腹股溝淋巴結(jié)、脾和腎臟均可檢測到病毒核酸[12]。豚鼠也是PPV的易感動物,感染病死率可達(dá)100%。

2.2 PPV感染的臨床特征

PPV感染的主要臨床癥狀是初產(chǎn)母豬的流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等,其次是仔豬的腸炎、呼吸道病變等;亞臨床感染與動物的性別和年齡無關(guān),但可在初次感染后5～10 d內(nèi)觀察到中度的、短暫的淋巴細(xì)胞降低[13]。依據(jù)PPV致病力的差異,將PPV毒株劃分為4類[14]:①PPV弱毒株,以NADL-2為代表,口服無法穿過母豬的胎盤屏障,不會形成病毒血癥,是相對安全的弱毒疫苗株;②PPV強(qiáng)毒株,如NADL-8、IAF-76,能穿過胎盤屏障,引起病毒血癥從而導(dǎo)致胎兒感染PPV;③仔豬皮炎型毒株,如Kresse株;④腸炎型毒株,與仔豬的腸道病變密切相關(guān)。

PPV感染通常不能在育肥豬上引起明顯的臨床癥狀,但是胎兒的病變程度和感染結(jié)果取決于母豬感染時(shí)的妊娠日齡和毒株種類。流行病學(xué)研究表明,PPV感染的時(shí)間點(diǎn)位于母豬懷孕日齡70 d之前,會導(dǎo)致母豬生殖失敗;70 d后感染,仍存在胎盤感染的可能性,但胎兒由于受到母源抗體的保護(hù),通常在感染后可存活。懷孕母豬通過自然或口服的途徑初次感染PPV,病毒垂直傳播到胎兒需要12～18 d,而通過肌肉注射病毒感染的時(shí)間則更短[15]。因此,妊娠56 d后母豬感染PPV通常不會對胎兒造成損傷。除了感染時(shí)間,毒株的毒力與胎兒的病變程度密切相關(guān),NADL-2和PPV-IDT等低致病性毒株,不會穿過胎盤屏障,因此不能像高致病性毒株直接檢測到對仔豬的危害或者危害較小?？诜﨨ADL-2毒株無毒性,但直接注入到子宮內(nèi)會導(dǎo)致胎兒死亡[16]。目前,PPV如何通過胎盤屏障的機(jī)制尚不清楚,初步分析可能是巨噬細(xì)胞穿過豬上皮絨毛膜后經(jīng)胎盤感染胎兒。

3 PPV疫苗

3.1 PPV滅活疫苗

2010年至今我國共批準(zhǔn)6個(gè)PPV疫苗的新獸藥注冊申請,全部是滅活疫苗。PPV滅活疫苗是由非致病性PPV毒株經(jīng)福爾馬林、β-丙內(nèi)酯和N-乙酰乙烯亞胺(N-acetyl ethylenimine,AEI)等進(jìn)行滅活處理后,與佐劑乳化后制備而成。PPV滅活疫苗具有特異性抗體水平高、免疫效果好、容易保存和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn),但病毒培養(yǎng)周期長、對生產(chǎn)場地和設(shè)備要求較高。用AEI滅活PPV L毒株病毒,終濃度為0.02%的AEI溶液、在30 ℃條件下滅活72 h為最佳條件[17]。對PPV L毒株經(jīng)AEI滅活后制備疫苗的穩(wěn)定性進(jìn)行研究,疫苗在2～8℃環(huán)境中保存24個(gè)月,免疫豚鼠進(jìn)行效力檢測,血凝抑制(HI)效價(jià)不低于1∶64[18]。 PPV滅活疫苗雖然可誘導(dǎo)靶動物豬產(chǎn)生有效的抗體,預(yù)防母豬及仔豬免受同源或異源PPV的感染,但不能有效阻止或降低病毒的脫落,使豬群長期處于帶毒狀態(tài)。

3.2 PPV弱毒疫苗

用無致病力的PPV弱毒株或毒力致弱的強(qiáng)毒株制備的疫苗,弱毒疫苗具有免疫效力強(qiáng)、產(chǎn)生抗體快,但是不易保存、存在毒力返強(qiáng)等生物安全風(fēng)險(xiǎn)。臨床上曾使用的PPV弱毒株為NADL-2株,該毒株是經(jīng)54次傳代后制備而成,該毒株注入豬體后,不會使母豬產(chǎn)生病毒血癥,只有直接注射到母豬子宮中才會造成胎兒感染;不同的給藥途徑會影響病毒的增殖,直接肌肉注射,PPV會在母豬體內(nèi)增殖,而口服NADL-2弱毒疫苗,不會出現(xiàn)病毒增殖的現(xiàn)象。弱毒疫苗曾經(jīng)在PPV的防控中發(fā)揮重要作用,但近年來隨著疫苗技術(shù)的發(fā)展逐漸被滅活疫苗取代。

3.3 PPV VLP疫苗

2016年至今,國內(nèi)已有6個(gè)PPV VLP疫苗獲得臨床試驗(yàn),VLP疫苗是由病毒的一種或多種衣殼蛋白自行組裝的空衣殼,具有病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu),但是缺乏感染所需的核酸,可誘導(dǎo)高水平的體液免疫應(yīng)答。通過引入伴侶蛋白Tf2,將Tf2與VP2在大腸埃希氏菌中共表達(dá),正確折疊的VP2蛋白可形成VLP,可誘導(dǎo)小鼠和豚鼠產(chǎn)生特異性PPV的抗體,刺激IL-4、IFN-γ的分泌,并可有效降低豚鼠的帶毒量,保護(hù)豚鼠免受PPV的感染[19]。大腸埃希氏菌蛋白表達(dá)系統(tǒng)蛋白表達(dá)量高、操作簡單、生產(chǎn)成本低,是制備PPV亞單位疫苗的首要選擇。

VLP的組裝效率和穩(wěn)定性對VLP疫苗的免疫效果影響巨大。用截短突變和定點(diǎn)突變對影響PPV VLP組裝的關(guān)鍵氨基酸和中間體形態(tài)進(jìn)行研究[20]。結(jié)果顯示,VP2蛋白N端前47個(gè)氨基酸的缺失對VLP的組裝沒有影響,第48天冬酰胺(Asn,N)的缺失則使VP2蛋白喪失自組裝能力。定點(diǎn)突變的結(jié)果發(fā)現(xiàn),N47K降低了PPV VLP的組裝效率,而N48K對PPV衣殼的穩(wěn)定性、HA活性和自組裝特性產(chǎn)生破壞性影響。蔗糖密度梯度離心的結(jié)果發(fā)現(xiàn),關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的缺失或突變會影響或破壞與PPV VLP組裝密切相關(guān)的中間體的形成。Native PAGE的研究結(jié)果進(jìn)一步表明,N48K不會影響VP2蛋白低聚物的形成,但是破壞了低聚物組裝成大分子聚合物的能力。重組PPV VLP疫苗具有免疫保護(hù)效果好、生產(chǎn)成本低、生物安全性高等優(yōu)勢,成為PPV新型疫苗的研究熱點(diǎn)。

3.4 核酸疫苗

核酸疫苗是將編碼某種抗原的外源DNA或RNA直接接種到動物體內(nèi),依靠動物自身的表達(dá)系統(tǒng)對抗原進(jìn)行表達(dá)并誘發(fā)特異性的免疫應(yīng)答。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將IBRS-2細(xì)胞中表達(dá)的PPV VP2免疫小鼠,14 d的小鼠血清中可檢測到PPV特異性抗體,且未從小鼠的心、肝、脾、肺、腎和腦等組織DNA中擴(kuò)增到VP2基因。用HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組含有PCV的T細(xì)胞表位和PPV VP2基因的pcDNA3.1質(zhì)粒,確定表達(dá)后以10 μg/只進(jìn)行免疫,小鼠可產(chǎn)生針對PCV和PPV的特異性抗體,且促進(jìn)了小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖。隨著新型冠狀病毒肺炎mRNA疫苗的成功和和核酸疫苗遞送技術(shù)的進(jìn)步,動物用核酸疫苗的研究也逐漸成為熱點(diǎn)。

4 PPV感染的防控

4.1 PPV檢測

檢測PPV抗原抗體的方法有病原學(xué)檢測、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷等[21]。當(dāng)豬場內(nèi)初產(chǎn)母豬出現(xiàn)多次發(fā)情、延遲分娩且伴隨著木乃伊胎兒和產(chǎn)仔量減少時(shí),需要及時(shí)開展PPV檢測。分離提取病毒DNA檢測PPV的早期感染,但操作復(fù)雜、易受病毒感染時(shí)間和毒力的干擾,臨床上應(yīng)用較少[22]。血清學(xué)診斷包括檢測PPV抗體的血凝抑制試驗(yàn)(hemagglutination inhibition,HI)、病毒中和試驗(yàn)(virus neutralization test,VN)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA);檢測抗原的血凝試驗(yàn)(hemagglutination,HA)、間接免疫熒光技術(shù)(indirect immunoinfluscent assay,IFA)等[23]。其中,HA和IFA是實(shí)驗(yàn)室最常用的檢測PPV方法,首先用HA對PPV進(jìn)行初步檢測,其次應(yīng)用IFA確定病毒的感染。HI、VN和ELISA等可用于血清樣品中PPV抗體的檢測。HI是基層獸醫(yī)人員檢測PPV抗體最經(jīng)典的方法,但無法區(qū)分免疫豬群和PPV野毒株感染的豬群;ELISA是最常用的檢測血清樣品中PPV抗體的方法,靈敏度高,同時(shí)可區(qū)分滅活疫苗免疫豬群和PPV野毒株感染的豬群[24];VN檢測需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),相對繁瑣,常用于實(shí)驗(yàn)室研究。分子生物學(xué)診斷包括常規(guī)的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測、核酸探針技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)等。通過分析PPV的序列,找到其保守區(qū)域后設(shè)計(jì)引物,建立穩(wěn)定的、靈敏的PCR、實(shí)時(shí)熒光定量(real-time PCR)檢測方法。

4.2 生物安全

豬場應(yīng)堅(jiān)持自繁自養(yǎng)的原則,需要引進(jìn)種豬時(shí),應(yīng)從具有《種畜禽生產(chǎn)經(jīng)營許可證》的種豬場引進(jìn)。種豬到場后,隔離飼養(yǎng)40～60 d,按既定程序進(jìn)行免疫接種,確定無疫病后方可混群飼養(yǎng)。重視豬的飼養(yǎng)環(huán)境管理工作,對豬的飲食環(huán)境定期消毒, 防止病原微生物流行。盡量避免外來人員及車輛進(jìn)入場區(qū),需要進(jìn)入的外部車輛和人員應(yīng)嚴(yán)格遵守消毒管理規(guī)則,清洗消毒后方可進(jìn)入。飼養(yǎng)人員實(shí)行封閉管理模式,不接觸或食用外部新鮮豬肉及豬肉制品。

5 小結(jié)與展望

豬細(xì)小病毒主要引起繁殖障礙,是危害養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)的一大難題。豬細(xì)小病毒病沒有特效的治療措施,只能靠疫苗接種來防控。因此,要重視日常管理,適時(shí)接種疫苗,發(fā)現(xiàn)病例要及時(shí)隔離消毒,切斷病毒傳播途徑。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展,PPV新型疫苗研制已經(jīng)取得了很大進(jìn)展,將來必將研制出安全、高效、廉價(jià)的新型基因工程疫苗。