瑪依奴爾·阿塔吾拉, 吳 龍,2, 阿爾曼·阿卜力孜, 趙 今,2

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 (附屬口腔醫(yī)院) 牙體牙髓病科; 2新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所, 烏魯木齊 830054)

齲病是最常見的口腔疾病,可影響兒童、青少年、成人以及老年人所有年齡段人群的口腔健康及生活質(zhì)量[1-4]。變異鏈球菌(Streptococcusmutans,S.mutans)是口腔致齲的主要病原菌, 在齲齒的發(fā)生和發(fā)展中起著核心作用,因此抑制S.mutans及菌斑生物膜的形成對(duì)于預(yù)防齲齒,促進(jìn)口腔健康至關(guān)重要[5-6]。天然藥物及其提取物已成為預(yù)防治療口腔疾病的研究熱點(diǎn)[7], 目前已被證實(shí)含有防齲成分的天然藥物包括厚補(bǔ)、 蜂膠、 苦參等[8-9]。桑白皮(MoriCortex)別名桑根皮、桑根白皮、桑皮等,用藥歷史悠久,本課題組前期體外研究發(fā)現(xiàn)新疆桑白皮提取物能夠抑制主要致齲細(xì)菌浮游狀態(tài)下的生長(zhǎng)、產(chǎn)酸、產(chǎn)糖及黏附能力,還對(duì)生物膜的形成有一定的抑制作用[10]。本研究采用齲病動(dòng)物模型評(píng)估新疆桑白皮提取物防齲作用的有效性及安全性,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)(上海博迅科技有限公司);MCO-15AC 37℃恒溫培養(yǎng)箱(日本三洋公司);TCS-SP8激光共聚焦熒光顯微鏡 (德國徠卡公司);新疆桑白皮藥材(由新疆醫(yī)科大學(xué)天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供, 經(jīng)鑒定符合《中華人民共和國藥典》2020版規(guī)定); 氯己定 (Chlorhexidine,CHX, 上海源葉生物科技有限公司, 55-56-1);紫脲酸銨(上海源葉生物科技有限公司, 3051-09-0);羅丹明 B(索萊寶生物科技有限公司,81-88-9)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物42只21 d 齡雄性SPF-SD大鼠,購自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,本研究通過新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(批號(hào): IACUC-20230627-12)。

1.3 致齲菌及培養(yǎng)基變異鏈球菌(Streptococcusmutans,S.mutans,廣東省微生物培養(yǎng)中心,UA159);腦心浸液培養(yǎng)基(Brain-Heart Infusion, BHI,北京索萊寶科技有限公司, 315G032); 輕唾桿菌肽瓊脂(Mitis Salivarius Bacitricin Agar, MSBA,山東拓普生物工程有限公司, M0740)。

1.4 新疆桑白皮提取物及S.mutans菌懸液的制備取新疆桑白皮藥材適量粉碎過60目篩,按照料液比1∶10(g/mL)用80%乙醇回流提取3次,合并濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并冷凍干燥(-80℃),得到粉末,粉末用含1%DMSO的BHI培養(yǎng)基配制濃度為16 g/L的母液,經(jīng)無菌濾器過濾除菌,按倍比稀釋法將母液用蒸餾水分別稀釋至1.0、0.5、0.25 g/L,置于4℃環(huán)境備用。選取S.mutans凍存菌株接種于BHI培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)48 h。觀察菌落生長(zhǎng)形態(tài),隨機(jī)取單個(gè)菌落涂片鏡檢,無污染且生化鑒定為純培養(yǎng)后,相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48 h,取形態(tài)一致的菌落溶于BHI液體培養(yǎng)基,采用麥?zhǔn)媳葷岱?biāo)定菌懸液濃度至1×106CFU/mL。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 實(shí)驗(yàn)分組 取42只21 d 齡雄性SPF-SD大鼠,采用隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)分為6組:新疆桑白皮提取物高、中、低劑量組(1.00、0.50、0.25 g/L新疆桑白皮提取物),陽性對(duì)照組(0.12%的氯己定,CHX組);陰性對(duì)照組(無菌蒸餾水,CA組);空白對(duì)照組(不建模不干預(yù),Control組)。飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心,標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境,給予12 h 的光/暗循環(huán)。

1.5.2 齲齒動(dòng)物模型的建立 參照符合國際Keyes齲病動(dòng)物模型標(biāo)準(zhǔn),除Control組其他5組于鼠齡22～24 d進(jìn)行內(nèi)源性抑菌,飼以均勻混有氨芐西林鈉(每2 g配1 000 g普通飼料)的飼料,含青霉素鉀(80萬單位,1瓶配 200 mL生理鹽水)的飲水[11]。鼠齡25 d起大鼠飼以Diet 2000# 致齲飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司)及5%蔗糖水;鼠齡25 d,口腔拭子檢測(cè)抑菌效果。鼠齡26～28 d,各組分別用無菌棉簽浸以1×106CFU/mL 濃度S.mutans菌懸液接種于35只大鼠口腔 (500 μL/只)。鼠齡29 d , 所有大鼠取口腔拭子檢測(cè)定菌效果。Control組飼以常規(guī)飼料及無菌蒸餾水。

1.5.3 藥物干預(yù) 鼠齡30～50 d , 用無菌棉簽蘸各組對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)藥液 (1 mL/只) , 分別涂于大鼠磨牙各牙面及口腔黏膜(15 s/象限),余液注入口腔,以確保藥液充分發(fā)揮作用。2次/d(每天8點(diǎn)、20點(diǎn)),連續(xù)21 d。始終由同一人完成干預(yù),干預(yù)結(jié)束后禁食禁水30 min,每日稱重監(jiān)測(cè)大鼠的健康狀況。

1.5.4 樣本收集 鼠齡51 d 各組大鼠用10%水合氯醛麻醉,行腹主動(dòng)脈取血后,給予安樂死。無菌解剖頜骨組織,編號(hào)后置于包埋盒內(nèi),高壓蒸汽滅菌(121℃,15 min),去除頜骨周圍附著的牙齦等軟組織,左側(cè)上下頜磨牙標(biāo)本用于Keyes評(píng)分,右側(cè)上下頜磨牙標(biāo)本用于CLSM。取各組大鼠心、肝、脾、肺和腎等臟器,剝除臟器表面系膜,冰鹽水沖洗,用鹽水浸濕紗布拭去多余水分,稱重并記錄(精確至0.1 g),取口腔同側(cè)5 mm×5 mm頰黏膜,以上組織編號(hào)后于4%多聚甲醛溶液固定保存,用于HE染色。

1.6 指標(biāo)的測(cè)定及評(píng)價(jià)

1.6.1S.mutans水平的測(cè)定 分別在鼠齡29、36、43及50 d 時(shí)采集各組大鼠口內(nèi)及磨牙牙面菌斑拭子,用BHI液體培養(yǎng)基倍比稀釋 (1∶1 000為稀釋梯度) , 取10 μL均勻涂于BHI瓊脂培養(yǎng)基 (總菌菌落數(shù)) 及MSBA培養(yǎng)基(S.mutans菌落數(shù)), 37℃厭氧培養(yǎng)12 h, 由兩人分別進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),計(jì)算S.mutans水平=(S.mutans菌落數(shù)/總菌落數(shù))×100%。比較各組間菌落水平,評(píng)價(jià)新疆桑白皮提取物對(duì)齲病的防治是否有效。

1.6.2 Keyes評(píng)分 取各組大鼠左側(cè)頜骨,沖洗干凈后用0.4%紫脲酸銨溶液中避光染色18 h,齲損處被紫脲酸胺染成紅色,紫脲酸銨滲入大鼠磨牙的范圍和深度作為齲損的進(jìn)展范圍和嚴(yán)重程度。根據(jù)改良Keyes評(píng)分法[11-13]:齲齒進(jìn)展為E級(jí)(釉質(zhì)表層)、Ds級(jí)(牙本質(zhì)淺層)、Dm級(jí)(牙本質(zhì)中層)以及Dx級(jí)(牙本質(zhì)深層)4個(gè)級(jí)別,用體式顯微鏡成像后,對(duì)磨牙光滑面齲損進(jìn)行計(jì)分;將大鼠磨牙沿近遠(yuǎn)中矢狀面切開暴露主溝,對(duì)窩溝齲損評(píng)分,評(píng)定不同藥物的抑齲情況。

1.6.3 CLSM檢測(cè) 取各組大鼠右側(cè)鼠磨牙沿牙冠近遠(yuǎn)中矢狀面切割制成300 μm的牙磨片,37℃避光浸泡于0.1 mmol/L羅丹明B熒光染料24 h,采用CLSM觀察牙磨片的熒光情況,齲損程度越嚴(yán)重,穿透過牙磨片的染料越深,則熒光強(qiáng)度亦愈強(qiáng)。

1.6.4 大鼠體重及健康狀況的記錄 實(shí)驗(yàn)期間定時(shí)測(cè)量各組大鼠體重,檢查大鼠的食物攝入量,注意大鼠毛發(fā)的光澤度等外觀特征,以此來判斷其健康狀況。

1.6.5 臟器系數(shù)的測(cè)定 取大鼠主要臟器(心、肝、脾、肺、腎),通過公式計(jì)算大鼠臟器系數(shù),臟器系數(shù)=臟器重量/大鼠體重×100%。

1.6.6 HE染色 取各組大鼠主要臟器及頰黏膜行HE染色,顯微鏡下呈像,觀察組織結(jié)構(gòu)有無改變。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)若滿足正態(tài)性和方差齊性,采用單因素方差分析,采用LSD法進(jìn)行兩兩比較;非正態(tài)分布采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠S.mutans水平的比較鼠齡29 d, 與CA組比較,各實(shí)驗(yàn)組S.mutans水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 提示各組均成功接種了S.mutans菌懸液[14]。鼠齡36、43 d,與CA組比較,新疆桑白皮提取物高劑量組S.mutans水平降低,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。鼠齡50 d, 與CA組比較,新疆桑白皮提取物高、中劑量組S.mutans水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖 1。

注： 鼠齡29、50 d的數(shù)據(jù)記為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差鼠齡36、45 d的數(shù)據(jù)記為中位數(shù)(IQR)。與桑白皮高劑量組比較,aP<0.05; 與桑白皮中劑量組比較, bP<0.05; 與桑白皮低劑量組比較, cP<0.05; 與CHX組比較, dP<0.05; 與CA組比較, eP<0.05。

2.2 各組大鼠Keyes評(píng)分比較CA組磨牙光滑面及窩溝處的顏色改變較其他各組更明顯,見圖2。與CA組比較,新疆桑白皮提取物高、中劑量組磨牙光滑面及窩溝處各級(jí)齲損Keys評(píng)分均降低,新疆桑白皮提取物低劑量組磨牙光滑面、E級(jí)、Ds級(jí)、Dm級(jí)評(píng)分均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

注: 不同顏色的箭頭指向不同程度的齲損;X線片紅色箭頭記為齲損。

注： Surface: 光滑面齲; E: 釉質(zhì)齲; Ds: 牙本質(zhì)淺層齲; Dm: 齲損程度在牙本質(zhì)深度的3/4以內(nèi); Dx: 齲損程度在牙本質(zhì)深度的4/3或全層。Surface、E、Ds、Dm 數(shù)據(jù)記為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)據(jù)記為中位數(shù)(IQR)。與桑白皮高劑量組比較,aP<0.05; 與桑白皮中劑量組比較, bP<0.05; 與桑白皮低劑量組比較, cP<0.05; 與CHX組比較, dP<0.05; 與CA組比較, eP<0.05。

2.3 各組大鼠牙磨片CLSM檢測(cè)在CA組牙磨片中可觀察到釉質(zhì)連續(xù)性中斷,熒光強(qiáng)度及滲透深度均比其他組強(qiáng),見圖4A。與CA組比較,桑白皮高劑量組和CHX 組滲透入釉質(zhì)或牙本質(zhì)的熒光量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖4B。

注：黃色箭頭表示因齲損產(chǎn)生的牙釉質(zhì)表面凹坑及孔隙增寬后的熒光滲透。與桑白皮高劑量組比較,aP<0.05; 與桑白皮中劑量組比較, bP<0.05; 與桑白皮低劑量組比較, cP<0.05; 與CHX組比較, dP<0.05; 與CA組比較, eP<0.05。

2.4 各組大鼠體重及健康狀況在實(shí)驗(yàn)過程中,各組大鼠健康狀況良好, 無死亡個(gè)體, 大鼠體重的生長(zhǎng)趨勢(shì)相似,見圖5。

圖5 干預(yù)期間各組大鼠體重變化圖

2.5 各組大鼠臟器系數(shù)比較與CA組比較,新疆桑白皮提取物中劑量及CHX組心臟臟器系數(shù)增大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖6。

圖6 各組大鼠臟器系數(shù)比較

2.6 各組大鼠主要臟器及頰黏膜HE染色情況各組大鼠主要臟器及頰黏膜HE染色切片均勻,組織學(xué)結(jié)構(gòu)未見明顯改變,見圖7。

圖7 各組大鼠主要臟器及頰黏膜HE染色圖(×10倍)

3 討論

目前已有多種天然藥材被證實(shí)具有防齲效果,桑白皮是一種具有悠久用藥歷史的天然藥材,在多個(gè)文獻(xiàn)中提到具有抗菌抗炎的功效[15-18]。但其在口腔健康領(lǐng)域的應(yīng)用探究還未見報(bào)道。因此,本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了新疆桑白皮提取物防齲有效性及安全性。

氯己定是為一種廣譜殺菌劑,濃度在0.12%～2%的氯己定溶液常被用于口腔疾病的防治,且治療效果顯著[19-20], 因此本實(shí)驗(yàn)選擇濃度為0.12% CHX溶液作為陽性對(duì)照組的用藥。

根據(jù)唾液S.mutans水平的測(cè)定結(jié)果,提示新疆桑白皮提取物在一定程度上具有抑制S.mutans繁殖的潛力,但低劑量的新疆桑白皮提取物抗齲效果欠佳。結(jié)合Keyes評(píng)分結(jié)果,高、中劑量組新疆桑白皮提取物能有效降低光滑面及窩溝各級(jí)齲損,但效果不及氯己定,以上結(jié)果同CLSM觀察結(jié)果一致。心臟臟器系數(shù)結(jié)果顯示,與CA組比較,新疆桑白皮提取物中劑量組及CHX組心臟臟器系數(shù)增大,考慮是因?yàn)榇笫笏下热┞樽砗蟾怪鲃?dòng)脈取血安樂死時(shí), 大鼠心臟內(nèi)部分血液未完全流出, 致組間臟器重量有差異。而在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,新疆桑白皮提取物未表現(xiàn)出明顯的毒副作用。

綜上所述,新疆桑白皮提取物具有一定的抗齲作用,且毒副作用低,具有成為抗齲劑的潛力,為新疆桑白皮提取物的開發(fā)和利用提供了理論基礎(chǔ)。