張文杰, 馮 凱, 陳意磊, 吳澤鈺,2, 努爾比亞木·麥麥提依明,2,趙 今,2

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(附屬口腔醫(yī)院)牙體牙髓病科; 2新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所, 烏魯木齊 830054)

1 材料和方法

1.1 材料小鼠成骨前體細胞株MC3T3-E1(武漢普諾賽生物生命科技有限公司,批號:CL-0378);脫氧野尻霉素(上海源葉有限公司, 批號: F01F12R138956); α-MEM完全培養(yǎng)基(美國Gibco公司,批號:8122235);茜素紅染色液(美國Cyagen公司,批號:T230914C301);堿性磷酸酶顯色試劑盒(碧云天生物科技有限公司,批號:062523230921),堿性磷酸酶檢測試劑盒(碧云天生物科技有限公司, 批號:04321211115);細胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物科技有限公司, 批號:061923231229);活性氧檢測試劑盒(碧云天生物科技有限公司, 批號:05112320814),Trizol RNA分離試劑(美國Invitrogen有限公司,批號:343911);Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Takara生物技術(shù)有限公司,批號:ALG2080A);熒光實時定量試劑盒(美國Takara生物技術(shù)有限公司,批號:AM11194A);WH-25恒溫細胞培養(yǎng)箱(賽默飛生物科技有限公司);BS124S電子天平(Thermo生物科技有限公司);1510全波長酶標儀(賽默飛世爾儀器有限公司);DMI4000B倒置顯微鏡(上海國際貿(mào)易有限公司),TC-96基因擴增儀(杭州博日科技有限公);Quant StudioTM1 PluS實時熒光定量PCR儀(賽默飛世爾儀器有限公司);YC-1015L醫(yī)用冷藏冰箱(賽默飛生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將凍存的MC3T3-E1細胞于恒溫水浴鍋中快速解凍。吸取細胞懸液至完全培養(yǎng)基中,1 000 r/min離心5 min,棄去上清液,加入新的完全培養(yǎng)基重懸細胞,轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中,于37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 藥物的配置 高糖完全培養(yǎng)基的配置:稱取適量葡萄糖,充分溶解于α-MEM完全培養(yǎng)基中,制備成500 mmol/L的母液,保存于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?使用時按比例將其稀釋成50 mmol/L。不同濃度DNJ溶液的配置:制備10 mmol/L的DNJ母液,在超凈臺中過濾滅菌后,保存于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 指標的測定

1.3.1 不同濃度DNJ溶液對MC3T3-E1細胞的增殖影響 取對數(shù)生長期的MC3T3-E1細胞分為:空白組(完全培養(yǎng)基),陰性對照組(含細胞的完全培養(yǎng)基),高糖組(含50 mmol/L葡萄糖的完全培養(yǎng)基),實驗組[含50 mmol/L高糖培養(yǎng)基+不同濃度DNJ(10 mmol/L、1 mmol/L、100 μmol/L、10 μmol/L、1 μmol/L、100 nmol/L、10 nmol/L、1 nmol/L)溶液],每組設(shè)立6個平行孔,按每孔100 μL加入96孔板中,與P4代MC3T3-E1細胞共培養(yǎng)1、3、5、7 d,于每日同一時間按CCK-8試劑盒說明書方法檢測OD值,計算細胞增殖率。細胞增殖率=(OD實驗組-OD空白組)/(OD陰性對照組-OD空白組)×100%。

1.3.2 實驗分組 根據(jù)“1.3.1”項下實驗結(jié)果進行分組,空白組(完全培養(yǎng)基干預(yù))、高糖組(50 mmol/L糖濃度的高糖培養(yǎng)基干預(yù))、實驗組[50 mmol/L糖濃度的高糖培養(yǎng)基+不同濃度DNJ(100、10、1 μmol/L)溶液]。

[7]田成有.解讀“民族精神”——讀《論立法與法學(xué)的當代使命》[A].許章潤,主編.薩維尼與歷史法學(xué)派[C].桂林：廣西師范大學(xué)出版社，2004.

1.3.3 MC3T3-E1細胞凋亡率的測定 取P3代MC3T3-E1細胞按1×104個/mL傳代至6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng),貼壁后,按“1.3.2”項下方法分組并干預(yù)細胞,每組設(shè)立3個平行孔,放入細胞培養(yǎng)箱中干預(yù)3 d,消化各組細胞,用舊培養(yǎng)基終止消化,轉(zhuǎn)移至離心管中,按細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作測定各組細胞凋亡率。

1.3.4 MC3T3-E1細胞活性氧含量的測定 取P3代MC3T3-E1細胞按1×104個/mL傳代至6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng),貼壁后,按“1.3.2”項下方法分組并干預(yù)細胞,每組設(shè)立3個平行孔,放入細胞培養(yǎng)箱中干預(yù)3 d,結(jié)束后吸取舊培養(yǎng)基至對應(yīng)離心管中。使用無酚紅胰酶消化細胞,用舊培養(yǎng)基終止消化,轉(zhuǎn)移至原離心管中,按活性氧試劑盒說明書操作測定各組細胞活性氧含量。

1.3.5 不同濃度DNJ在高糖環(huán)境下對MC3T3-E1細胞炎癥因子的影響 將P3代MC3T3-E1細胞按2×104個/孔傳代至12孔板,每組設(shè)立3個平行孔。貼壁后,按“1.3.2”項下方法分組,干預(yù)細胞3 d后,吸取細胞上清液,1 500 r/min離心20 min,吸取上清液,于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。按ELISA試劑盒說明書操作,測定細胞上清液中白細胞介素-6 (Interleukin 6, IL-6)、白細胞介素-1β(Interleukin 1, IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)和AGEs的含量。

1.3.6 MC3T3-E1細胞堿性磷酸酶染色 取P3代MC3T3-E1細胞傳代至12孔板中,待細胞長至80%時,按“1.3.2”項下方法分組,加入成骨誘導(dǎo)液干預(yù)細胞,每組3個平行孔,分別干預(yù)7 d和14 d后,棄去舊液,每孔加入1 mL通用型組織細胞固定液,固定30 min,按堿性磷酸酶染色試劑盒說明書操作,配制染色液,每孔加入1 mL染液,孵育30 min后于倒置顯微鏡下拍照。

1.3.7 MC3T3-E1細胞堿性磷酸酶活性測定 按“1.3.6”項下方法傳代MC3T3-E1細胞,分別干預(yù)7 d和14 d后,每孔加入60 μL無抑制劑的細胞裂解液,裂解細胞,吸取細胞裂解液至EP管中,于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。分別用堿性磷酸酶活性試劑盒及BCA蛋白定量試劑盒測定ALP含量和蛋白濃度,使用酶標儀檢測其OD值,繪制標準曲線,計算ALP活性。

1.3.8 MC3T3-E1細胞茜素紅染色 將P3代MC3T3-E1細胞分別接種于3.5 cm培養(yǎng)皿中,待長至80%時,按“1.3.2”項下方法分組,加入成骨誘導(dǎo)液干預(yù)細胞,每組3個副孔,分別干預(yù)14 d和21 d,隔天換液。干預(yù)結(jié)束后,每孔加入1 mL通用型組織細胞固定液進行固定,30 min后每孔加入1 mL的茜素紅染液,對培養(yǎng)皿內(nèi)的礦化結(jié)節(jié)在常溫下染色30 min,洗凈后于倒置顯微鏡下拍照。

1.3.9 MC3T3-E1細胞中礦化結(jié)節(jié)含量的測定 按“1.3.8”項下拍照結(jié)束后,每個小皿中分別加1 mL氯化十六烷基吡啶溶液,放置搖床搖晃30 min,后吹打至結(jié)節(jié)完全溶解,吸取溶解液至96孔板中,每孔100 μL, 設(shè)立3個平行孔, 酶標儀測定562 nm波長處OD值, 礦化結(jié)節(jié)的定量=OD實驗組-OD氯化十六烷基吡啶溶液。

1.3.10 MC3T3-E1細胞內(nèi)凋亡、炎癥和成骨相關(guān)mRNA水平的測定 將P3代MC3T3-E1細胞接種于6孔板中,按“1.3.2”項下方法分組加入成骨誘導(dǎo)液干預(yù)細胞,每組3個平行孔,分別干預(yù)3 d和7 d,后棄去細胞上清液,采用Trizol法提取細胞RNA,按Takara試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量,采用PCR儀檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、胰島素樣生長因子1(Insulin-Like Growth Factor 1, IGF-1)、凋亡調(diào)節(jié)因子BAX(Apoptosis regulator BAX, BAX)、凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl-2(Apoptosis regulator Bcl-2, Bcl-2)、1型膠原蛋白(Collagen type 1, COl-1)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、骨鈣素(Osteocalcin,OCN)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2, Runx2)、成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子OSX(Osterix,OSX)的mRNA表達,采用 2-ΔΔCT法進行相對定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 26.0和Graphpad統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析,若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布及方差齊性檢驗,采用單因素方差分析,組間比較采取LSD檢驗,方差不齊采用秩和檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度DNJ對高糖環(huán)境下MC3T3-E1細胞增殖能力的影響與高糖組相比,當DNJ 100、10、1 μmol/L組細胞增殖能力增強,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),故選擇DNJ濃度100、10、1 μmol/L進行后續(xù)實驗,見表1。

表1 不同濃度DNJ對高糖環(huán)境下MC3T3-E1細胞增殖能力的影響

2.2 高糖環(huán)境下DNJ對MC3T3-E1細胞凋亡的影響空白組和高糖組MC3T3-E1細胞凋亡率分別為(17.64±4.07)%和(70.77±0.38)%。實驗組[高糖+不同濃度DNJ(100、10、1 μmol/L)溶液]的細胞凋亡率分別為(63.43±2.78)%、(35.53±3.15)%和(52.67±0.17)%。與空白組相比,高糖組細胞凋亡率增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與高糖組相比,實驗組細胞凋亡率降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

圖1 各組MC3T3-E1細胞凋亡流式檢測圖

2.3 高糖環(huán)境下不同濃度DNJ對MC3T3-E1細胞內(nèi)活性氧含量的影響空白組和高糖組MC3T3-E1細胞內(nèi)活性氧含量分別為(50.87±0.17)%和(77.03±6.53)%。實驗組[高糖+不同濃度DNJ(100、 10、1 μmol/L)溶液]細胞內(nèi)活性氧含量分別為(57.35±0.69)%、(29.53±1.79)%和(36.70±2.33)%。與空白組相比,高糖組細胞內(nèi)活性氧含量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與高糖組相比,實驗組細胞內(nèi)活性氧含量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

圖2 各組MC3T3-E1細胞活性氧含量檢測圖

2.4 高糖環(huán)境下DNJ對MC3T3-E1細胞內(nèi)炎癥因子含量的影響與空白組相比,高糖組細胞上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α和AGEs含量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與高糖組相比,實驗組[高糖+不同濃度DNJ(100、10、1 μmol/L)溶液]細胞上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α和AGEs含量降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 高糖環(huán)境下DNJ對MC3T3-E1細胞上清液中炎癥因子含量的影響

2.5 DNJ在高糖環(huán)境下對MC3T3-E1細胞ALP表達的影響與空白組相比,高糖組ALP表達降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與高糖組相比,實驗組ALP表達升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3、4。

圖3 第7、14天各組MC3T3-E1細胞堿性磷酸酶染色圖

注:與高糖組相比, **P<0.01, ****P<0.0001。

2.6 高糖環(huán)境下DNJ對MC3T3-E1細胞礦化結(jié)節(jié)形成的影響與空白組相比,高糖組形成的礦化結(jié)節(jié)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與高糖組相比,實驗組形成的礦化結(jié)節(jié)增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖5、6。

圖5 第14、21天各組MC3T3-E1細胞茜素紅染色圖

注: 與高糖組相比, ****P<0.000 1。

2.7 高糖環(huán)境下DNJ對MC3T3-E1細胞凋亡相關(guān)mRNA的影響與空白組相比,高糖組Bax表達增大,Bcl-2表達減小,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與高糖組相比,實驗組Bax表達減小,Bcl-2表達增大,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 高糖環(huán)境下DNJ對MC3T3-E1細胞凋亡相關(guān)mRNA的影響

2.8 高糖環(huán)境下DNJ對MC3T3-E1細胞炎癥相關(guān)mRNA的影響與空白組相比,高糖組IL-1β、IL-6和TNF-α表達增大,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與高糖組相比, 實驗組IL-1β、 IL-6和TNF-α的表達減小, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖7。

注: 與高糖組相比, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1。

2.9 DNJ對高糖環(huán)境下MC3T3-E1細胞成骨相關(guān)mRNA表達的影響與空白組相比,高糖組Runx2、ALP、OCN和IGF-1等成骨相關(guān)mRNA表達下調(diào)。與高糖組相比,實驗組成骨相關(guān)mRNA的表達上調(diào), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖8、9。

注: 與高糖組相比, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1。

注: 與高糖組相比,*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1。

3 討論

糖尿病主要通過炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、骨代謝紊亂和AGEs積累這4種途徑影響牙周炎[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn),高糖環(huán)境會導(dǎo)致MC3T3-E1細胞發(fā)生凋亡,上調(diào)促凋基因Bax和下調(diào)抑凋基因Bcl-2的表達,與文獻[12-13]的研究結(jié)果一致。說明DNJ可以通過升高Bcl-2/Bax的比值,抑制因高糖刺激引起的細胞凋亡。活性氧在介導(dǎo)機體內(nèi)的氧化應(yīng)激,調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子和凋亡等活動中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境會導(dǎo)致活性氧的大量產(chǎn)生, 與Li等[14]的研究結(jié)果一致。若活性氧無法及時清除會產(chǎn)生氧化應(yīng)激,被認為是導(dǎo)致細胞損傷、凋亡和骨代謝紊亂的主要原因[15]。本研究發(fā)現(xiàn)一定濃度范圍內(nèi)的DNJ可以抑制高糖環(huán)境下細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生,說明DNJ具有良好的抗氧化效果。

活性氧與AGEs的產(chǎn)生密切相關(guān),大量活性氧堆積在牙周組織中會加劇牙周組織的破壞,促進細胞的凋亡,炎癥和氧化應(yīng)激等[16-17],并誘發(fā)IL-1β、TNF-α和IL-6等炎癥介質(zhì)的分泌增多,導(dǎo)致牙槽骨快速喪失,繼而影響相關(guān)成骨指標的表達[18]。IL-6在骨的重塑和改建中發(fā)揮著重要的作用,促進骨質(zhì)的破壞[19]。TNF-α和IL-1β參與多種炎性疾病,通過抑制骨細胞的成骨分化從而導(dǎo)致骨密度降低和骨質(zhì)吸收[20]。本研究發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境可以增加MC3T3-E1細胞上清液中AGEs、IL-1β、TNF-α和IL-6的含量,上調(diào)IL-1β、TNF-α和IL-6的表達,與歐玉瓊[21]的研究結(jié)果一致。加入DNJ后可以抑制因高糖刺激引起的炎癥反應(yīng),降低AGEs含量,說明DNJ具有良好的抗炎效果。

研究表明,AGEs是糖尿病導(dǎo)致骨質(zhì)疏松并發(fā)癥的機制之一[22]。本研究采用堿性磷酸酶染色、ALP活性、茜素紅和PCR檢測高糖環(huán)境下成骨細胞的成骨能力,結(jié)果表明高糖環(huán)境會抑制成骨細胞的分化,與SUN等[23]的研究結(jié)果一致。加入DNJ干預(yù)后可以促進高糖環(huán)境下成骨細胞的分化能力,說明DNJ在一定濃度范圍內(nèi)可以緩解高糖環(huán)境下成骨細胞分化能力的減弱。

綜上所述,DNJ在一定濃度范圍內(nèi)能夠緩解因高糖刺激引起的細胞損傷凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),促進高糖環(huán)境下MC3T3-E1細胞的成骨分化,為DNJ用于糖尿病牙周炎的防治提供理論依據(jù)。