李 晶, 馮 濤, 陳 晨, 馬 麗

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院1內(nèi)分泌科, 2普外二科, 烏魯木齊 830000)

2型糖尿病腎病為一種糖尿病微血管并發(fā)癥,2型糖尿病腎病患者體內(nèi)存在一種持續(xù)性的微炎癥狀態(tài)[1]。微炎癥狀態(tài)與病原體感染有所區(qū)別,以全身循環(huán)低水平、持續(xù)性的炎癥因子水平升高為主要表現(xiàn)[2]。微炎癥狀態(tài)始于2型糖尿病腎病早期,其伴隨病情進(jìn)展不斷加重,最終造成患者腎功能障礙及腎實(shí)質(zhì)損傷。因此,對(duì)微炎癥狀態(tài)加以控制,為延緩糖尿病腎病疾病進(jìn)展提供了新思路。目前,西醫(yī)多以降壓、降糖、降脂等方式對(duì)糖尿病腎病患者進(jìn)行治療。而中醫(yī)則基于整體視角進(jìn)行辨證施治,對(duì)2型糖尿病腎病具有獨(dú)特療效。中藥灌腸療法是基于中醫(yī)藥基本理念而形成的一類(lèi)中國(guó)特色傳統(tǒng)外治法。作為一種經(jīng)驗(yàn)藥方,糖腎灌腸方在臨床上已被證明可明顯緩解糖尿病腎病患者肢體浮腫、腰膝酸困、面色晦暗、乏力、惡心等癥狀,從而提升其生活質(zhì)量。纈沙坦是現(xiàn)階段臨床上用于控制2型糖尿病腎病患者血壓水平的一種常見(jiàn)藥物?；诖?本研究針對(duì)糖腎灌腸方聯(lián)合纈沙坦對(duì)2型糖尿病腎病的臨床療效及大鼠腎臟組織TLR2 和 TLR4表達(dá)的影響進(jìn)行觀察,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SPF級(jí)8周齡SD雌性大鼠60只[來(lái)源:遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司;動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(遼)2020-0001],飼養(yǎng)于新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)藥研究院。飼養(yǎng)條件[動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境 7 d,自由飲水飲食,室溫(22±1)℃,濕度(40±10)%,光照周期 12 h/12 h],適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,將大鼠進(jìn)行分組。本研究通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(批號(hào):IACUC-20201002-9)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 水合氯醛(廠家:濟(jì)南嘉格生物科技有限公司)、鏈脲佐菌素(廠家:美國(guó)Sigma公司)、血糖儀及血糖試紙(廠家:美國(guó)強(qiáng)生)、-80℃冰箱(廠家:中國(guó)榮事達(dá);型號(hào):BCD-245F)、大鼠麻醉機(jī)(廠家:上海玉研科學(xué)儀器有限公司)、全自動(dòng)生化分析儀(廠家:日本日立公司;型號(hào):7080)、電子天平(廠家:德國(guó)Sartorius公司)、血液基因組柱式提取試劑盒(廠家:康為世紀(jì)生物科技有限公司);蘇木精-伊紅染色試劑 盒(廠家:北京索萊寶生物科技有限公司)。

1.1.3 藥物配置 糖腎灌腸方(新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)藥研究院提供):生大黃30 g、煅牡蠣50 g、澤瀉30 g、丹參15 g、槐花30 g、黑順片15 g、黃芩30 g?？偡?00 g加入10倍量水煎煮濃縮至150 mL,灌腸給予0.13 mL/10 g/只。纈沙坦膠囊(廠家:北京諾華制藥有限公司;批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H20040217;規(guī)格:80 mg)。240 mg加入100 mL生理鹽水,配置成2.4 mg/mL,0.12 mg/10 g/只。

1.2 方法

1.2.1 分組 將60只SD雌性大鼠,隨機(jī)選取10只作為空白對(duì)照組,其余50只進(jìn)行右側(cè)腎臟摘取手術(shù),構(gòu)建2 型糖尿病腎病大鼠模型,造模過(guò)程中死亡10只,將造模成功的40只大鼠隨機(jī)分為模型組、糖腎灌腸方干預(yù)組、纈沙坦干預(yù)組、纈沙坦+糖腎灌腸方干預(yù)組,并對(duì)糖腎灌腸方干預(yù)組采用糖腎灌腸方治療,對(duì)纈沙坦干預(yù)組采用纈沙坦治療,對(duì)纈沙坦+糖腎灌腸方干預(yù)組采用糖腎灌腸方聯(lián)合纈沙坦治療。

1.2.2 右腎摘除 (1)用麻醉機(jī)麻醉大鼠并仰臥固定放置;(2)備皮,靠右側(cè)開(kāi)口;(3)游離大鼠右腎,結(jié)扎血管,輸尿管,摘除右腎;(4)逐層縫合,碘伏消毒后,將大鼠放回籠中,術(shù)后觀察1周 。右腎摘除手術(shù)過(guò)程,見(jiàn)圖1。

圖1 右腎摘除術(shù)手術(shù)過(guò)程

1.2.3 構(gòu)建2型糖尿病腎病模型 (1)構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型:腎摘除模型造模成功后,大鼠高糖高脂喂養(yǎng)30 d后,禁食24 h,精確稱(chēng)量體重,按照40 mg/kg的劑量予大鼠腹腔注射1%鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ)溶液,連續(xù)注射3 d。注射72 h后,剪掉大鼠尾部尖端少許,用血糖儀測(cè)量大鼠血糖,血糖高于16.7 mmol/L視為造模成功;(2)構(gòu)建2 型糖尿病腎病模型:2型糖尿病模型造模成功后,大鼠用代謝籠收集24 h尿液并進(jìn)行測(cè)定,尿量>原尿量50% h、 尿蛋白排泄率>30 mg/24 h視為2型糖尿病腎病模型制備成功。

1.3 藥物干預(yù)造模成功后,空白對(duì)照組、模型組給予等量生理鹽水;糖腎灌腸方干預(yù)組給予0.13 mL/10 g糖腎灌腸方溶液;纈沙坦干預(yù)組給予纈沙坦片溶液0.12 mg/10 g;纈沙坦+糖腎灌腸方干預(yù)組給予0.13 mL/10 g糖腎灌腸方溶液和0.12 mg/10 g纈沙坦溶液;各組大鼠均每天1次,連續(xù)灌腸4周。見(jiàn)圖2。

空白對(duì)照組

1.4 取材(1)腹腔注射10%水合氯醛以麻醉大鼠,注射劑量330 μL/100 g;(2)剪開(kāi)大鼠胸腔,由心臟采血后將血液置入離心管,靜置30 min后,3 000 r/min離心10 min,吸取上層血清凍存;(3)取腎臟,一半4%多聚甲醛固定 一半凍存;(4)取糞便凍存。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 血糖水平測(cè)量 采用血糖儀分別測(cè)量并記錄造模后給藥前大鼠的尾靜脈空腹血糖水平,空腹血糖水平>16.7 mmol/L視為2型糖尿病大鼠模型構(gòu)建成功。

1.5.2 腎臟病理學(xué)檢查 大鼠麻醉處死后立刻剖腹游離出腎臟,用冰鹽水對(duì)腎臟進(jìn)行灌洗,分離腎皮質(zhì),進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色、脫水、封片等操作處理,并在光鏡下對(duì)大鼠腎臟組織的形態(tài)學(xué)改變情況進(jìn)行觀察。

1.5.3 24 h尿量、尿蛋白、BUN、Cr測(cè)定 2型糖尿病模型造模成功后,用代謝籠收集各組大鼠24 h尿液進(jìn)行測(cè)定,尿量>原尿量50%、 尿蛋白排泄率>30 mg/24 h ,視為2型糖尿病腎病模型制備成功;采用自動(dòng)生化分析儀分別測(cè)定各組大鼠BUN、Cr。

1.5.4 腎濕質(zhì)量、腎臟肥大指數(shù)測(cè)定 大鼠麻醉處死后,立即剖腹游離出腎臟,用濾紙將上面的血跡吸干,采用電子天平稱(chēng)量腎濕質(zhì)量,并計(jì)算出腎臟肥大指數(shù)(Kidney hypertrophy index,KI)。計(jì)算公式如下:KI=右腎濕質(zhì)量/體質(zhì)量

1.5.5 TLR2、TLR4mRNA水平測(cè)定 采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)測(cè)定大鼠腎組織中的TLR4 mRNA水平。用總RNA抽提試劑(Total RNA extraction reagent,TRIZOL)從新鮮分離的大鼠腎組織中提純總RNA,采用互補(bǔ)DNA(Complementary DNA,cDNA)合成試劑盒獲得第一鏈cDNA,然后進(jìn)行定量PCR反應(yīng),以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,G3PDH)作為內(nèi)參,采用2-△△Ct法得出結(jié)果并進(jìn)行計(jì)算?；蛞镄蛄腥缦?TLR4的正向引物序列為CATGGATCAGAAACTCAGCAAAGTC,反向引物序列為CATGCCATGCCTTGTCTTCA;TLR2的正向引物序列為T(mén)GGAGGTCTCCAGGTCAAATCT,反向引物序列為T(mén)GTTTGCTGTGAGTCCCGAG。

1.5.6 TLR2 和 TLR4蛋白表達(dá)水平測(cè)定 采用免疫印跡法(Western blotting,WB)測(cè)定大鼠腎組織中的TLR2、TLR4蛋白表達(dá)水平。取大鼠腎組織,加入組織裂解液后勻漿,離心后分離出上清液并,完成電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,在4℃的環(huán)境下應(yīng)用脫脂干奶(5%)封閉保存60 min, 然后經(jīng)TLR2、 TLR4(1∶1 000稀釋)抗體及山羊抗兔二抗(1∶2 000稀釋)孵育,采用化學(xué)發(fā)光試劑盒在凝膠成像儀中成像,以G3PDH作為內(nèi)參,使用ImageJ軟件進(jìn)行條帶定量分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠空腹血糖水平及尿蛋白含量比較與空白對(duì)照組比較,各造模組血糖和尿蛋白含量均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,糖腎灌腸、纈沙坦干預(yù)組與纈沙坦+糖腎灌腸方干預(yù)組的血糖降低但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),糖腎灌腸方干預(yù)組、纈沙坦片干預(yù)組及纈沙坦+糖腎灌腸方干預(yù)組的尿蛋白含量下降(P<0.05),且纈沙坦+糖腎灌腸方干預(yù)組的尿蛋白含量顯著下降(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血糖、尿蛋白含量比較

2.2 各組大鼠腎組織病理學(xué)檢查結(jié)果比較與空白對(duì)照組比,模型組腎組織病變顯著,如腎小管擴(kuò)張、纖維化、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死細(xì)胞脫落;與模型組比較,糖腎灌腸干預(yù)方組和纈沙坦片干預(yù)組的大鼠腎小管擴(kuò)張程度、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死細(xì)胞脫落情況有所減輕。纈沙坦+糖腎灌腸方干預(yù)組的大鼠腎小管基本無(wú)擴(kuò)張,僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死細(xì)胞脫落,腎臟結(jié)構(gòu)接近空白對(duì)照組。見(jiàn)圖3。

(HE,×100) (HE,×200)

2.3 各組大鼠血清及糞便BUN、Cr含量比較與空白對(duì)照組比較,模型組血清Cr含量、糞便Cr含量、血清BUN含量及血/糞BUN比值顯著升高(P<0.05);與模型組比較,糖腎灌腸方干預(yù)組、纈沙坦干預(yù)組及纈沙坦+糖腎灌腸方干預(yù)組的血清Cr含量、糞便Cr含量、血清BUN含量及血/糞BUN比值下降(P<0.05)。見(jiàn)表2,圖4。

表2 各組大鼠血清及糞便BUN、Cr含量及比值比較

注：1,空白對(duì)照組;2,模型組;3,糖腎灌腸方干預(yù)組;4,纈沙坦干預(yù)組;5,纈沙坦+糖腎灌腸方干預(yù)組。

注：與空白對(duì)照組比較, *P<0.05; 與模型組比較, #P<0.05; 與糖腎灌腸方干預(yù)組比較, $P<0.05; 與纈沙坦干預(yù)組比較, &P<0.05。

2.4 各組大鼠腎濕質(zhì)量及腎臟肥大指數(shù)比較與空白對(duì)照組比較,模型組的腎濕質(zhì)量及腎肥大指數(shù)顯著增加(P<0.05);與模型組比較,糖腎灌腸方干預(yù)組、纈沙坦干預(yù)組及纈沙坦+糖腎灌腸方干預(yù)組的腎濕質(zhì)量及腎肥大指數(shù)降低(P<0.05),且纈沙坦+糖腎灌腸方干預(yù)組的腎濕質(zhì)量及腎肥大指數(shù)明顯低于糖腎灌腸方干預(yù)組、纈沙坦干預(yù)組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠腎濕質(zhì)量及腎肥大指數(shù)比較

2.5 各組大鼠TLR2mRNA、TLR4mRNA、TLR2蛋白、TLR4蛋白表達(dá)水平比較與空白對(duì)照組比較,模型組TLR2mRNA、TLR4mRNA、TLR2蛋白、TLR4蛋白表達(dá)均顯著上升(P<0.05);與模型組比較,糖腎灌腸方干預(yù)組、纈沙坦干預(yù)組以及纈沙坦+糖腎灌腸方干預(yù)組的TLR2mRNA、TLR4mRNA、TLR2蛋白、TLR4蛋白表達(dá)均下降(P<0.05)。見(jiàn)表4、圖4。

表4 各組大鼠TLR2mRNA、TLR4mRNA、TLR2蛋白、TLR4蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

2型糖尿病腎病是由糖尿病所引發(fā)的一類(lèi)臨床常見(jiàn)腎臟疾病,以少尿、蛋白尿、血肌酐上升等為腎臟受損典型癥狀,其發(fā)生發(fā)展與遺傳、腎臟血流動(dòng)力學(xué)變化、糖代謝異常、血壓升高等多種因素密切相關(guān)[3-6]。糖腎灌腸方為臨床上治療2型糖尿病腎病的一種中醫(yī)特色療法,以生大黃、丹參、澤瀉、黃芩等藥物為主要成分。相關(guān)研究表明,大黃不僅可以有效降低2型糖尿病腎病大鼠的血清尿素、肌酐水平,明顯改善腎臟的病變組織,還能夠?qū)?型糖尿病腎病腎臟肥大及系膜細(xì)胞的增殖發(fā)揮抑制作用,從而對(duì)腎臟進(jìn)行有效保護(hù)[7-8]。大量研究表明,采用中藥灌腸方式治療2型糖尿病腎病,既能有效降低患者的血清尿素、肌酐水平,又能抑制病情的進(jìn)一步發(fā)展。另有研究發(fā)現(xiàn),中藥液在腸腔存留的時(shí)間越久,則血清肌酐水平下降越顯著,對(duì)腎功能的改善作用也愈加明顯[9-12]。有研究表明纈沙坦可以通過(guò)擴(kuò)張血管來(lái)緩解腎小球的高濾過(guò)狀態(tài),從而使患者的蛋白尿情況得到有效改善。此外,纈沙坦還可以促進(jìn)腎血流對(duì)局部炎癥的代謝,從而降低機(jī)體的炎性反應(yīng),并盡量減少炎癥反應(yīng)對(duì)腎功能的損傷[13-15]。

2型糖尿病腎病患者的腎小球細(xì)胞受到損傷,會(huì)引起腎小球?yàn)V過(guò)功能下降,從而引發(fā)尿量減少及尿蛋白升高等病理性改變;BUN、Cr主要通過(guò)腎臟排泄[16-17]。當(dāng)機(jī)體腎功能減退、腎小球?yàn)V過(guò)能力減弱時(shí),血清中的BUN、Cr含量會(huì)明顯升高。因此,BUN、Cr可被視為腎臟實(shí)質(zhì)損害的重要標(biāo)志物,對(duì)于臨床評(píng)估腎功能意義重大。Toll樣受體為一類(lèi)蛋白質(zhì)分子,其能參與機(jī)體非特異性免疫應(yīng)答并促進(jìn)炎癥因子的合成及分泌[18]。研究表明,與健康人群比較,2型糖尿病腎病患者的血清TLR2、TLR4水平明顯升高,提示TLR2、TLR4在2型糖尿病腎病疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[19]。有研究表明TLR2、TLR4為T(mén)oll樣蛋白受體家族中的重要成員,能夠促進(jìn)炎性因子釋放,從而激活炎癥信號(hào)路徑,誘導(dǎo)腎小管間質(zhì)纖維化,使腎小球發(fā)生硬化,進(jìn)而引發(fā)腎功能障礙[20]。

本研究發(fā)現(xiàn),與模型組比較,糖腎灌腸干預(yù)組、纈沙坦干預(yù)組與纈沙坦+糖腎灌腸方干預(yù)組的血糖降低,尿蛋白含量下降,且纈沙坦+糖腎灌腸方干預(yù)組的尿蛋白含量顯著下降,糖腎灌腸干預(yù)方組和纈沙坦片干預(yù)組的大鼠腎小管擴(kuò)張程度、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死細(xì)胞脫落情況有所減輕;纈沙坦+糖腎灌腸方干預(yù)組的大鼠腎小管基本無(wú)擴(kuò)張,僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及壞死細(xì)胞脫落,腎臟結(jié)構(gòu)更接近于空白對(duì)照組。提示糖腎灌腸方干預(yù)組、纈沙坦干預(yù)組以及聯(lián)合干預(yù)組在血糖、尿蛋白以及腎組織病理改變上的改善,表明這些干預(yù)措施對(duì)糖尿病腎病具有治療作用。其中,聯(lián)合干預(yù)的效果更佳,說(shuō)明兩種藥物可能具有協(xié)同作用。

本研究發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組比較,各造模組的TLR2、TLR4蛋白及mRNA表達(dá)水平均明顯升高。結(jié)果提示,2型糖尿病腎病大鼠模型的炎癥反應(yīng)較為明顯。與模型組比較,糖腎灌腸、纈沙坦干預(yù)組與纈沙坦+糖腎灌腸方干預(yù)組的血清Cr含量、糞便Cr含量、血清BUN含量、血/糞BUN比值、腎濕重、腎肥大指數(shù)、TLR2mRNA、TLR4mRNA、TLR2蛋白及TLR4蛋白表達(dá)均降低,且纈沙坦+糖腎灌腸方干預(yù)組的降幅最大,證實(shí)了藥物干預(yù)對(duì)糖尿病腎病大鼠腎功能和炎癥反應(yīng)的改善作用。且糖腎灌腸方和纈沙坦在抑制炎癥反應(yīng)方面具有協(xié)同作用。原因?yàn)樘悄I灌腸方中的生大黃、丹參等成分具有顯著的抗炎和抗氧化作用,可以抑制炎癥因子的合成及分泌。纈沙坦則能夠通過(guò)抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)來(lái)緩解腎小球的高濾過(guò)狀態(tài),從而改善機(jī)體的炎癥反應(yīng)。二者的聯(lián)合應(yīng)用不僅在改善腎功能方面表現(xiàn)出更好的效果,還在抑制腎臟組織的TLR2、TLR4蛋白及mRNA的表達(dá)方面具有協(xié)同作用。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于2型糖尿病腎病的治療具有重要的意義。通過(guò)抑制TLR2、TLR4的表達(dá),可以進(jìn)一步抑制炎癥反應(yīng),從而減輕腎組織損傷,改善腎功能。此外,這種聯(lián)合用藥的方法還可以為2型糖尿病腎病的臨床治療提供新的思路和方法。

綜上,糖腎灌腸方聯(lián)合纈沙坦治療2型糖尿病腎病效果更佳,并能抑制大鼠腎臟組織TLR2、TLR4表達(dá),值得在臨床上推廣應(yīng)用。