張穎，石婷瑞，曹瑞，潘文秋，宋衛(wèi)寧，王利，聶小軍

ICARDA引進-小麥苗期抗旱性的全基因組關聯(lián)分析

張穎1，石婷瑞1，曹瑞1，潘文秋1，宋衛(wèi)寧1，王利2，聶小軍1

1西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院/作物抗逆與高效生產(chǎn)全國重點實驗室，陜西楊凌 712100；2山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所/養(yǎng)分資源高效利用全國重點實驗室，濟南 250100

【目的】干旱是限制小麥生產(chǎn)最主要的逆境因子之一。挖掘、鑒定優(yōu)異抗旱新種質(zhì)、克隆抗旱新基因，以期豐富我國小麥抗旱遺傳基礎，為小麥抗旱遺傳改良提供材料?！痉椒ā恳?98份從國際干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究中心（ICARDA）引進的抗旱種質(zhì)為材料，采用PEG-6000模擬干旱方法，通過調(diào)查苗期干旱和正常條件下的地上部鮮重、地下部鮮重、生物量和根冠比4個性狀，鑒定、評價其抗旱性，結合660K SNP芯片對其抗旱性進行全基因組關聯(lián)分析，發(fā)掘抗旱性相關染色體區(qū)間及關聯(lián)位點，結合干旱脅迫下根等多組織的表達量數(shù)據(jù)，篩選抗旱性相關基因，最后以強抗旱性品系IR214和干旱敏感品系IR36為材料，利用qRT-PCR方法對候選基因進行驗證，并分析關鍵候選基因的優(yōu)異單倍型?！窘Y果】干旱脅迫下，小麥的生長發(fā)育受到顯著抑制，各性狀表型均顯著低于正常對照，不同小麥品系間也表現(xiàn)出顯著差異，4個性狀在2種處理下均呈現(xiàn)正態(tài)分布，變異系數(shù)為0.363—0.760，多樣性指數(shù)為0.310—0.400；基于加權隸屬函數(shù)值（值）綜合評價各個品種的抗旱性，發(fā)現(xiàn)品系IR214的值最大，為0.851，其次為IR92、IR213、IR235和IR218等，它們可作為新的優(yōu)異抗旱種質(zhì)；在此基礎上，通過全基因組關聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS），共檢測到102個與4個性狀抗旱系數(shù)顯著關聯(lián)的SNP位點，表型變異解釋率范圍為1.07%—38.70%，其中，與地上部鮮重相關的位點60個、地下部鮮重相關位點1個、生物量相關位點36個以及根冠比相關位點5個；基于基因組注釋信息，篩選到31個抗旱相關基因，結合根等不同組織的RNA-seq數(shù)據(jù)，篩選出4個抗旱候選基因，對差異表達的候選基因進行qRT-PCR驗證，鑒定到2個關鍵抗旱候選基因；最后，分析候選基因的單倍型效應，發(fā)現(xiàn)的AX-86174509位點，2種基因型在抗旱性狀上具有顯著差異，是潛在的功能位點。【結論】共檢測到102個與苗期抗旱性顯著關聯(lián)的位點，篩選出和2個關鍵候選基因，的AX-86174509位點是潛在的抗旱性功能位點。

小麥；干旱脅迫；660K SNP芯片；全基因組關聯(lián)分析；候選基因

0 引言

【研究意義】小麥（L.）是世界三大糧食作物之一，其種植面積約占全世界總耕作面積的17%，是全球近30%人口的主糧[1]。在我國，小麥也是最重要的糧食作物之一，常年種植面積約2 400萬hm2，年產(chǎn)量超過1億t[2]。小麥的持續(xù)增產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)對保障我國乃至全世界糧食安全有著舉足輕重的影響。隨著全球氣候變化，極端天氣日益頻發(fā)，水資源短缺、降雨不均、季節(jié)性干旱等問題日趨嚴峻。干旱已成為限制小麥生產(chǎn)最重要的逆境因子。干旱抑制小麥的生長，會導致小麥株高減小、葉片失水、氣孔關閉、凈光合速率和氣孔導度下降、葉面積減小，從而引起減產(chǎn)[3]。同時，干旱還會干擾小麥的生理和代謝過程，使其更容易受到病蟲害的侵害。據(jù)統(tǒng)計，每年因干旱而造成的小麥產(chǎn)量損失超過其他逆境和病蟲草害的總和[4]。苗期是小麥生長發(fā)育的關鍵時期，通過影響器官形態(tài)建成來影響整個生長發(fā)育進程。干旱脅迫下，小麥幼苗的許多形態(tài)和生理特征發(fā)生改變，包括葉片變小、根長縮短和滲透勢降低等[5]。同時，干旱也會影響小麥地上部與地下部生物量[6-7]。生物量一直是評價植物抗旱性的重要指標之一[8]。干旱脅迫下植物的根冠比會升高[9]，高根冠比的小麥可以吸收深層土壤水分，從而保證較高的蒸騰效率以適應干旱脅迫[10]。因此，系統(tǒng)解析小麥苗期抗旱性的遺傳基礎，鑒定、發(fā)掘優(yōu)異苗期抗旱新基因，對小麥抗旱遺傳改良、保障糧食安全具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】小麥抗旱性是一個復雜的數(shù)量性狀，涉及諸多基因和多種機制的協(xié)同作用。全基因組關聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）是一種以連鎖不平衡為基礎，通過群體分析，在全基因組水平上鑒定與性狀相關聯(lián)的標記或基因的研究策略，為數(shù)量性狀基因挖掘和復雜性狀的遺傳基礎解析提供了不可或缺的重要方法[11]。前人圍繞小麥苗期抗旱性的GWAS分析和遺傳基礎解析已開展了大量工作。Maulana等[12]以200個代表性的冬小麥品系組成的自然群體為材料，基于90K SNP芯片的全基因組關聯(lián)分析，共鑒定了12個穩(wěn)定的苗期抗旱性相關SNP位點，分別位于1B、2A、2B、2D、3A、3B、3D、4B、5A、5B、6B和7B染色體。王博華等[13]利用90K SNP芯片對300份國內(nèi)外小麥品種（系）基于最長根長、根總長、根表面積、根體積、根平均直徑、根尖數(shù)、根鮮重和根干重等8個性狀的苗期抗旱系數(shù)進行全基因組關聯(lián)分析，共鑒定到41個顯著關聯(lián)位點，并篩選到11個與小麥抗旱性相關的候選基因。同時，基于GWAS分析等正向遺傳學分析，多個小麥抗旱關鍵基因也被鑒定和克隆，包括[14]、[15]、[16]等。【本研究切入點】盡管前人已對小麥抗旱性相關位點及其候選基因發(fā)掘開展了較多研究，但我國小麥遺傳基礎較為狹窄，基因同質(zhì)化較高，迫切需要加強新抗旱種質(zhì)和基因的發(fā)掘和利用，以豐富我國小麥抗旱基因資源、擴寬遺傳基礎?！緮M解決的關鍵問題】本研究以引自國際干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究中心的198份優(yōu)異抗旱小麥品種（系）為材料，利用PEG600模擬干旱方法，調(diào)查、統(tǒng)計其苗期地上部鮮重、地下部鮮重、生物量、根冠比等4個指標來評價其抗旱性，篩選優(yōu)異抗旱種質(zhì)；在此基礎上，結合660K SNP芯片進行苗期抗旱性的全基因組關聯(lián)分析，發(fā)掘新的小麥苗期抗旱性相關SNP位點，鑒定其候選基因，以期為小麥抗旱遺傳改良奠定材料基礎，為其分子設計育種提供有用標記信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為198份小麥品種與育種中間材料組成的關聯(lián)分析群體，由西北農(nóng)林科技大學宋衛(wèi)寧教授從國際干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究中心的種質(zhì)基因庫引進，并由西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院植物基因組學課題組保存。

1.2 試驗設計及表型調(diào)查

2020年3月中旬，于西北農(nóng)林科技大學科研溫室進行室內(nèi)水培試驗，試驗采用完全隨機設計，首先，選取大小均勻一致、籽粒完整飽滿的種子30粒，用75%乙醇浸泡3 min，再用2%次氯酸鈉消毒3次，隨后用雙蒸水沖洗3—5次，洗去種子表面殘留的次氯酸鈉，將種子置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中萌發(fā)，待其露白，長至一葉一心期時，選取大小長勢一致的幼苗移至水培容器中，每個水培盆種24個品種，每個品種種植6株，設置對照組和處理組，3次生物學重復，隨機區(qū)組設計。每個容器加20 ml Hoagland營養(yǎng)液，利用氧氣泵通氣，每3天更換一次Hoagland營養(yǎng)液。待幼苗長至兩葉一心期時，加入PEG6000進行模擬干旱脅迫，在干旱處理時，濃度隨時間逐級遞加至最終濃度為19.2%，脅迫處理21 d后進行表型調(diào)查。同時，以未添加PEG6000的Hoagland營養(yǎng)液作對照處理。

表型調(diào)查指標包括地上部鮮重、地下部鮮重、生物量和根冠比，具體方法為收獲正常和干旱處理植株的地上部和地下部，采用分析天平稱量鮮重，生物量為地上部與地下部鮮重之和，根冠比為地下部鮮重與地上部鮮重的比值。3次生物學重復。

1.3 表型數(shù)據(jù)分析

利用Excel對地上部分鮮重、地下部分鮮重、生物量和根冠比的觀測值進行整理，并計算每個材料的抗旱系數(shù)。利用隸屬函數(shù)法將每個指標的抗旱系數(shù)轉換為隸屬函數(shù)值。為了確定每個指標在計算抗旱系數(shù)中的權重，將每個指標的變異系數(shù)與其他指標的變異系數(shù)進行比較，并計算其占比作為權重。最后，計算每個材料在各重復下的加權隸屬函數(shù)值（值）[17]。

抗旱系數(shù)=干旱脅迫測定值/對照處理測定值

(X)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，X為各供試材料基于鑒定指標的抗旱系數(shù)，Xmax、Xmin分別為供試材料中X的最大值和最小值，(X)為各供試材料X的隸屬函數(shù)值，CV為各供試材料(X)的變異系數(shù)，W表示CV在總變異中所占比率。

1.4 基因型測序分型

從實驗室前期數(shù)據(jù)中提取198份引進材料的660K SNP芯片基因分型信息[18]。對獲得的198份材料的基因型數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，以缺失率（miss）＜0.2、最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.05為標準過濾篩選，最終得到319 800個高質(zhì)量的SNP標記位點用于后續(xù)分析。采用Power Marker V3.25軟件分析參試材料的遺傳多樣性和多態(tài)性信息含量（polymorphic information content，），=1-∑(P)2（P表示位點的第個等位變異出現(xiàn)的頻率）。利用Admixture 1.3.0軟件進行群體結構分析，設置K=1—10，每個K值重復5次；利用PopLDdecay軟件計算其衰減距離（linkage disequilibrium，LD）。

1.5 全基因組關聯(lián)分析

基于篩選獲得的高質(zhì)量SNP標記，以198份小麥品種4個指標計算的抗旱系數(shù)為表型，利用TASSEL v5.0軟件中的MLM混合線性模型進行全基因組關聯(lián)分析，顯著關聯(lián)閾值估計為＜0.01/N，N為有效SNP個數(shù)，判定SNP標記與目標性狀關聯(lián)的顯著性，利用R語言繪制關聯(lián)分析結果的曼哈頓圖和Q-Q圖。

1.6 候選基因篩選

根據(jù)從Ensemble plants數(shù)據(jù)庫（http://plants.ensembl.org/index. html）下載基因注釋信息，結合LD區(qū)間，篩選候選基因。從SRA公共數(shù)據(jù)庫下載中國春小麥干旱脅迫下根、葉、冠、孕穗期、開花、籽粒形成和花藥分化等多個組織和階段的轉錄組數(shù)據(jù)[19]（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA369686），使用fastp v0.21.0去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，由HISAT2 v2.1.0將序列比對至中國春參考基因組（IWGSCv2.1），利用samtools v1.3.1進行排序并構建索引，由stringtie v2.1.4組裝轉錄本，并統(tǒng)計基因豐度表達，使用R包DESeq2 v1.31.0進行差異基因分析，選取顯著差異表達的基因為作物抗旱性候選基因（差異倍數(shù)＞2且＜0.05）。為驗證關鍵候選基因，以抗旱性最強的IR214和干旱最敏感的IR36為材料，收集其在對照和20% PEG條件下分別處理0、6、12、24和48 h的葉片樣本，提取RNA并反轉錄，對關鍵候選基因進行qRT-PCR驗證。根據(jù)驗證后的關鍵候選基因中與干旱耐受性顯著關聯(lián)的SNP位點將供試材料分為2類（僅選擇純合基因型），并使用檢驗分析基因型對表型的效應。使用R包ggplot2 v3.4.1繪制箱線圖。

2 結果

2.1 ICARDA小麥苗期抗旱性的鑒定

通過調(diào)查和比較198份引進小麥種質(zhì)在PEG6000模擬干旱和正常對照條件下的地上部鮮重、地下部鮮重、生物量和根冠比4個性狀（圖1-A—D，附表1），發(fā)現(xiàn)干旱脅迫會顯著抑制小麥的生長發(fā)育、降低苗期生物量。正常條件下的地上部鮮重為0.216—3.029 g，而干旱脅迫下的地上部鮮重為0.187—2.495 g；正常和干旱脅迫下的地下部鮮重分別為0.118—1.368 g和0.116—1.114 g，正常和干旱脅迫下的生物量分別為0.389—4.397 g和0.303—3.608 g。與正常條件相比，干旱處理導致所有品系的根冠比增加，正常條件下的根冠比為0.271—0.917，而干旱脅迫下其變異范圍為0.357—1.512。各個性狀均表現(xiàn)出較大的變異，變異系數(shù)為0.363—0.760，表明該群體具有豐富的遺傳變異和遺傳多樣性。相關性分析表明，地上部鮮重與地下部鮮重、生物量存在較強的相關性，且表現(xiàn)為正相關，地上部鮮重與根冠比呈顯著負相關，地下部鮮重與根冠比存在顯著正相關，生物量與根冠比呈顯著負相關。其中，地上部鮮重與生物量相關性最高（=0.940）。使用地上部鮮重抗旱系數(shù)、地下部鮮重抗旱系數(shù)、生物量抗旱系數(shù)和根冠比抗旱系數(shù)的加權隸屬函數(shù)值（值）綜合評價各個品種的抗旱性，鑒定到5個優(yōu)異的強抗旱種質(zhì)，其中品系IR214的值最大，為0.851，其次為IR92、IR213、IR235和IR218等。

2.2 SNP多態(tài)性及分布

根據(jù)小麥660K SNP芯片的基因分型并進行質(zhì)控，篩選出可供后續(xù)關聯(lián)分析用的高質(zhì)量位點319 800個，A、B和D亞基因組上的SNP數(shù)目分別為122 213（38.21%）、152 155（47.58%）和37 828（11.83%），其中，A、B亞基因組的多態(tài)性基本相同，但D亞基因組的多態(tài)性遠低于A和B（表1）。21條染色體中，3B染色體上的SNP標記數(shù)目最多（40 010個），4D染色體上的SNP標記數(shù)目最少（1 954個）。3個染色體組的表現(xiàn)為A（0.374）＞B（0.368）＞D（0.354）。

2.3 群體結構與連鎖不平衡分析

基于SNP變異位點的群體結構分析，發(fā)現(xiàn)在類群值K=9時，值最小，為0.506，表明參試材料可分成9個類群（圖2），其中，亞群3含有71個材料，是最大的類群，亞群4和亞群7材料個數(shù)最少，只有2個；亞群8和亞群9材料個數(shù)相近，分別有27和24個，而亞群5和亞群6分別含有13和15個?；赑opLDdecay，對198份小麥材料的LD衰減距離進行計算，發(fā)現(xiàn)A、B、D亞基因組的LD區(qū)間大小分別為4、5和3 Mb。

A—D：分別為正常條件與干旱脅迫下198份小麥的地上部鮮重（SFW）、地下部鮮重（RSW）、生物量（BIO）和根冠比（RSR）性狀的頻率分布及比較；E：干旱脅迫對小麥品種（系）的抑制情況；F：地上部鮮重、地下部鮮重、生物量和根冠比4個指標的抗旱系數(shù)的加權隸屬函數(shù)值（D值）的頻率分布和相關性矩陣。***代表P＜0.001的極顯著差異。下同

A：群體分群K值的交叉驗證；B：群體各樣品的親緣關系

表1 SNP標記的分布、物理圖譜長度以及其多態(tài)性

2.4 干旱脅迫下小麥苗期生物量全基因組關聯(lián)分析

通過對4個性狀指標計算的抗旱系數(shù)進行關聯(lián)分析，共定位到102個與苗期抗旱相關性狀顯著關聯(lián)的標記，分布于所有21條染色體上，表型變異解釋率（）范圍為1.07%—38.70%（表2和圖3）。與地上部鮮重顯著關聯(lián)的位點有60個，主要分布于3B、5B、4A、7A等染色體，其中有10個位點分布在3B染色體，范圍為1.89%—34.66%；與地下部鮮重顯著關聯(lián)的位點僅有1個，為15.83%，位于4A染色體；與生物量顯著關聯(lián)的標記共36個，大部分分布在B亞基因組上（52.8%），其中在5B染色體上分布最多，有7個標記，范圍為2.57%—13.78%；共有5個標記與根冠比顯著關聯(lián)，其中，2個位于5B、3個位于7A，范圍為2.23%—10.59%。

2.5 抗旱性相關候選基因的預測與驗證

根據(jù)上述鑒定的抗旱性顯著關聯(lián)位點，結合亞基因組LD區(qū)間及中國春參考基因組注釋信息，共預測8 042個候選基因，其中，A亞基因組3 387個，B亞基因組3 229個，D亞基因組1 426個。進一步分析發(fā)現(xiàn)，有31個顯著位點位于基因內(nèi)部，包括8個與生物量相關的候選基因，20個與地上部鮮重相關的候選基因，這些基因可作為潛在的重要候選基因（表3）。功能注釋發(fā)現(xiàn)，它們主要參與跨膜轉運、轉錄調(diào)控、蛋白修飾、氧化還原、催化反應等生物學過程。利用公共數(shù)據(jù)庫中小麥干旱脅迫下的根、葉和莖稈的RNA-seq數(shù)據(jù)，對31個重要候選基因的表達特性進行分析，發(fā)現(xiàn)、、和等4個基因，在干旱處理下的根中相比于對照顯著差異表達（圖4-A），其中，和顯著下調(diào)表達，而和顯著上調(diào)表達。預測蛋白結構域，發(fā)現(xiàn)含有1個Pyr_redox結構域，含有SCAB等4個保守結構域，僅含有Crr6結構域，含有UPF0261和PEP_hydrolase 2個結構域（圖4-B），推測它們可能是參與調(diào)控小麥抗旱性的重要候選基因。

表2 苗期抗旱相關性狀顯著關聯(lián)的SNP位點及其表型貢獻率

SFW：地上部鮮重；RFW：地下部鮮重；BIO：生物量；RSR：根冠比。下同

SFW: Shoot fresh weight; RFW: Root fresh weight; BIO: biomass; RSR: Root-shoot ratio. The same as below

A：地上部鮮重（SFW）、地下部鮮重（RFW）、生物量（BIO）和根冠比（RSR）曼哈頓圖；Un：未知染色體；B：地上部鮮重（SFW）、地下部鮮重（RFW）、生物量（BIO）和根冠比（RSR）QQ圖

表3 抗旱性相關候選基因的預測

最后，對篩選到的4個抗旱性重要候選基因的表達特性進行驗證，發(fā)現(xiàn)在抗旱品系中表達量呈先降低再升高的趨勢，在干旱脅迫6 h時的表達量值最低、48 h時最高，而在敏感品系中，其表達呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢，在干旱脅迫6 h時表達量最高、48 h時的表達量最高（圖5-A）。同時，在干旱脅迫下也顯著差異表達，且在抗旱和旱敏感材料表現(xiàn)出相反的表達模式（圖5-B），而其他2個候選基因在干旱脅迫差異不顯著，暗示和是抗旱性關鍵候選基因。

A：候選基因的表達量；DR：干旱處理條件下的根，CR：對照處理條件下的根，DL：干旱處理條件下的葉，CL：對照處理條件下的葉，DC：干旱處理條件下的莖干，CC：對照處理條件下的莖干。B：關鍵基因的蛋白結構域

2.6 抗旱性關鍵候選基因的單倍型分析

通過對和2個關鍵候選基因的單倍型進行分析（圖6）。發(fā)現(xiàn)這兩個基因在供試材料中均存在2種單倍型，但的2個單倍型在4個性狀的抗旱系數(shù)上均沒有顯著差異；而的AX-86174509位點2種基因型在生物量和地上部鮮重抗旱系數(shù)上存在顯著差異，其中，有112個材料的基因型為C，86個材料的基因型為A，其中A基因型抗旱性顯著高于C基因型，是抗旱性相關優(yōu)異等位變異。

圖5 基于qRT-PCR分析的抗旱性關鍵候選基因的表達模式分析

*代表P＜0.05的顯著差異

3 討論

3.1 小麥苗期抗旱性的鑒定

苗期是小麥生育期中形態(tài)和器官建成的關鍵階段，小麥苗期形態(tài)建成對生長發(fā)育后期起重要作用，并最終影響產(chǎn)量，所以苗期被認為是干旱脅迫的關鍵階段[20]。干旱脅迫下，植株生物量、葉綠素含量、根冠比均受到了影響[21]。本研究中，198份小麥品系的地上部鮮重、地下部鮮重、生物量含量與正常處理相比均呈下降趨勢，表明在PEG滲透脅迫下，小麥為吸收水分使水勢降低，營養(yǎng)物質(zhì)運輸?shù)礁繙p少，進而影響地上部分正常的生長發(fā)育，出現(xiàn)生長受阻情況，此時生物量、地上部鮮重、地下部鮮重等下降。在干旱脅迫下，根冠比的干旱系數(shù)呈現(xiàn)升高的趨勢，可能是在干旱環(huán)境中，植物面臨水分的限制和脅迫，為了增加水分吸收能力和減少水分蒸散。通過增加根冠比，植物可以增加根系的生長和發(fā)育，提高水分吸收能力。根冠比的升高可以幫助植物在干旱條件下更有效地利用有限的水分資源，從而增強其抗旱能力。本研究發(fā)現(xiàn)地上部鮮重與地下部鮮重、生物量顯著正相關，地上部鮮重與根冠比呈現(xiàn)顯著負相關，地下部鮮重與根冠比呈顯著正相關，而生物量與根冠比呈現(xiàn)顯著負相關，表明這些性狀之間可能發(fā)揮互促作用，對干旱脅迫下的小麥生長發(fā)育產(chǎn)生一定程度的影響。研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫誘導大豆幼苗對地上部分生物量的抑制作用增加，進而導致根冠比增加，從而影響生理代謝過程，以抵抗或降低干旱脅迫造成的危害[22]。本研究通過正常和干旱脅迫條件下測定指標的抗旱系數(shù)以及各個抗旱系數(shù)組成的加權隸屬函數(shù)值值來評價小麥對干旱的耐受性[23]，可反映不同材料的綜合耐性。本研究供試材料存在廣泛的表型變異，根據(jù)耐受性值，鑒定發(fā)掘了IR214、IR92、IR213、IR235和IR218共5個干旱耐受性強的小麥材料，為抗旱小麥遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新奠定了材料基礎。

3.2 小麥苗期抗旱性的全基因組關聯(lián)分析

隨著高通量測序和基因芯片技術的快速發(fā)展，全基因組關聯(lián)分析成為一種快速簡便分析復雜性狀遺傳變異的方法，在動植物中廣泛應用[24]?；旌暇€性模型是全基因組關聯(lián)分析中降低假陽性的最好方法之一[25]。本研究采用MLM混合線性模型對198份供試材料的小麥苗期各干旱性狀的抗旱系數(shù)進行了全基因組關聯(lián)分析，共檢測到102個與基于不同生物量性狀的抗旱系數(shù)顯著關聯(lián)的SNP位點，其中49個位點在B亞基因組，40個位點在A亞基因組，剩下的13個在D亞基因組，表明B亞基因組攜帶了較多的抗旱相關位點。VosS-Fels等[26]利用全基因組關聯(lián)分析鑒定了多個與小麥地上部和地下部生物量相關位點，其中在5B染色體鑒定到一個主效位點可顯著促進根系生長，從而提高了根系生物量。BEYER等[27]通過全基因組關聯(lián)分析，在1A、2A、3B、5B、6A和7B染色體上鑒定多個與小麥根系生物量顯著相關的位點。本研究鑒定發(fā)掘的多個位點與前人發(fā)掘的根系生物量位點相近，表明本結果的可靠性。此外，鑒定發(fā)掘的這些位點既與小麥根部生物量相關，同時也與小麥苗期抗旱性相關，它們可能通過控制小麥根系發(fā)育進而參與對干旱的響應[28]，這為進一步挖掘和鑒定同時調(diào)控根系發(fā)育和抗旱性的多效性基因奠定了基礎。

3.3 抗旱候選基因的預測與篩選

本研究通過GWAS分析初步篩選到31個潛在的小麥抗旱性候選基因，基于表達譜數(shù)據(jù)，進一步篩選出、、和0等 4個重要候選基因。位于1A染色體，是一種二氫硫辛酰胺脫氫酶（dihydrolipoyl dehydrogenase，DLD），是植物中重要的抗氧化酶之一。研究發(fā)現(xiàn)線粒體二氫硫辛酰胺脫氫酶是參與三羧酸循環(huán)、光呼吸和支鏈α酮酸降解的幾種多酶系統(tǒng)的組成部分，在擬南芥中過表達可以改善光合作用，進而改善生物量的積累[29]。5B染色體上的是一種肌動蛋白結合蛋白，與細胞膜構成相關，同時可參與調(diào)節(jié)氣孔運動，含有與SCAB1相似的結構域。研究發(fā)現(xiàn)氣孔閉合相關的肌動蛋白結合蛋白1（stomatal closure-related actin binding protein1，SCAB1）與磷脂酰肌醇3-磷酸（phosphatidylinositol 3-monophosphate，PI3P）特異性結合，可以通過抑制SCAB1的寡聚化來參與調(diào)節(jié)擬南芥氣孔閉合[30]。在干旱條件下，植物通過調(diào)節(jié)氣孔的開閉來限制蒸騰作用，減少水分的流失，提高水分利用效率來增強抗旱性。位于7B染色體，具有催化酶活性，含有PEP_hydrolase蛋白，參與磷酸烯醇丙酮酸代謝途徑。在煙草中研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下煙葉中的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶含量顯著增加，參與到了煙葉干旱應激反應調(diào)節(jié)[31]。Caruso等[32]研究了干旱和高溫條件下小麥幼苗的蛋白質(zhì)組變化，發(fā)現(xiàn)了12種上調(diào)和24種下調(diào)蛋白，它們主要參與糖酵解、活性氧去除、氨基酸合成和卡爾文循環(huán)。研究表明，抗旱性與小麥中蛋白質(zhì)的表達之間存在非常密切的關系，研究發(fā)現(xiàn)含玉米CPEPC的轉基因小麥植株具有更高的抗旱性[33]。含有Crr6蛋白結構域，前人研究發(fā)現(xiàn)Crr6蛋白在植物光合作用中起重要作用，通過影響在葉綠體中的組裝來影響植物的光合作用[34]。最后，基于qRT-PCR驗證結果，證實和是抗旱性關鍵候選基因，且顯著關聯(lián)位點AX-86174509的2種單倍型在生物量和地上部分鮮重兩個性狀的抗旱性上存在顯著差異，可能是與抗旱性狀相關的關鍵位點，這為進一步深入探究不同基因型對抗旱性的影響及其潛在分子機制奠定了基礎。

4 結論

通過苗期抗旱性鑒定，發(fā)掘了5個強抗旱種質(zhì)?；?60K SNP芯片的全基因關聯(lián)分析，獲得102個與抗旱性狀顯著關聯(lián)的SNP位點，預測到31個重要候選基因，它們主要參與轉錄調(diào)控、蛋白修飾、氧化還原等過程，從而調(diào)節(jié)小麥的抗旱性。結合轉錄組表達譜分析，篩選到和2個關鍵候選基因，其中，的2種單倍型在生物量和地上部分鮮重的抗旱系數(shù)上存在顯著差異，是抗旱性相關功能位點。

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Genome-wide association study of drought tolerance at seedling stage in ICARDA-introduced wheat

ZHANG Ying1, SHI TingRui1, CAO Rui1, PAN WenQiu1, SONG WeiNing1,WANG Li2, NIE XiaoJun1

1College of Agronomy, Northwest A&F University/State Key Laboratory for Crop Stress Resistance and High-Efficiency Production, Yangling 712100, Shaanxi;2Institute of Agricultural Resources and Environment, Shandong Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Nutrient Use and Management, Ji’nan 250100

【Objective】Drought is one of the most destructive environmental stresses limiting wheat production. The novel germplasm with excellent drought tolerance as well as their candidate loci were identified and characterized to enrich the genetic basis of drought tolerance and lay a material foundation for wheat genetic improvement in China. 【Method】In this study, the drought tolerance of 198 wheat accessions introduced from International Dry Area Agriculture Research (ICARDA) were investigated at seedling stage through hydroponic method with PEG6000 simulating drought. Drought tolerance index (DTI) was calculated using the shoot fresh weight, root fresh weight, total biomass and root-shoot ratio, respectively. Genome-wide association analysis was performed using 660K SNP array genotyping to obtain the SNP loci and chromosome regions associating with drought tolerance index. Combined with the expression patterns in root and other tissues, the potential candidate genes were identified, and then they were further verified by qRT-PCR approach with the most drought-tolerant accession IR214 and the most drought-sensitive accession IR36 as materials. Finally, the excellent haplotypes of key candidate genes were analyzed. 【Result】Compared to normal control condition, the growth and development of wheat were significantly impaired under drought treatment. There were also significant phenotypic variations among different accessions with all of the four traits displayed normal distribution. The coefficient of variation ranged from 0.363 to 0.760 with genetic diversity from 0.310 to 0.400. Using the weighted membership function value (value), the drought tolerance of these accessions was evaluated. Results showed that accession IR214 had the highestvalue with 0.851, followed by IR92, IR213, IR235, and IR218, which could be considered as the novel excellent drought-tolerance germplasm. Furthermore, through genome-wide association study (GWAS) analysis, a total of 102 loci were significantly associated with the DTI values based on these four traits, with the phenotypic variation explained value () from 1.07% to 38.70%, of which 60 loci were associated with above-ground fresh weight, 1 locus associated with underground fresh weight, 36 loci associated with biomass and the remaining 5 loci associated with root-shoot ratio. Then, 31 candidate genes were predicated based on genomic annotation information and LD block. Combined with the expression patterns of them in roots and other tissues, 4 candidates displaying differential expression between CK and drought conditions were obtained. Finally, the expression levels of these 4 candidates were further verified by qRT-PCR method with the most drought- tolerant accession IR214 and the most drought-sensitive accession IR36 as materials to obtain two key candidates associating with drought tolerance. Additionally, their haplotype effects were investigated. It was found that the different genotypes of AX-86174509 locus ingene showed significant differences in drought tolerance, which might be considered as a causal locus.【Conclusion】Totally, 102 loci and 2 key candidate genes (and) underlying drought tolerance at seedling stage were detected in ICARDA-introduced wheat, and AX-86174509 inwas a potential functional locus.

wheat; drought stress; 660K SNP array; genome-wide association analysis; candidate genes

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.09.004

2023-07-12；

2023-09-18

國家自然科學基金（U22A20457）、國家重點研發(fā)計劃（2021YFD1900190）

張穎，E-mail：yingz99040001@gmail.com。通信作者王利，E-mail：wangli2630000@hotmail.com。通信作者聶小軍，E-mail：small@nwsuaf.edu.cn

（責任編輯 李莉）