黃貝旭 劉昶 梁嫩 廖松潔

施萬細胞是周圍神經(jīng)的膠質細胞，是維持神經(jīng)正常功能的重要組分，在周圍神經(jīng)損傷修復和神經(jīng)病理性疼痛過程中起關鍵性作用。研究表明，施萬細胞所形成的完整髓鞘促進軸索再生并抑制神經(jīng)纖維異位放電[1-2]，創(chuàng)造適合神經(jīng)修復的微環(huán)境，清除含軸索生長抑制物的自身髓鞘，并產(chǎn)生促紅細胞生成素等保護性物質和抑制腫瘤壞死因子等，從而可促進痛性周圍神經(jīng)病的恢復[3-4]。并且，施萬細胞幫助建立神經(jīng)軸索與微血管的聯(lián)系[5]。但是，施萬細胞變性、功能異常可激活炎癥因子，加劇神經(jīng)元軸索退化；炎性反應過度的情況下，施萬細胞可進一步產(chǎn)生炎性介質和趨化因子，向遠端存留或再生的軸索及近端背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元滲透，誘導外周敏化[6]。可見，維持施萬細胞的正常功能可作為周圍神經(jīng)損傷的治療靶點，保護施萬細胞也是減輕神經(jīng)病理性疼痛發(fā)展和慢性化的重要機制[7-9]。哺乳動物Ste20 樣激酶2（mammalian ste20-like kinase 2, MST2）是Hippo 生長抑制通路中關鍵的絲氨酸/蘇氨酸激酶之一，在調控細胞凋亡、增殖和分化中起重要作用[10]。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，敲低MST2的同源類似物可改善神經(jīng)損傷誘導的神經(jīng)病理性疼痛，并且逆轉施萬細胞的線粒體功能障礙[11]，但是調控的具體機制尚不清楚。為了開展進一步的機制研究，本實驗擬構建工具細胞，即使用第二代慢病毒包裝系統(tǒng)，構建穩(wěn)定敲低及過表達MST2的大鼠施萬細胞系，檢測基因干預MST2的效率及對于線粒體膜電位的影響，為研究MST2 在施萬細胞的調控作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 穩(wěn)轉株的構建采用大鼠施萬細胞株（RSC96），慢病毒包裝采用人胚腎細胞株（HEK293 T），均來源于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。敲低Mst2基因的慢病毒重組質粒、第二代慢病毒系統(tǒng)包裝質粒pSPAX2和pMD2.G、感受態(tài)大腸桿菌（貨號：TSC-C06）、Polybrene 及相關引物購自北京擎科生物科技股份有限公司。過表達慢病毒載體GV341 及相應慢病毒包裝質粒pHelper 1.0 和pHelper 2.0、吉凱轉染試劑由上海吉凱基因化學技術有限公司提供。限制性核酸內切酶AgeI/NheI（貨號：R3552S；R3131V）來源于New England Biolabs公司。反轉錄試劑盒（貨號：A233）、超保真PCR 預混液（貨號：A064）、無縫克隆試劑盒（貨號：T196）及膠回收試劑盒（貨號：D205）均購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司。重組質粒測序由廣州易錦生物技術有限公司完成。

1.2 實驗分組 本實驗細胞株分為6 組：對照（control，CON）組，即正常對照組；氧糖剝奪（oxygen and glucose deprivation，OGD）組，即氧糖剝奪模型組；sh-NC 組，即MST2 敲低對照組；sh-MST2 組，即MST2 敲低組；p-NC 組，即MST2 過表達對照組；p-MST2 組，即MST2 過表達組。每組實驗重復4～6次。

1.3 方法

1.3.1 引物設計 根據(jù)NCBI 基因數(shù)據(jù)庫上大鼠Mst2基因全長序列（NM_031735），以及GV341載體多克隆酶切位點AgeI/NheI進行引物設計：Primer F，5'CCAACTTTGTGCCAACCGGTCGCCACCATGGAGC AGCCGCCGGCGCC 3'，Primer R，5' AATGCCAACT CTGAGCTTGAAATTCTGCTGCCTCCTCTTTTTG 3'。引物包含無縫克隆交換配對堿基位點、酶切位點，并包含目的基因5'端部分序列用于與目的模板配對。

1.3.2 逆轉錄PCR 擴增大鼠施萬細胞Mst2全基因序列 使用TRIzol 法提取施萬細胞總mRNA，并取1 μg 反轉錄為cDNA。以cDNA 為模板，使用上述引物進行大鼠Mst2全長序列擴增（PCR 儀，德國Biometra公司）。PCR擴增條件：98 ℃預變性3 min，98 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，35 個循環(huán)反應，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。將反應產(chǎn)物進行DNA 聚丙烯酰胺凝膠電泳，對相應片段進行凝膠回收，即獲得含有無縫克隆堿基位點、AgeI/NheI 酶切位點和Mst2全基因序列的DNA產(chǎn)物。

1.3.3 大鼠施萬細胞過表達Mst2重組質粒構建及鑒定 使用限制性核酸內切酶AgeI/NheI 酶進行GV341 載體線性化，以Mst2DNA 產(chǎn)物∶線性化載體摩爾比為3∶1 的比例配制無縫克隆反應體系，混勻后于PCR 儀中50 ℃反應15 min，反應結束后置于冰上，即可獲得Mst2過表達重組質粒。將重組質粒轉化感受態(tài)大腸桿菌，進行原核抗生素篩選，挑取單克隆菌落搖菌擴增，提取質粒后進行PCR 鑒定，鑒定引物為Primer F，5' TGGACTACTTTGATAAGC AG 3'，Primer R，5' CCTTATAGTCCTTATCATCGT C 3'，將產(chǎn)物進行DNA 凝膠電泳，并挑選陽性轉化子的重組質粒送測序。

1.3.4 慢病毒包裝及獲取 慢病毒包裝細胞HEK293T 均勻種于含有10% FBS DMEM 雙抗培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)皿。敲低Mst2基因的慢病毒重組質粒是由特異性敲低Mst2的短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA, sh-RNA）與慢病毒載體pLKO.1-PURO 重組合成，序列為5' GCAAGTACCTGTTGAGTCA 3'。敲低MST2 慢病毒生成轉染體系，即按目標質?！胮SPAX∶pMD2.G為4∶3∶1的比例在無血清培養(yǎng)基中與3 倍于質?？傎|量的聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）混合，室溫靜置20 min 后轉染HEK293T細胞。過表達MST2 慢病毒生成轉染體系，即按目標質?！胮Helper 1.0∶pHelper 2.0 為4∶3∶2 的比例與吉凱轉染試劑混勻，室溫孵育15 min后緩慢滴加至HEK293T 細胞培養(yǎng)基中。分別于48 h、72 h、96 h收取病毒上清液，同時更換新鮮培養(yǎng)基，并將收取后的上清液置于4 ℃冰箱保存。使用0.45 μm 濾器過濾收集的上清液，并加入5×慢病毒濃縮液4 ℃過夜，次日超速離心濃縮病毒，使用無菌PBS 稀釋病毒沉淀后分裝為每管50 μL，-80 ℃保存。根據(jù)以上步驟可獲取敲低及過表達MST2的慢病毒毒液。

1.3.5 敲低及過表達MST2 的施萬細胞穩(wěn)轉株的建立 大鼠施萬細胞培養(yǎng)于10% FBS DMEM 雙抗完全培養(yǎng)基，待細胞生長至60%～70%密度時將培養(yǎng)基更換為含有敲低或過表達MST2慢病毒毒液的完全培養(yǎng)基，并使用相應空載慢病毒毒液作為對照，同時加入Polybrene 增加病毒感染效率，使其終濃度為8 mg/L，輕輕搖勻后置于37 ℃、5% CO2的孵箱中過夜培養(yǎng)。次日更換為普通完全培養(yǎng)基，待細胞密度生長至80%～90%時，按（1∶2）～（1∶3）傳代。將慢病毒感染后48～72 h 的細胞培養(yǎng)于含有2.5 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基中，篩選3～5 d后，未感染慢病毒組細胞全部死亡，即可認為感染病毒組剩下的全是穩(wěn)轉株細胞，并將其標記為第一代基因干預的施萬細胞穩(wěn)轉株，進一步進行MST2 的敲低及過表達鑒定。

1.3.6 實時熒光定量PCR 檢測Mst2基因 使用TRIzol 法提取細胞總mRNA，并取1 μg 進行反轉錄反應，以SYBR GREEN（貨號：K21203，Abclonal）作為染料按說明書配制qPCR 反應體系，于實時熒光定量PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）中進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR），反應條件為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，進行40 個循環(huán)反應，最后測定解鏈曲線。所用引物序列為Mst2Primer F，5' AGGAACAGCAACGAGA ATTGG 3'，Mst2Primer R，5' CCCCTTCACTCATCG TGCTT 3'；β-actinPrimer F，5' ATTGCTGACAGGA TGCAGAA 3'，β-actinPrimer R，5' TAGAGCCACC AATCCACACAG 3'。以β-actin作為內參，使用2-△△Ct法計算結果并進行統(tǒng)計分析。

1.3.7 蛋白印記（western blot，WB）檢測MST2 使用RIPA 蛋白裂解液（貨號：89900，美國Thermo Fisher Scientific 公司）提取細胞蛋白，測定蛋白濃度后加入loading buffer 置于100 ℃水浴10 min 使蛋白充分變性。取20 μg 蛋白進行凝膠電泳，并進行充分轉膜，結束后使用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后加入相應一抗4 ℃孵育過夜（MST2, 1∶10000；β-actin,1∶20000）。次日使用含有吐溫20 的Tris 緩沖鹽溶液洗滌3 次，每次10 min，加入HRP 偶聯(lián)的二抗（1:3000），室溫孵育1 h，充分洗膜后于化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)（美國GE 公司）曝光。使用Image J 軟件（美國）按照條帶灰度值進行定量分析。

1.3.8 OGD模型的建立 使用PBS潤洗細胞2次，并將培養(yǎng)基更換為無糖培養(yǎng)基。將培養(yǎng)皿放于提前紫外消毒過夜的無氧罐中，并在罐中置入1 顆氧氣指示劑及鈀粒。抽走其中的氣體，并充入90% N2、5% CO2和5% H2的混合氣體，重復循環(huán)3 次。使用75%乙醇溶液消毒無氧罐后放入培養(yǎng)箱中孵育5～6 h，結束后即可進行下一步實驗。

1.3.9 線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential， MMP）檢測 使用檢測試劑盒（JC-1，貨號：C2006，上海碧云天生物技術股份有限公司）檢測細胞MMP。MMP 較高時，JC-1 形成聚合物發(fā)出紅色熒光；反之，JC-1 為單體發(fā)出綠色熒光。按照說明書提前配制1×JC-1 染色緩沖液及1×JC-1 染色工作液。將細胞接種于培養(yǎng)皿或細胞爬片并按實驗分組對細胞進行OGD處理后，使用PBS清洗細胞2次，加入適量1×JC-1染色工作液37 ℃避光孵育20 min，結束后使用1×JC-1染色緩沖液洗滌2次，并加入適量的完全培養(yǎng)基，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。每組細胞取9個視野（200×），使用Image J軟件分析每張照片平均熒光強度，取平均值，聚合物熒光強度/單體熒光強度即為MMP，比值降低提示異常。

1.4 統(tǒng)計學方法 使用GraphPad Prism 9.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結果采用平均值±標準誤描述。兩組之間各結果比較用兩獨立樣本t檢驗；多組間各結果比較用單因素方差分析，采用Turkey's 檢驗進行兩兩比較。檢驗水準α=0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 過表達Mst2的慢病毒表達載體構建及鑒定本研究利用特異性引物擴增出了大小約1500 bp的目的基因條帶，與預期的大鼠Mst2基因全長序列片段大小一致（圖1 A）。將該基因條帶切膠回收并連接至GV341 載體中，構建重組質粒。通過PCR 法對重組質粒進行鑒定，并進行DNA 凝膠電泳，結果顯示Mst2基因的特異性引物可產(chǎn)生約370 bp 的產(chǎn)物（圖1 B）。將陽性轉化子的重組質粒進行測序，測序結果與預期的Mst2基因序列完全相同。

Fig.1 Construction and identification of lentiviral expression vector overexpressing Mst2圖1 過表達Mst2 的慢病毒表達載體構建及鑒定 A. DNA 凝膠電泳獲取大鼠Mst2基因全長序列片段，約1500 bp。B. PCR 法結合凝膠電泳鑒定重組質粒，可見約370 bp的Mst2特異性基因片段。

2.2 穩(wěn)轉細胞株具備施萬細胞的特征 培養(yǎng)施萬細胞并構建MST2敲低和過表達穩(wěn)轉株。通過光鏡觀察施萬細胞穩(wěn)轉株，可見細胞生長形態(tài)為神經(jīng)元樣長梭形，貼壁生長，細胞大小及形態(tài)與未干預的施萬細胞相同。S100 作為施萬細胞的特異性標記蛋白，是細胞鑒定的可靠指標。MST2 敲低及過表達穩(wěn)轉株可于胞質內正常表達S100，表明穩(wěn)轉株未受到其他細胞株污染，并保持施萬細胞的特征（圖2）。

Fig.2 Knockdown and overexpression of MST2 do not alter Schwann cell morphology圖2 敲低及過表達MST2 不改變施萬細胞形態(tài) 光鏡：Brightfield，200×；綠色熒光：S100，200×。標尺=100 μm，n=4/組。CON，正常對照組；sh-MST2，MST2敲低組；p-MST2，MST2過表達組。

2.3 成功構建敲低及過表達MST2 的施萬細胞穩(wěn)轉株 qRT-PCR 結果表明，相對于敲低及過表達各自病毒的對照，MST2 成功被敲低及過表達（P＜0.0001），敲低效率為對照的90%以上，過表達為其對照的大約40 倍（圖3 A）。進一步進行WB 檢測，與qRT-PCR 結果一致，MST2 均成功被敲低及過表達（P＜0.0001）（圖3 C、E）。將細胞繼續(xù)培養(yǎng)5 代，使用qRT-PCR及WB方法檢測基因干預的穩(wěn)定性。結果顯示，相對于對照組，施萬細胞敲低及過表達MST2 的效果仍然顯著（P＜0.0001）（圖3 B、D、F）。以上結果表明成功構建了敲低及過表達MST2的施萬細胞穩(wěn)轉株。

Fig.3 Rat Schwann cell lines that stably knock down and overexpress MST2 were successfully constructed圖3 成功構建敲低及過表達MST2的施萬細胞穩(wěn)轉株 A～B. qRT-PCR 技術分別檢測第一代及第五代施萬細胞穩(wěn)轉株Mst2 mRNA 表達水平。C～D. WB技術分別檢測第一代及第五代施萬細胞穩(wěn)轉株MST2蛋白水平，β-actin作為參照。E～F. 第一代及第五代施萬細胞穩(wěn)轉株MST2蛋白表達水平灰度值量化分析結果。****P＜0.0001，每組n=4。sh-NC，MST2 敲低對照組；sh-MST2，MST2 敲低組；p-NC，MST2 過表達對照組；p-MST2，MST2過表達組。

2.4 施萬細胞穩(wěn)轉株在OGD 模型中穩(wěn)定表達MST2 培養(yǎng)的施萬細胞經(jīng)OGD處理6 h后，通過光鏡觀察其形態(tài)學變化，可見OGD 組施萬細胞突觸消失，細胞由雙極樣轉變?yōu)閳A形，同時胞質內顆粒度增加，表明OGD 可損傷施萬細胞（圖4 A）。WB檢測發(fā)現(xiàn)，OGD 組MST2 蛋白水平增高（P＜0.05）。在Mst2基因敲低的施萬細胞穩(wěn)轉株，MST2 蛋白水平顯著下降（P＜0.001）；而在基因過表達穩(wěn)轉株，MST2 蛋白水平顯著上調（P＜0.001）（圖4 B），表明該穩(wěn)轉株可穩(wěn)定應用于OGD病理模型。

Fig.4 The MST2 level of the stably transfected Schwann cell lines in OGD model圖4 施萬細胞穩(wěn)轉株在OGD 模型中的MST2 蛋白水平 A. OGD處理施萬細胞后形態(tài)學改變。光鏡：Bright-field，200×。B. WB 技術檢測OGD 處理6 h 后施萬細胞穩(wěn)轉株的MST2 蛋白表達水平，β-actin 作為參照。C. MST2 表達水平灰度值量化分析結果，*P＜0.05，***P＜0.001，每組n=4。CON，正常對照組；OGD，氧糖剝奪模型組；sh-NC，MST2 敲低對照組；sh-MST2，MST2 敲低組；p-NC，MST2過表達對照組；p-MST2，MST2過表達組。

2.5 OGD 模型中MST2 參與線粒體膜電位的調控使用JC-1探針裝載施萬細胞，以檢測MMP，在熒光顯微鏡下拍照分析。結果顯示，OGD導致紅綠熒光比值明顯下降，證實MMP 受損（P＜0.001）；而MST2敲低后，紅綠熒光比值顯著回升，提示逆轉了OGD導致的MMP 損傷（P＜0.001）。但是，與p-NC 對照組相比，過表達MST2對已受損MMP 的影響并無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖5）。上述結果表明，MST2參與施萬細胞線粒體膜電位的調控，敲低MST2 可以起保護作用。

Fig.5 MST2 participates in the regulation of mitochondrial membrane potential圖5 MST2 參與線粒體膜電位的調控 A. 使用JC-1 探針標記線粒體膜電位。紅色熒光，多聚體（J-aggregates），200×；綠色熒光為單體（Jmonomers），200×。標尺=100 μm。B. 紅綠平均熒光強度比值量化分析結果，*** P＜0.001，nsP＞0.05，每組n=6。CON，正常對照組；OGD，氧糖剝奪模型組；sh-NC，MST2敲低對照組；sh-MST2，MST2敲低組；p-NC，MST2過表達對照組；p-MST2，MST2過表達組。

3 討論

本研究構建重組質粒，并使用第二代慢病毒包裝系統(tǒng)成功構建穩(wěn)定敲低及過表達MST2的大鼠施萬細胞株；將該細胞株應用在OGD 模型中，敲低MST2 可改善線粒體膜電位，提示其對線粒體具有保護作用。

對比其他研究應用的小干擾RNA 敲低或普通質粒載體過表達目的基因的方法，慢病毒能將外源基因整合至宿主細胞，從而在細胞中穩(wěn)定長期表達，且不會產(chǎn)生化學轉染引起的細胞損傷。同時，在過表達基因中加入標簽序列，可使用高濃度且價格優(yōu)惠的標簽抗體進行實驗，提高檢測的陽性率[12-15]。目前，慢病毒實驗系統(tǒng)已廣泛用于分子實驗的研究中。由于感染慢病毒的細胞在未使用相應抗生素時，有逐漸被正常細胞取代而丟失基因干預效果的可能性，故本研究采用了合適濃度的嘌呤霉素維持篩選流程，并在感染慢病毒第一代及第五代的施萬細胞中，從mRNA 及蛋白水平雙重驗證了基因干預MST2 的穩(wěn)定性。值得注意的是，WB 技術檢測過表達MST2 的穩(wěn)轉株可見MST2 雙條帶，這與添加了蛋白標簽的外源性MST2 有關。S100在神經(jīng)系統(tǒng)中主要表達于施萬細胞，可作為細胞鑒定的特異性指標[16]。本研究通過S100 免疫熒光證明了MST2敲低及過表達穩(wěn)轉株仍保持施萬細胞的特征。

在成功構建穩(wěn)轉株的基礎上，本研究對施萬細胞進行OGD 處理。OGD 是研究線粒體穩(wěn)態(tài)方向較為理想的細胞模型，可模擬體內因缺血缺氧引起的神經(jīng)損傷。多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究以OGD 作為細胞模型可一定程度上模擬體內環(huán)境，如腦血管疾病、神經(jīng)壓迫性損傷等[11,17]。本研究結果證實，OGD可以損傷施萬細胞。在OGD 處理的施萬細胞穩(wěn)轉株，基因敲低組MST2蛋白水平顯著下降，而基因過表達組MST2 蛋白水平顯著上調，表明基因干預MST2的效果仍然穩(wěn)固。

利用施萬細胞穩(wěn)轉株這一工具細胞建立OGD模型，本研究進一步進行線粒體功能指標檢測，初步探討MST2對于線粒體的作用。線粒體是細胞能量來源的核心，參與細胞代謝、鈣離子穩(wěn)態(tài)、細胞凋亡調控及脂質合成等過程[18]。正常的MMP 是線粒體氧化磷酸化穩(wěn)態(tài)的重要前提，MMP 的丟失可導致電子從線粒體呼吸鏈外溢，引起活性氧大量生成[19]。因此，MMP是反映線粒體功能的可靠指標之一[19]。既往關于MST2 在線粒體功能上的研究結論尚不一致，與細胞類型不同有關。在脂肪細胞中，MST2 可過度激活線粒體自噬，導致線粒體丟失和功能障礙[20]；但在巨噬細胞中，MST2 可募集至受損線粒體，增加細胞內抗氧化蛋白的穩(wěn)定性而減輕細胞內過度的氧化應激反應[21]。在本研究的施萬細胞中，MST2 參與MMP 的調控，敲低MST2 可以改善OGD 誘導的MMP損傷，提示具有保護線粒體作用。但在過表達MST2 的施萬細胞中，MMP 沒有明顯改變，推測OGD條件下MMP已明顯受損，進一步上調MST2 并不能帶來顯著改變；此外，在OGD 條件下，MST2的功能可能已經(jīng)達到飽和狀態(tài)，上調MST2并不能增加其發(fā)揮功能的效果。以往研究表明，MST2 在自噬及線粒體自噬中發(fā)揮重要作用[10,20,22-24]。本課題組既往研究也發(fā)現(xiàn)，敲低MST2同源類似物可改善線粒體自噬、減少氧化應激，并保護線粒體功能[11]。故推測MST2 調控施萬細胞MMP 的作用可能與自噬或線粒體自噬有關，這仍需進一步實驗驗證。

綜上，本研究成功構建穩(wěn)定敲低及過表達MST2 的大鼠施萬細胞株，并對其在調控線粒體膜電位方面進行了初步研究。未來研究將利用成功構建的細胞株進一步探究MST2在線粒體功能及神經(jīng)病理性疼痛等疾病模型中的作用。