馮 凱, 張文杰, 吳澤鈺,3, 姬曉煒, 趙 今,3

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(附屬口腔醫(yī)院)牙體牙髓病科, 2口腔修復(fù)種植科; 3新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所, 烏魯木齊 830054)

牙周炎(Periodontitis)又稱為破壞性牙周病,是由菌斑微生物侵犯牙周組織引起的慢性炎癥,可導(dǎo)致牙周支持組織破壞和牙槽骨吸收[1]。研究表明組織破壞是宿主對(duì)細(xì)菌毒力因子的免疫炎癥反應(yīng)激活的結(jié)果[2]。使用安全有效的藥物控制菌斑微生物,調(diào)節(jié)過度的宿主免疫反應(yīng),限制牙周支持組織的破壞,是牙周炎藥物治療成功的關(guān)鍵。近年來中草藥因藥理活性好、副作用少等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)多種天然藥物具有抑制牙周病致病菌的生長(zhǎng)、控制炎癥、促進(jìn)組織再生的作用,在治療牙周病方面卓有成效[5-6]。桑寄生為桑寄生科植物桑寄生[Taxilluschinensis(DC.)Danser]干燥帶葉的莖枝,具有祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎等功效[7]。近年來對(duì)桑寄生藥理作用的相關(guān)研究顯示其在抗炎、抗骨質(zhì)疏松等方面具有良好的功效,臨床上主要用于骨關(guān)節(jié)炎及骨質(zhì)疏松癥的治療[8],其中主要成分槲皮素已被研究證實(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠牙周炎具有一定的治療效果[9]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析探究桑寄生治療牙周炎的有效成分、作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路,通過抑菌及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究桑寄生乙醇提取物對(duì)牙周炎的防治作用,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥桑寄生(廣東匯群中藥飲片股份有限公司,批號(hào):20230101);組織RNA保存液(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):SR0020);DAB顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):DA1010);4%多聚甲醛組織固定液(北京蘭杰柯科技有限公司,批號(hào):BL539A);EDTA脫鈣液(北京蘭杰柯科技有限公司,批號(hào):BL616B);Trizol試劑(美國Ambion公司,批號(hào):15596026CN);cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國TaKaRa公司,批號(hào):RR047A);PCR試劑盒(美國TaKaRa公司,批號(hào):RR820A);IL-6、TNF-α、MMP-9ELISA試劑盒(美國Elabscience公司,批號(hào):E-EL-R0015、E-EL-R2856、E-EL-R3021);OCN、RUNX2 Antibody(英國BOSTER公司,批號(hào):PB9920、M00442);Goat Anti Rabbit IgG HRP二抗(美國Affinity Biosciences公司,批號(hào):S0001)。

1.2 儀器組織研磨儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司); PCR擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司);Multiskan GO酶標(biāo)儀、NaNo-DROP1000核酸蛋白測(cè)定儀、熒光定量PCR擴(kuò)增儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.3 菌株P(guān).g國際標(biāo)準(zhǔn)菌株 ATCC 33277(北京生物保藏中心)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物42只雄性SPF-SD大鼠,6～8周齡,購自新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(新)2020-0002。本研究通過新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(批號(hào):IACUC-20230627-12)。

1.5 桑寄生治療牙周炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及分子對(duì)接驗(yàn)證

1.5.1 桑寄生有效成分及靶點(diǎn)的篩選與預(yù)測(cè)以及牙周炎靶點(diǎn)的獲取 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索得到桑寄生的有效化學(xué)成分及相關(guān)靶點(diǎn)(OB≥20%、DL≥0.18),經(jīng)Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)桑寄生有效成分的治療作用靶點(diǎn)。在Gene Cards、Dis Ge NET和OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索得到牙周炎相關(guān)靶點(diǎn),經(jīng) Venny分析獲得共同靶點(diǎn)。

1.5.2 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并篩選關(guān)鍵靶點(diǎn) 將桑寄生治療牙周炎的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(物種為“Homo sapiens”,置信度得分>0.4)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.10.0軟件將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化分析,采用Cytohubb插件選取MCC評(píng)分前10的基因建立核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.5.3 GO功能和KEGG通路富集分析 采用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO的生物過程(Biological process, BP)、細(xì)胞成分(Cellular component, CC)、分子功能(Molecular function, MF)富集分析及KEGG通路富集分析,設(shè)置FDR<0.001,以P<0.001為篩選條件,繪制氣泡圖。

1.5.4 桑寄生“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將篩選得到的藥物有效成分、作用靶點(diǎn)、信號(hào)通路導(dǎo)入Cytoscape 3.10.0軟件中,繪制桑寄生“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.5.5 桑寄生有效成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證 PDB數(shù)據(jù)庫中下載關(guān)鍵靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)文件,應(yīng)用PyMOL軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)處理。Pub Chem數(shù)據(jù)庫中下載桑寄生有效成分的mol2結(jié)構(gòu)文件。將處理好的結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入 Auto Dock Tools軟件轉(zhuǎn)換為pdbqt格式,應(yīng)用Auto Dock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接,對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理[10]。

1.6 桑寄生乙醇提取物對(duì)P.g的生長(zhǎng)抑制作用

1.6.1 桑寄生乙醇提取物及藥液制備 將200 g桑寄生藥材用80%乙醇依次以料液比1∶10、1∶8、1∶6回流提取3次,每次1.5 h,合并3次濾液,將濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并冷凍干燥(-80℃),獲得桑寄生乙醇提取物粉末。將桑寄生乙醇提取物粉末溶于含1% DMSO 的BHI液體培養(yǎng)基中,配制成濃度為8 g/L的母液。

1.6.2P.g菌液的制備 將P.g菌株接種于BHI瓊脂血平板上,37℃恒溫厭氧培養(yǎng)5～7 d,待表面長(zhǎng)出褐色菌落后,挑取直徑約1 mm的單個(gè)菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,調(diào)整菌液濃度至2×107cfu/mL備用。

1.6.3 桑寄生乙醇提取物對(duì)P.g的MIC和MBC的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)組采用二倍稀釋法將8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.062 5 g/L的桑寄生藥液與“1.6.2”項(xiàng)下P.g菌液各1 mL混合均勻,使細(xì)菌終濃度為1×107cfu/mL,每個(gè)濃度設(shè)置相同藥物濃度不含菌液的BHI培養(yǎng)基為對(duì)照組,37℃恒溫培養(yǎng)48 h。分別取各濃度實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組培養(yǎng)物200 μL加入96孔板中,用酶標(biāo)儀測(cè)定600 nm處吸光度(Optical density, OD)值,當(dāng)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組OD值差別≤0.05時(shí)的最低藥物濃度即為桑寄生對(duì)P.g的MIC。從大于MIC濃度的實(shí)驗(yàn)組中蘸取培養(yǎng)物,涂布于BHI瓊脂血平板上培養(yǎng)48 h,觀察菌落數(shù)少于5個(gè)的最低藥物濃度為桑寄生對(duì)P.g的MBC。

1.7 桑寄生乙醇提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠牙周炎的治療作用

1.7.1 實(shí)驗(yàn)性大鼠牙周炎模型的建立 取36只雄性SD大鼠,禁食水8 h后,全身麻醉下用浸有P.g菌液的4-0絲線結(jié)扎左上頜第一磨牙建立牙周炎模型。14 d后隨機(jī)拍攝空白組和模型組大鼠左上頜第一磨牙X線片。當(dāng)模型組PD和SBI均大于空白組,X線片上模型組與空白組相比出現(xiàn)明顯的牙槽骨的吸收,表明建模成功。

1.7.2 實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠分組及藥物干預(yù) 取“1.7.1”項(xiàng)下建模成功的牙周炎大鼠36只,隨機(jī)分為溶劑組(甘油)、模型組、鹽酸米諾環(huán)素組(鹽酸米諾環(huán)素軟膏)、桑寄生高劑量組(2倍MIC濃度的桑寄生乙醇提取物甘油溶液)、桑寄生中劑量組(1倍MIC濃度的桑寄生乙醇提取物甘油溶液)、桑寄生低劑量組(1/2倍MIC濃度的桑寄生乙醇提取物甘油溶液),另取6只未建模大鼠為空白組。除空白組和模型組外,從造模第1天開始每天給予20 μL對(duì)應(yīng)藥物局部涂抹結(jié)扎處,上藥后禁食水1 h,連續(xù)給藥14 d。

1.7.3 指標(biāo)的記錄 將造模當(dāng)天定為第0天,從第0天開始每日測(cè)量各組大鼠體重,從第1天開始每日測(cè)量各組大鼠的左上頜第一磨牙的牙周PD和SBI。記錄各組大鼠的體重、PD、SBI 。

1.7.4 樣本的采集 對(duì)各組大鼠全身麻醉腹主動(dòng)脈采血5 mL,室溫靜置2 h,3 000 r/min,離心10 min收集血清。取血后,立即收集大鼠左側(cè)上頜骨,置于組織固定液中固定。將各組部分大鼠左上頜第一磨牙牙齦組織剝離,置于RNA保存液中。

1.7.5 RT-PCR檢測(cè) 取各組大鼠牙齦組織分別提取總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA,按照PCR試劑盒說明書操作進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。以GADPH作為內(nèi)參基因,PCR產(chǎn)物應(yīng)用相對(duì)Ct法(2-△△Ct)對(duì)IL-6、TNF-α、MMP-9、RUNX2、OCN、OPG、RANKL基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析,引物信息見表1。

表1 引物信息

1.7.6 ELISA檢測(cè) 取各組凍存的血清按照ELISA試劑盒說明書操作步驟測(cè)定血清中IL-6、TNF-α、MMP-9的含量。

1.7.7 HE染色 將固定好的頜骨標(biāo)本制作石蠟切片,按標(biāo)準(zhǔn)步驟HE染色、封片后,觀察牙周組織炎癥細(xì)胞浸潤情況。

1.7.8 免疫組織化學(xué)染色 將制作好的頜骨石蠟切片按標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行免疫組化染色、封片后,顯微鏡下觀察RUNX2、OCN蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 桑寄生治療牙周炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果

2.1.1 桑寄生活性成分的篩選結(jié)果 將檢索得到桑寄生的46個(gè)化學(xué)成分根據(jù)篩選條件篩選后獲得4種活性成分,見表2。

表2 桑寄生4種主要活性成分及藥理參數(shù)

2.1.2 桑寄生治療牙周炎的潛在靶點(diǎn) 對(duì)桑寄生的4個(gè)活性成分進(jìn)行檢索后得到545個(gè)相關(guān)藥物靶點(diǎn),與檢索得到的4 151個(gè)牙周炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行Venny分析后,獲得186個(gè)桑寄生治療牙周炎的潛在靶點(diǎn),見圖1。

圖1 桑寄生-牙周炎共同靶點(diǎn)Venny圖

2.1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建并獲取 桑寄生治療牙周炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖2A),以度值為篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)30個(gè)(圖2B),通過MCC評(píng)分得到得分前10的核心靶點(diǎn)為:IL6、TNF、MMP9、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF1A)、胱天蛋白酶3(CASP3)、B淋巴細(xì)胞瘤2(BCL2)、腫瘤蛋白p53(TP53)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、白細(xì)胞介素1β(IL1B),建立核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖2C)。

注: A. 桑寄生治療牙周炎靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖; B. 桑寄生治療牙周炎的關(guān)鍵靶點(diǎn); C. 桑寄生治療牙周炎的核心靶點(diǎn)。

2.1.4 GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)186個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO及KEGG富集分析并繪制氣泡圖(圖3)。GO富集分析中BP相關(guān)條目涉及RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、DNA模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控等,CC相關(guān)條目涉及質(zhì)膜、胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞質(zhì)等,MF相關(guān)條目涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合等。KEGG富集得到的主要通路包括癌癥的發(fā)病途徑、人巨細(xì)胞病毒感染、PI3K-Akt信號(hào)通路等。

注: A. GO富集分析-BP; B. GO富集分析-CC; C. GO富集分析-MF; D. KEGG富集分析。

2.1.5 桑寄生“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路” 網(wǎng)絡(luò)分析通過Cytoscape 3.10.0構(gòu)建桑寄生“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖(圖4),表明桑寄生中的多種有效成分可通過多條信號(hào)通路調(diào)節(jié)作用于多個(gè)靶點(diǎn)來達(dá)到潛在治療牙周炎的作用。

圖4 桑寄生“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果 將部分桑寄生有效成分與篩選得到的10個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)果見表3。對(duì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理后,部分分子對(duì)接模式圖如圖5所示。分析結(jié)果表明,桑寄生有效成分與部分關(guān)鍵靶點(diǎn)之間展現(xiàn)出良好的結(jié)合活性(結(jié)合鍵能<-5 kcal/mol)。

注: A. TNF與扁蓄苷分子對(duì)接模式; B. IL6與齊墩果酸分子對(duì)接模式; C. MMP9與槲皮素分子對(duì)接模式

表3 桑寄生有效成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能預(yù)測(cè)/(kcal/mol)

2.2 桑寄生乙醇提取物對(duì)P.g的MIC和MBC測(cè)定結(jié)果桑寄生乙醇提取物對(duì)P.g的生長(zhǎng)具有一定的抑制和殺滅作用,實(shí)驗(yàn)測(cè)得桑寄生乙醇提取物對(duì)P.g的MIC為0.5 g/L,MBC為2 g/L。

2.3 桑寄生乙醇提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠牙周炎的治療作用效果

2.3.1 成功構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性大鼠牙周炎模型 建模14 d后,隨機(jī)拍攝空白組和模型組大鼠左上頜第一磨牙X線片(圖6)。觀察發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的牙槽骨與空白組相比出現(xiàn)明顯的吸收暗影,表明實(shí)驗(yàn)性大鼠牙周炎模型構(gòu)建成功。

空白組 模型組

2.3.2 各組大鼠的體重、PD、SBI的比較 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)各組大鼠體重總體平穩(wěn)增長(zhǎng)。在14 d實(shí)驗(yàn)干預(yù)結(jié)束后,與空白組比較,模型組和溶劑組大鼠PD和SBI升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),模型組與溶劑組間無明顯差異(P>0.05),表明實(shí)驗(yàn)所用溶劑甘油對(duì)大鼠牙周炎無明顯影響。與模型組比較,桑寄生高、中、低劑量組大鼠PD和SBI均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。桑寄生高劑量組大鼠PD和SBI與鹽酸米諾環(huán)素組相比無明顯差異(P>0.05),見圖7。

注:A.體重變化曲線;B. PD變化曲線;C. SBI變化曲線。

2.3.3 各組大鼠牙齦組織中IL-6、TNF-α、MMP-9、RUNX2、OCN、OPG、RANKL mRNA的相對(duì)表達(dá)水平 與模型組比較,桑寄生高、中、低劑量組大鼠牙齦組織中IL-6、TNF-α、MMP-9、RANKL mRNA的表達(dá)降低,RUNX2、OCN、OPG mRNA的表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與鹽酸米諾環(huán)素組比較,桑寄生高劑量組大鼠牙齦組織中RANKL mRNA的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),桑寄生中劑量組大鼠牙齦組織中MMP-9、RUNX2、OCN、OPG、RANKL mRNA的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),見圖8。

注：與空白組比較, aP<0.05; 與溶劑組比較, bP<0.05; 與模型組比較, cP<0.05; 與鹽酸米諾環(huán)素組比較, dP<0.05; 與桑寄生高劑量組比較, eP<0.05; 與桑寄生中劑量組比較, fP<0.05; 與桑寄生低劑量組比較, gP<0.05。

2.3.4 各組大鼠血清中IL-6、TNF-α、MMP-9的表達(dá)情況 與模型組相比,桑寄生高、中、低劑量組大鼠血清中IL-6、TNF-α、MMP-9的表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與鹽酸米諾環(huán)素組相比,桑寄生高、中劑量組大鼠血清中TNF-α、MMP-9的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),見圖9。

注：與空白組比較, aP<0.05; 與溶劑組比較, bP<0.05; 與模型組比較, cP<0.05; 與鹽酸米諾環(huán)素組比較, dP<0.05; 與桑寄生高劑量組比較, eP<0.05; 與桑寄生中劑量比較, fP<0.05; 與桑寄生低劑量組比較, gP<0.05。

2.3.5 各組大鼠牙周組織HE染色結(jié)果 空白組齦溝上皮組織結(jié)構(gòu)完整,未見明顯角化,纖維排列整齊,無炎癥細(xì)胞浸潤,牙槽骨嵴無吸收。而溶劑組與模型組可以觀察到明顯的牙周組織破壞,可見異常角化上皮及大量炎性細(xì)胞浸潤,牙齦纖維結(jié)構(gòu)紊亂并出現(xiàn)斷裂,牙槽骨嵴吸收明顯。與模型組相比,各濃度桑寄生藥物組能夠呈藥物濃度依賴性的緩解牙周炎癥細(xì)胞浸潤與組織破壞情況。各組大鼠牙周組織HE染色結(jié)果如圖10所示。

空白組

2.3.6 各組大鼠牙周組織RUNX2、OCN免疫組化染色結(jié)果 免疫組化染色陽性表現(xiàn)為胞漿內(nèi)的黃褐色顆粒,各組大鼠牙周組織RUNX2、OCN免疫組化染色結(jié)果如圖11、12所示。與空白組比較,溶劑組與模型組牙周組織中RUNX2和OCN的表達(dá)量明顯降低。與模型組比較,各濃度桑寄生藥物組能夠呈濃度依賴性促進(jìn)RUNX2、OCN的表達(dá),桑寄生高劑量組促進(jìn)效果最佳。

空白組

空白組

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建桑寄生治療牙周炎的成分靶點(diǎn)通路網(wǎng)絡(luò),篩選出桑寄生治療牙周炎的主要成分、核心靶點(diǎn)以及相關(guān)通路。有研究表明桑寄生提取物表現(xiàn)出良好的抗炎活性,在治療骨關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥中還可發(fā)揮良好的骨保護(hù)作用[11]。桑寄生提取物還具有抑菌的藥理作用,黃思璐[12]在研究中發(fā)現(xiàn)桑寄生提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉及青霉菌5種實(shí)驗(yàn)菌株均展現(xiàn)出良好的抑菌活性。本研究結(jié)果證明桑寄生乙醇提取物對(duì)P.g有良好的抑菌活性。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)桑寄生有效成分治療牙周炎的核心靶點(diǎn)包括IL6、TNF、MMP9等10個(gè)核心靶點(diǎn),分子對(duì)接結(jié)果表明以上靶點(diǎn)與桑寄生的有效成分具有良好的結(jié)合能力。TNF-α和IL-6作為重要的炎癥因子,能夠介導(dǎo)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致牙周組織的破壞并抑制其修復(fù)[13]。IL-6和TNF-α可以參與并介導(dǎo)多種信號(hào)通路誘導(dǎo),多種類型的細(xì)胞表達(dá)以及破骨細(xì)胞分化因子,促使破骨細(xì)胞的形成,同時(shí)抑制成骨細(xì)胞的分化,導(dǎo)致骨吸收[14]。有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可誘導(dǎo)IL-6的表達(dá),激發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),而 IL-6又可與TNF-α協(xié)同誘導(dǎo)增加破骨細(xì)胞前體的數(shù)量,促進(jìn)破骨細(xì)胞前體分化為成熟的破骨細(xì)胞發(fā)揮作用[15]。MMP-9是一種蛋白水解酶,研究表明其表達(dá)與牙周炎活動(dòng)期牙周組織損傷有關(guān)[16],可通過降解牙周組織細(xì)胞外基質(zhì),激活破骨細(xì)胞引起骨吸收,從而破壞牙周支持組織[17]。本研究發(fā)現(xiàn)桑寄生乙醇提取物能夠明顯降低牙周炎大鼠牙齦組織以及血清中IL-6、TNF-α、MMP-9的表達(dá),HE染色結(jié)果也證明桑寄生乙醇提取物可明顯緩解牙周炎大鼠牙周支持組織炎癥浸潤以及組織破壞情況。Shen等[18]在研究中發(fā)現(xiàn)桑寄生主要成分槲皮素可降低關(guān)節(jié)炎小鼠IL-6、TNF-α的分泌,洪麗萍等[19]也在研究中發(fā)現(xiàn)桑寄生總黃酮可降低IL-6、TNF-α水平,馮海洋等[20]研究發(fā)現(xiàn)桑寄生提取物能夠下調(diào)MMP-9的表達(dá),本研究結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)果一致。

KEGG通路富集分析結(jié)果表明PI3K-Akt等信號(hào)通路是桑寄生治療牙周炎發(fā)揮作用的關(guān)鍵通路。PI3K-Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡過程中發(fā)揮重要作用。多項(xiàng)研究表明PI3K-Akt信號(hào)通路及其下游靶蛋白與骨組織代謝之間存在密切關(guān)系[21]。RUNX2和OCN是參與成骨細(xì)胞分化成熟的重要基因,RUNX2是早期參與誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化成熟的激活劑,OCN主要參與基質(zhì)礦化的過程,可作為成骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志[22]。OPG和RANKL與破骨細(xì)胞的激活與分化密切相關(guān),RANKL是破骨細(xì)胞生成的重要因素,而OPG可與RANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,阻斷破骨細(xì)胞分化與激活,從而減輕骨吸收,因此RANKL/OPG比值對(duì)于評(píng)價(jià)骨吸收程度具有重要意義[23-24]。已有研究表明桑寄生提取物及其主要成分槲皮素均可通過調(diào)節(jié)OPG、RANKL的表達(dá)治療骨質(zhì)疏松癥[11, 25]。本研究證明桑寄生乙醇提取物能夠促進(jìn)牙周炎大鼠牙齦組織中RUNX2、OCN、OPG mRNA的表達(dá),并且能夠抑制RANKL mRNA的表達(dá),免疫組化染色結(jié)果顯示桑寄生提取物能夠促進(jìn)牙周炎大鼠牙齦組織中RUNX2、OCN蛋白的表達(dá),這表明桑寄生乙醇提取物可通過調(diào)節(jié)牙周炎大鼠局部骨穩(wěn)態(tài),從而緩解牙周骨組織破壞。

綜上所述,本研究證明桑寄生可通過多組分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用治療牙周炎,桑寄生乙醇提取物對(duì)P.g具有一定的抑制和殺滅作用,并可通過減輕炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)骨穩(wěn)態(tài)對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠牙周炎產(chǎn)生一定的治療作用。