基于銅死亡基因識(shí)別腦膜瘤亞型并篩選腦膜瘤免疫相關(guān)的關(guān)鍵基因

徐海彪 袁光耀 潘敏泓 劉寧

【摘要】目的篩選銅死亡相關(guān)的腦膜瘤亞型并識(shí)別與疾病免疫相關(guān)的關(guān)鍵基因。方法利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)中腦膜瘤相關(guān)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)篩選差異表達(dá)的銅死亡基因，并基于其在腫瘤樣本中的表達(dá)值識(shí)別腦膜瘤亞型。分析亞型間的差異表達(dá)基因以及亞型與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)聯(lián)。以亞型間顯著差異的免疫細(xì)胞為表型，利用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）篩選疾病免疫相關(guān)的模塊并提取模塊基因。通過(guò)交集分析篩選出差異表達(dá)的疾病免疫相關(guān)基因，進(jìn)行后續(xù)蛋白蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)分析、功能富集分析、Friends分析、基因表達(dá)驗(yàn)證以及關(guān)鍵基因與臨床因素關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果在腦膜瘤和正常樣本中檢測(cè)到6個(gè)銅死亡基因的差異表達(dá)，如CDKN2A和GLS，并鑒定了2個(gè)相關(guān)的銅死亡亞型。兩個(gè)亞型間涵蓋397個(gè)差異表達(dá)基因，包括8種免疫細(xì)胞，其浸潤(rùn)豐度在亞型間存在顯著差異。通過(guò)WGCNA篩選到282個(gè)疾病免疫相關(guān)基因，交集分析得到74個(gè)差異表達(dá)的疾病免疫相關(guān)基因。PPI和Friends分析最終確認(rèn)了5個(gè)關(guān)鍵基因，包括LTBP1、LTBP2和MFAP5等。其中，LTBP2和MFAP5在腦膜瘤不同級(jí)別中表達(dá)存在顯著差異。Western Blot和免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MFAP5在WHO Ⅰ級(jí)和WHO Ⅲ級(jí)之間以及WHO Ⅰ級(jí)和WHO Ⅱ級(jí)之間存在顯著差異。結(jié)論本研究篩選到2個(gè)銅死亡相關(guān)的腦膜瘤亞型，這兩個(gè)亞型在免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫反應(yīng)方面存在差異。兩個(gè)亞型間的免疫相關(guān)關(guān)鍵基因，如LTBP2和MFAP5，可能是銅死亡調(diào)控腦膜瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制，有望成為腦膜瘤診斷生物標(biāo)志物或免疫治療靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】腦膜瘤；銅死亡；腫瘤分型；免疫微環(huán)境

【中圖分類號(hào)】R739.41【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】16727770（2024）02016210

Identification of meningioma subtypes and screening of meningiomaimmune related hubgenes based on cuproptosis gene XU Haibiao， YUAN Guangyao， PAN Minhong， et al. Nanjing Medical University， Nanjing 210029， China

Corresponding author： LIU Ning

Abstract： ObjectiveTo identify copper induced deathrelated subtypes of meningiomas and recognize key genes associated with diseaseimmune interactions. MethodsUtilizing publicly available gene expression data related to meningiomas， differentially expressed acproptosis genes were screened. Subsequently， meningioma subtypes based on the expression values of these genes in tumor samples were ?identified. The differentially expressed genes between subtypes and their association with the tumor immune microenvironment were analyzed. Using immune cells with significant differences between subtypes as a phenotype， Weighted Gene Coexpression Network Analysis（WGCNA） was employed to screen diseaseimmunerelated modules and extract module genes. Through intersection analysis， differentially expressed diseaseimmunerelated genes were selected. Further analyses included proteinprotein interaction（PPI） network analysis， functional enrichment analysis， Friends analysis， gene expression validation and correlation analysis between key genes and clinical factors. ResultsDifferential expression of six copper death genes were detected， such as CDKN2A and GLS， in meningiomas compared to normal samples， identifying two associated copper induced death subtypes. These subtypes encompassed 397 differentially expressed

genes， including eight immune cell types. There were significant differences in immune cell infiltration between subtypes. WGCNA identified 282 diseaseimmunerelated genes， and intersection analysis revealed 74 differentially expressed diseaseimmunerelated genes. PPI and Friends analyses ultimately confirmed five key genes： LTBP1， LTBP2， and MFAP5， etc. Among these， LTBP2 and MFAP5 exhibited significant expression differences in meningioma grades. Western blot and immunohistochemistry validation demonstrated significant differences in MFAP5 expression between WHO Grade Ⅰ and WHO Grade Ⅲ， as well as WHO Grade Ⅰ and WHO Grade Ⅱ. ConclusionsThis study identifies two copper deathrelated meningioma subtypes characterized by differences in immune cell infiltration and immune responses. Key immunerelated genes between these subtypes， such as LTBP2 and MFAP5， may represent critical mechanisms in the regulation of copper death in the occurrence and development of meningiomas， potentially serving as diagnostic biomarkers or immunotherapeutic targets for meningiomas.

Key words： meningioma; cuproptosis; tumor staging; immune microenvironment

腦膜瘤是顱內(nèi)腫瘤中最為常見的原發(fā)性腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的39%［1］。在根據(jù)最新的世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）2021年中樞神經(jīng)腫瘤分類，腦膜瘤根據(jù)其組織病理學(xué)特征和遺傳特征被劃分為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）WHO ⅠⅢ級(jí)［2］。CNS WHO Ⅰ級(jí)腦膜瘤生長(zhǎng)緩慢，且界限清晰，而CNS WHO Ⅱ級(jí)（非典型）或CNS WHO Ⅲ級(jí)（間變性）腦膜瘤可能表現(xiàn)出惡性特征，在切除后具有較高的復(fù)發(fā)率［3］。盡管CNS WHO Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)腦膜瘤病例相對(duì)較少（僅占4%～28%和1%～3%）［4］，但復(fù)發(fā)性或進(jìn)展性腫瘤病例會(huì)導(dǎo)致總體生存率下降，因此需要進(jìn)一步調(diào)整和改進(jìn)治療方法。由于腦膜瘤在組織學(xué)特征和生物學(xué)行為上的多樣性，即使在給定的WHO分級(jí)內(nèi)，也需要調(diào)整治療方法以改善預(yù)后［5］。因此，對(duì)腦膜瘤進(jìn)行亞型分析和探索相應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制對(duì)于患者風(fēng)險(xiǎn)分層、篩選特異性的診斷生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)，以及改善預(yù)后具有重要意義。

銅是一種常見的金屬元素，與多種蛋白質(zhì)或酶結(jié)合，參與能量代謝、線粒體呼吸、抗氧化等多種生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。銅離子含量的動(dòng)態(tài)平衡是維持正常功能的關(guān)鍵，其不平衡可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激和異常自噬［6］，進(jìn)而誘發(fā)多種與銅或銅離子相關(guān)的疾病。Tsvetkov等［7］首次提出了一種依賴銅的新型細(xì)胞死亡形式，稱之為銅死亡。銅死亡是一種依賴于銅的、可調(diào)節(jié)的細(xì)胞死亡方式，與線粒體呼吸密切相關(guān)。其發(fā)生通過(guò)脂?；牡鞍踪|(zhì)聚集實(shí)現(xiàn)，銅離子與線粒體呼吸過(guò)程中三羧酸循環(huán)的脂?；M分直接結(jié)合，導(dǎo)致鐵硫聚簇蛋白被抑制，引發(fā)蛋白質(zhì)毒性應(yīng)激和線粒體代謝功能障礙，最終導(dǎo)致銅死亡。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，銅死亡與多種癌癥相關(guān)，且銅死亡相關(guān)基因在預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后及免疫治療敏感性方面具有較高的價(jià)值［8］。然而，腦膜瘤中銅死亡相關(guān)基因的潛在生物學(xué)作用及其與免疫相關(guān)性尚不清楚。

本研究利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)中腦膜瘤相關(guān)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，篩選差異表達(dá)的銅死亡基因，并基于這些基因在腫瘤樣本中的表達(dá)值，進(jìn)一步識(shí)別腦膜瘤的亞型。隨后，分析了亞型間的差異表達(dá)基因以及亞型與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)聯(lián)。通過(guò)將亞型間顯著差異的免疫細(xì)胞作為表型性狀，運(yùn)用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（Weighted Gene Coexpression Network Analysis，WGCNA）篩選疾病免疫相關(guān)的模塊并提取模塊基因。進(jìn)一步篩選了WGCNA模塊基因與亞型間差異表達(dá)基因的交集，將其作為差異表達(dá)的疾病免疫相關(guān)基因，進(jìn)行后續(xù)的蛋白蛋白相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析、功能富集分析、Friends分析、基因表達(dá)驗(yàn)證以及關(guān)鍵基因與臨床因素的關(guān)聯(lián)分析。本研究旨在識(shí)別與銅死亡相關(guān)的腦膜瘤亞型，并篩選疾病免疫相關(guān)的關(guān)鍵基因，為深化對(duì)腦膜瘤發(fā)病機(jī)制的理解和提供新的免疫治療策略提供支持。

1數(shù)據(jù)與方法

1.1表達(dá)譜數(shù)據(jù)的獲取與預(yù)處理從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（The National Center for Biotechnology Information，NCBI）高通量基因表達(dá)（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)［9］下載了腦膜瘤相關(guān)數(shù)據(jù)集，包括GSE77259（14例腦膜瘤和3例對(duì)照）和GSE43290（47例腦膜瘤和4例對(duì)照）。GSE77259數(shù)據(jù)集使用GPL6244［HuGene1_0st］ Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array［transcript（gene） version］進(jìn)行測(cè)序，而GSE43290數(shù)據(jù)集使用GPL96［HGU133A］ Affymetrix Human Genome U133A Array。為消除數(shù)據(jù)集之間的批次效應(yīng)，使用R軟件中的sva包（version 3.34.0）［10］的ComBat函數(shù)［11］。隨后，將兩組數(shù)據(jù)合并為一組表達(dá)譜進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2篩選差異表達(dá)的銅死亡基因從Zhang等［12］的文獻(xiàn)中提取銅死亡基因，并通過(guò)與上述GEO數(shù)據(jù)集中的基因進(jìn)行匹配，篩選出腦膜瘤數(shù)據(jù)集中的銅死亡基因。隨后，使用t檢驗(yàn)分析銅死亡基因在腦膜瘤和對(duì)照樣本中的差異表達(dá)，并對(duì)這些差異表達(dá)的銅死亡基因進(jìn)行皮爾森相關(guān)性分析。

1.3無(wú)監(jiān)督聚類分析識(shí)別腫瘤亞型利用R軟件（version 3.6.1）中的ConsensusClusterPlus包（version 1.58.0）［13］，基于差異表達(dá)的銅死亡基因在腫瘤樣本中的表達(dá)值進(jìn)行一致性聚類分析。采用分層聚類方法，并以Spearman相關(guān)系數(shù)進(jìn)行聚類，以識(shí)別不同的腦膜瘤亞型。

1.4亞型間差異表達(dá)基因分析使用limma包（version 3.42.2）進(jìn)行亞型間差異表達(dá)分析，采用線性回歸和經(jīng)驗(yàn)貝葉斯方法，獲得基因的P值（P.Value）和倍數(shù)變化（FC）等信息。隨后，應(yīng)用Benjamini & Hochberg（BH）方法進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正，得到校正后的P值（adj.P.Value）。差異表達(dá)基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：adj.P.Value＜0.05和｜logFC|>0.263。

1.5亞型與腫瘤免疫微環(huán)境關(guān)聯(lián)基于亞型間差異表達(dá)基因的表達(dá)矩陣，運(yùn)用CIBERSORT算法［14］估算了22種免疫細(xì)胞在各個(gè)樣本中的相對(duì)浸潤(rùn)豐度。比較了不同亞型之間免疫細(xì)胞浸潤(rùn)比例的差異，篩選出亞型間顯著差異的免疫細(xì)胞。根據(jù)表達(dá)數(shù)據(jù)，利用ESTIMATE算法［15］分別估計(jì)了腫瘤樣本的基質(zhì)分?jǐn)?shù)和免疫分?jǐn)?shù)，這兩個(gè)分?jǐn)?shù)分別代表基質(zhì)和免疫細(xì)胞的存在。將這兩個(gè)分?jǐn)?shù)相加得到免疫微環(huán)境分?jǐn)?shù)，可用于估計(jì)腫瘤的純度。然后，比較了不同亞型之間的免疫分?jǐn)?shù)、基質(zhì)分?jǐn)?shù)、免疫微環(huán)境分?jǐn)?shù)以及腫瘤純度的差異。

1.6WGCNA篩選模塊基因WGCNA是一種分析多個(gè)樣本基因表達(dá)模式的方法，通過(guò)聚類表達(dá)模式相似的基因，并利用模塊特征值對(duì)模塊進(jìn)行劃分，分析模塊與特定性狀或表型之間的關(guān)聯(lián)，從而篩選出與性狀高度相關(guān)的模塊。從疾病亞型數(shù)據(jù)集中選擇表達(dá)量中位數(shù)絕對(duì)偏差位于TOP20%的基因進(jìn)行WGCNA分析，以篩選與免疫細(xì)胞相關(guān)的模塊基因。使用R軟件中的WGCNA包（version 1.71）［16］，以亞型間顯著差異的免疫細(xì)胞作為表型性狀，篩選疾病免疫相關(guān)的模塊基因，并提取這些模塊中的基因用于后續(xù)分析。

1.7篩選差異表達(dá)疾病免疫相關(guān)基因使用R軟件中的VennDetail包（version 1.2.0）對(duì)WGCNA模塊基因和亞型間差異表達(dá)基因進(jìn)行Venn分析，識(shí)別交集基因，即認(rèn)為這些基因是差異表達(dá)的疾病免疫相關(guān)基因。

1.8PPI網(wǎng)絡(luò)分析使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（version 11.5）［17］預(yù)測(cè)基因編碼的蛋白之間的互作關(guān)系，構(gòu)建差異表達(dá)的疾病免疫相關(guān)基因的PPI互作網(wǎng)絡(luò)。篩選閾值為homo sapiens物種，PPI分?jǐn)?shù)設(shè)定為0.4。對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，篩選出連接度大于2的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)分析。

1.9功能富集分析使用在線工具gprofiler［18］中的Functional profiling模塊，對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度大于2的基因進(jìn)行過(guò)表征分析（overrepresentation analysis，ORA）法。進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）功能和通路富集分析，包括生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular component，CC），以及reactome pathway和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）human pathway。篩選標(biāo)準(zhǔn)為BH校正后的P值小于0.05。

1.10Friends分析使用R GOSemSim包（version 2.12.1）［19］對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度大于2的基因進(jìn)行Friends分析。重新定義這些基因，計(jì)算它們之間的語(yǔ)義相似度，以識(shí)別在相互作用中可能更為重要的基因。根據(jù)語(yǔ)義相似度評(píng)分，鑒定關(guān)鍵（hub）基因。

1.11分析關(guān)鍵基因的表達(dá)情況使用t.test對(duì)關(guān)鍵基因在疾病組和對(duì)照組，以及不同亞型間進(jìn)行差異分析，進(jìn)行關(guān)鍵基因的差異表達(dá)驗(yàn)證。

1.12關(guān)鍵基因與臨床因素關(guān)聯(lián)分析基于數(shù)據(jù)集中的樣本信息，分析關(guān)鍵基因在不同臨床因素（分級(jí)和組織學(xué)）中的表達(dá)情況，以探索關(guān)鍵基因與臨床因素的關(guān)聯(lián)。

1.13Western Blot實(shí)驗(yàn)和免疫組化實(shí)驗(yàn)采集不同WHO級(jí)別腦膜瘤患者的組織樣本，經(jīng)過(guò)處理和蛋白質(zhì)提取后，通過(guò)電泳和Western Blot實(shí)驗(yàn)確定MFAP5蛋白的存在。使用驗(yàn)證過(guò)的MFAP5抗體（Abcam， AB203828，1∶1 000）和化學(xué)發(fā)光法評(píng)估MFAP5的表達(dá)，并將其與參考蛋白（GAPDH）標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以圖表和照片形式呈現(xiàn)，并進(jìn)行相應(yīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采集經(jīng)病理確認(rèn)的人腦膜瘤組織標(biāo)本。使用驗(yàn)證過(guò)的MFAP5抗體（Abcam， AB203828，1∶600）進(jìn)行免疫組化染色，根據(jù)腦膜瘤WHO級(jí)別進(jìn)行分組。通過(guò)顯微鏡觀察和數(shù)字顯微鏡圖像采集，記錄MFAP5的表達(dá)情況。使用統(tǒng)計(jì)工具分析數(shù)據(jù)，并以圖表和照片的形式呈現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，探討MFAP5在腦膜瘤中的表達(dá)。

2結(jié)果

2.1篩選差異表達(dá)的銅死亡基因從Zhang等［12］的研究中獲得19個(gè)銅死亡相關(guān)基因，通過(guò)與GEO中的腦膜瘤數(shù)據(jù)集匹配，在腦膜瘤數(shù)據(jù)集中確認(rèn)了16個(gè)銅死亡基因。進(jìn)行差異表達(dá)分析揭示，腦膜瘤與對(duì)照樣本中，其中6個(gè)銅死亡基因表現(xiàn)出顯著差異表達(dá)，包括CDKN2A、DBT、DLAT、GLS、LIAS和PDHA1（圖1A）。差異表達(dá)的銅死亡基因之間的相關(guān)性如圖1B所示，例如CDKN2A與GLS呈顯著負(fù)相關(guān)，而DLAT與PDHA1呈顯著正相關(guān)。

2.2亞型鑒定和亞型間差異表達(dá)基因識(shí)別基于前述的6個(gè)差異表達(dá)銅死亡基因在疾病樣本中的表達(dá)值，進(jìn)行了無(wú)監(jiān)督的樣本聚類分析，考慮K值在2～6的范圍內(nèi)。結(jié)果表明，選擇最優(yōu)的K值為2，即得到了兩個(gè)不同的亞型（Cluster，圖2A）。在這兩個(gè)亞型之間共識(shí)別出397個(gè)差異表達(dá)基因（圖2B）。

2.3亞型與免疫微環(huán)境關(guān)聯(lián)利用CIBERSORT算法對(duì)所有疾病樣本的表達(dá)矩陣進(jìn)行了分析，估算了各個(gè)樣本中免疫細(xì)胞的相對(duì)浸潤(rùn)豐度。在比較不同亞型中樣本的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度時(shí)，觀察到包括原始B細(xì)胞、原始CD4 T細(xì)胞、激活的記憶CD4 T細(xì)胞、活化的自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M0、靜止?fàn)顟B(tài)下的樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等8種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)豐度在亞型間存在顯著差異（圖3A）。隨后，使用ESTIMATE算法估計(jì)了亞型中腫瘤樣本的基質(zhì)分?jǐn)?shù)、免疫分?jǐn)?shù)、免疫微環(huán)境分?jǐn)?shù)和腫瘤純度。結(jié)果顯示，C2的免疫、基質(zhì)和免疫微環(huán)境分?jǐn)?shù)顯著高于C1，但腫瘤純度顯著低于C1（圖3B）。

2.4WGCNA篩選疾病免疫相關(guān)基因?yàn)榱撕Y選免疫細(xì)胞相關(guān)的關(guān)鍵模塊及基因，從疾病亞型數(shù)據(jù)集中表達(dá)量中位數(shù)絕對(duì)偏差前20%的基因，以免疫細(xì)胞作為表型構(gòu)建WGCNA網(wǎng)絡(luò)。在軟閾值（power）設(shè)為5的情況下，無(wú)標(biāo)度擬合指數(shù)即signed R^2在0.85左右，表明該網(wǎng)絡(luò)逼近無(wú)尺度分布（圖4A）。鄰接函數(shù)的均值也逐漸接近于0，呈現(xiàn)出平緩的趨勢(shì)（圖4B）。計(jì)算了基因間的鄰接性，推導(dǎo)出基因間的相似性，得到基因間的系統(tǒng)聚類樹。根據(jù)混合動(dòng)態(tài)剪切樹算法的標(biāo)準(zhǔn)，將每個(gè)基因模塊的最小基因數(shù)設(shè)為30。結(jié)果顯示，除灰色模塊外，共得到15個(gè)基因共表達(dá)模塊（圖4C）。通過(guò)分析模塊與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)MEbrown模塊與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度呈現(xiàn)較高的相關(guān)性（|r| > 0.6，P＜0.01，圖4D）。因此，選擇該模塊中的基因進(jìn)行后續(xù)分析，該模塊共包含282個(gè)基因。

2.5篩選差異表達(dá)的疾病免疫相關(guān)基因?qū)GCNA模塊基因與亞型間差異表達(dá)基因進(jìn)行了Venn圖分析，發(fā)現(xiàn)了74個(gè)共同的差異表達(dá)的疾病免疫相關(guān)基因（圖5A），為后續(xù)分析提供基礎(chǔ)。

2.6PPI網(wǎng)絡(luò)分析利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了包含45個(gè)基因和43個(gè)關(guān)系對(duì)的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖5B），并對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行了拓?fù)鋵W(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了9個(gè)具有節(jié)點(diǎn)度大于2的蛋白，包括TGFB3、LTBP1、ITGB5、IGF1、LHCGR、PRRX1、FMOD、LTBP2和MFAP5。這些高度連接的節(jié)點(diǎn)可能在疾病的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.7功能富集分析對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度大于2的基因進(jìn)行功能富集分析，揭示這些基因的潛在生物學(xué)功能。結(jié)果表明，這些基因顯著富集在多個(gè)GO功能和通路中，涵蓋了BP、MF、CC、KEGG通路和REAC通路等多個(gè)方面。在圖5C、5D中按P值排序展示了GO富集分析和通路富集分析的前5個(gè)結(jié)果。這些顯著富集的GO功能包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路（GO：BP）、含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)（GO：CC）和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分（GO：MF）等；通路富集結(jié)果包括TGFbeta信號(hào)通路（KEGG）和細(xì)胞外基質(zhì)組織（REAC）等。

2.8Friends分析采用Friends分析重新定義了PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度大于2的基因，并計(jì)算了它們之間的語(yǔ)義相似度。最終篩選出了TOP5基因作為關(guān)鍵基因，包括LTBP1、LTBP2、TGFB3、IGF1和MFAP5（圖6A）。

2.9關(guān)鍵基因的差異表達(dá)情況驗(yàn)證關(guān)鍵基因與疾病的關(guān)聯(lián)，分析了5個(gè)關(guān)鍵基因在兩個(gè)亞型之間以及在疾病和正常樣本之間的差異表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在與C1相比的C2中，這5個(gè)關(guān)鍵基因均呈顯著上調(diào)表達(dá)（圖6B）。然而，僅有TGFB3和MFAP5在疾病和正常樣本之間表達(dá)差異顯著（圖6C）。

2.10關(guān)鍵基因與臨床因素關(guān)聯(lián)分析為了研究關(guān)鍵基因與臨床因素的關(guān)聯(lián)，本研究分析了這些關(guān)鍵基因在不同臨床因素（分級(jí)和組織學(xué)）中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在不同分級(jí)中，LTBP2、IGF1和MFAP5的表達(dá)存在顯著差異（圖7A）；在不同組織學(xué)中，LTBP2和MFAP5的表達(dá)也呈現(xiàn)顯著差異（圖7B）。

2.11Western Blot 實(shí)驗(yàn)和免疫組化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證關(guān)鍵基因MFAP5在腦膜瘤臨床樣本中的表達(dá)，進(jìn)行了Western Blot實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示在不同的WHO級(jí)別腦膜瘤中，MFAP5表達(dá)在WHO Ⅰ級(jí)和WHO Ⅲ級(jí)之間以及WHO Ⅰ級(jí)和WHO Ⅱ級(jí)之間存在顯著差異，而在WHO Ⅱ級(jí)和WHO Ⅲ級(jí)之間未觀察到顯著差異（圖8A、B）。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了臨床組織樣本中關(guān)鍵基因MFAP5的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，該蛋白在不同級(jí)別腦膜瘤中表達(dá)趨勢(shì)與Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致（圖8C、D）。這些實(shí)驗(yàn)證明了MFAP5在不同腦膜瘤級(jí)別中的表達(dá)差異，為其在腦膜瘤發(fā)展中的潛在作用提供了額外支持。

3討論

腦膜瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤，其組織學(xué)分析是當(dāng)前診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn)。然而，由于腦膜瘤的形態(tài)學(xué)特征多樣，WHO組織學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)的復(fù)雜性導(dǎo)致單獨(dú)依賴組織學(xué)分析難以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)和區(qū)分不同分級(jí)的腦膜瘤［20］。在本研究中，通過(guò)探索銅死亡相關(guān)的腦膜瘤亞型及其亞型相關(guān)的關(guān)鍵基因，以拓展并完善當(dāng)前的WHO分級(jí)系統(tǒng)，為腦膜瘤的精確診斷提供更有力的依據(jù)。研究結(jié)果表明，6個(gè)銅死亡基因（如CDKN2A和GLS）在腦膜瘤和對(duì)照樣本中表達(dá)存在差異。通過(guò)對(duì)這些基因在疾病樣本中的表達(dá)值進(jìn)行共聚類，成功定義了2個(gè)銅死亡相關(guān)亞型，涉及397個(gè)差異表達(dá)基因，并展示了8種免疫細(xì)胞在亞型之間的顯著差異。以免疫細(xì)胞作為表型，進(jìn)一步篩選出與疾病免疫相關(guān)的5個(gè)關(guān)鍵基因，其中LTBP2和MFAP5在不同腦膜瘤等級(jí)和組織學(xué)中均表現(xiàn)出顯著差異。這些發(fā)現(xiàn)揭示了腦膜瘤發(fā)展過(guò)程中銅死亡相關(guān)的關(guān)鍵分子機(jī)制，為實(shí)施腦膜瘤患者的分層和個(gè)性化免疫治療提供了有益的見解。本研究為進(jìn)一步探索生物標(biāo)志物，深化對(duì)腦膜瘤的分子機(jī)制理解以及促進(jìn)更有效治療策略的制定奠定了基礎(chǔ)。

已有研究表明多種細(xì)胞死亡形式，如鐵死亡、焦亡和壞死性凋亡，是深入探索抗腫瘤治療的重要方向［21］。銅死亡作為一種新穎而獨(dú)特的細(xì)胞死亡形式，其發(fā)生受細(xì)胞內(nèi)銅的病理性積累和線粒體呼吸的調(diào)節(jié)影響。在多種癌癥中，由體內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)失衡引起的細(xì)胞死亡具有重要意義，而一些與銅相關(guān)的藥物，如喹啉和四硫鉬酸鹽，已被用于癌癥治療并展現(xiàn)出良好的抗癌活性［22］。這些研究強(qiáng)調(diào)了銅代謝和銅死亡在腫瘤進(jìn)展中的重要作用，而探索腫瘤中關(guān)鍵的銅死亡基因則可能為腫瘤治療提供新的見解。在本研究中，鑒別出6個(gè)在腦膜瘤和對(duì)照樣本中顯著差異表達(dá)的銅死亡基因，包括CDKN2A和GLS。CDKN2A（細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A）是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的關(guān)鍵基因，廣泛涉及多種癌癥，其中包括腦膜瘤［23］。最近的研究還提示，CDKN2A mRNA的增加可能是侵襲性腦膜瘤的潛在標(biāo)志物［24］。谷氨酰胺酶（glutaminase，GLS）是谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸的關(guān)鍵酶，在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［25］。據(jù)報(bào)道，GLS抑制劑CB839對(duì)腦膜瘤細(xì)胞具有下調(diào)谷氨酰胺代謝和抑制增殖的作用［28］。鑒于這些銅死亡基因在腦膜瘤中的關(guān)鍵作用，我們推測(cè)這些差異表達(dá)的銅死亡基因可能是治療腦膜瘤的重要靶點(diǎn)。

腦膜瘤呈現(xiàn)多樣的組織學(xué)特征和生物學(xué)行為，導(dǎo)致不同表型和不同臨床結(jié)果。對(duì)于這種多表型、預(yù)后不同的癌癥，采用個(gè)體化治療策略可能取得更好的治療效果，突顯了腫瘤亞型識(shí)別的臨床意義。近期，研究越來(lái)越關(guān)注銅死亡、腫瘤分型和腫瘤免疫微環(huán)境之間的關(guān)系［25］。腫瘤微環(huán)境包括非癌細(xì)胞，如免疫細(xì)胞和癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblasts，CAFs）以及這些細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和腫瘤周圍環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)成分。報(bào)道顯示，腫瘤微環(huán)境對(duì)腦膜瘤的發(fā)生和新治療方法的指定具有重要性［27］。本研究基于差異銅死亡基因在腦膜瘤樣本中的表達(dá)值，成功共聚類得到了2個(gè)銅死亡相關(guān)亞型，并發(fā)現(xiàn)在亞型間存在8種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)豐度顯著差異。例如，原始B細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M0等在C2中的浸潤(rùn)水平明顯高于C1，而原始CD4 T細(xì)胞和激活的記憶CD4 T細(xì)胞等在C2中的浸潤(rùn)水平顯著低于C1。既往研究表明，浸潤(rùn)B細(xì)胞密度與腦膜瘤復(fù)發(fā)率顯著相關(guān)［28］。NK細(xì)胞作為在抗腫瘤免疫中起關(guān)鍵作用的淋巴細(xì)胞，其在抗腦癌免疫中的潛力已在體內(nèi)和體外得到驗(yàn)證，可作為直接的抗腫瘤藥物，也可作為刺激內(nèi)源性NK細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)性療法［29］。Chen等［30］證實(shí)了腦膜瘤中存在不同程度的巨噬細(xì)胞、T、NK和B細(xì)胞的浸潤(rùn)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)C2的免疫、基質(zhì)和免疫微環(huán)境分?jǐn)?shù)顯著高于C1，但腫瘤純度顯著低于C1，暗示C2中的樣本可能比C1中樣本對(duì)免疫治療反應(yīng)更為敏感?？偟膩?lái)說(shuō)，本研究得到的兩個(gè)銅死亡相關(guān)的腦膜瘤亞型在免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫反應(yīng)方面存在差異。

WGCNA是廣泛應(yīng)用于識(shí)別與疾病表型相關(guān)的關(guān)鍵基因和機(jī)制的方法［31］。為深入探索調(diào)控兩個(gè)銅死亡相關(guān)的腦膜瘤亞型不同免疫特征的關(guān)鍵基因及其潛在機(jī)制，首先以亞型間顯著差異的免疫細(xì)胞為表型，利用WGCNA篩選疾病免疫相關(guān)的模塊并提取模塊基因，然后從WGCNA模塊基因和亞型間差異表達(dá)基因中篩選出交集基因作為差異表達(dá)的疾病免疫相關(guān)基因，隨后通過(guò)PPI和Friends分析進(jìn)一步篩選出5個(gè)關(guān)鍵基因。在這5個(gè)基因中，LTBP2在Friends分析中排名最高。LTBP2和MFAP5在腦膜瘤不同等級(jí)和不同組織學(xué)分類中都表現(xiàn)出顯著差異。LTBP2屬于潛伏TGFβ結(jié)合蛋白（LTBP）細(xì)胞外基質(zhì)蛋白家族，參與TGFβ的可用性，同時(shí)在細(xì)胞黏附中發(fā)揮作用［32］。已有報(bào)道顯示，LTBP2在復(fù)發(fā)性和高級(jí)別腦膜瘤中表達(dá)下調(diào)［33］。其他研究發(fā)現(xiàn)，LTBP2的表達(dá)與CD4+T細(xì)胞的募集相關(guān)，并與免疫治療反應(yīng)有關(guān)［34］。MFAP5是一種細(xì)胞外間質(zhì)（extracellular matrix，ECM）糖蛋白，是ECM微纖維的組成部分，在組織發(fā)育中起作用。MFAP5由間充質(zhì)間質(zhì)細(xì)胞分泌，在多種腫瘤中發(fā)揮作用，如膀胱癌、乳腺癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌［35］。靶向癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞中的MFAP5通過(guò)重塑基質(zhì)使胰腺癌對(duì)程序性細(xì)胞死亡1（programmed death protein 1，PD1）免疫化療敏感［36］。蛋白組學(xué)分析提示，在顱底腦膜瘤中Notch通路蛋白MFAP2和MFAP5顯著富集，MFAP5在WHO ⅡⅢ級(jí)腦膜瘤低表達(dá)，在WHO Ⅰ級(jí)中高表達(dá)［37］。基于LTBP2和MFAP5在不典型/惡性（WHO ⅡⅢ級(jí)）腦膜瘤低表達(dá)，良性（WHO Ⅰ級(jí)）高表達(dá)，并且這些基因富集到細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的功能和通路中，本研究推測(cè)可能存在一種潛在機(jī)制，即良性腦膜瘤的腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)形成和復(fù)雜性構(gòu)成了一個(gè)區(qū)域生態(tài)位和封閉屏障，防止腫瘤侵入周圍正常組織，形成一定程度的局部免疫狀態(tài)。而不典型/惡性腦膜瘤中細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因的低表達(dá)可能暗示著密集的間質(zhì)重塑為相對(duì)疏松狀態(tài)，為腫瘤侵入正常腦組織提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，但同時(shí)有利于免疫細(xì)胞浸潤(rùn)以及化療藥物的滲透。盡管目前尚無(wú)銅死亡與LTBP2或MFAP5相關(guān)性的研究，本研究推測(cè)銅死亡基因可能通過(guò)調(diào)控LTBP2或MFAP5這些關(guān)鍵基因的表達(dá)，來(lái)影響腦膜瘤腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞外基質(zhì)的形成和作用，從而介導(dǎo)腦膜瘤對(duì)免疫治療的反應(yīng)。

本研究聚焦于“銅死亡基因與腦膜瘤相關(guān)基因”的富集分析，雖然與腦膜瘤的病理分型直接關(guān)系有限，但這一探索具有顯著的科學(xué)意義。深入了解銅死亡基因與腦膜瘤的關(guān)系不僅為未來(lái)疾病機(jī)制研究提供關(guān)鍵信息，也有望揭示潛在的藥物靶點(diǎn)，改進(jìn)腦膜瘤治療方法的可能性。然而，值得注意的是，本研究中使用的腦膜瘤公共數(shù)據(jù)庫(kù)未包含患者的生存數(shù)據(jù)，因此無(wú)法對(duì)所獲得的差異基因進(jìn)行詳細(xì)的患者預(yù)后相關(guān)性分析。盡管成功識(shí)別了一些與腦膜瘤相關(guān)的差異基因，但在缺乏生存數(shù)據(jù)的情況下，本研究難以確切說(shuō)明這些基因是否與患者的預(yù)后有關(guān)。盡管當(dāng)前研究離實(shí)際臨床應(yīng)用可能較遠(yuǎn)，但對(duì)腦膜瘤的深入研究將有助于加深對(duì)腫瘤疾病機(jī)制的理解，為未來(lái)的研究提供基礎(chǔ)。當(dāng)前的研究模式雖主要集中于富集分析，但所獲得的結(jié)果可能為未來(lái)的臨床研究提供寶貴線索，有助于鑒定新的治療靶點(diǎn)或藥物，從而改善腦膜瘤的治療方法，為患者提供更有效的治療方案。

總體而言，本研究共篩選到2個(gè)銅死亡相關(guān)的腦膜瘤亞型，這兩個(gè)亞型呈現(xiàn)不同的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫反應(yīng)。在兩個(gè)亞型之間篩選到免疫相關(guān)的關(guān)鍵基因，如LTBP2和MFAP5，可能是銅死亡調(diào)控腦膜瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制。這些基因有望成為新的腦膜瘤診斷生物標(biāo)志物或者免疫治療靶點(diǎn)，為腦膜瘤的免疫治療提供了新的啟示。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

［參 考 ?文 ?獻(xiàn)］

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