脯氨酰內(nèi)肽酶水解不同來源畜禽骨膠原蛋白的特性分析

周嬌嬌，郭玉杰，齊立偉，張鴻儒，李 娟，張春暉

（中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點實驗室，北京 100193）

我國每年因屠宰加工產(chǎn)生1 700萬 t骨副產(chǎn)物，以雞骨、豬骨、牛骨為主[1]。目前畜禽骨資源整體利用率不足總產(chǎn)量的10%，大部分被廢棄，造成了極大的資源浪費和嚴重的環(huán)境污染[2]。畜禽骨中富含膠原蛋白，約占其總蛋白質(zhì)的90%[3]，是制備功能性骨源食品的重要原料，應(yīng)用潛力巨大。畜禽骨膠原蛋白主要以I型膠原蛋白為主，由兩條α1和一條α2鏈組成右手超螺旋結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量高達300 kDa[4]，無法直接被人體吸收利用。實驗室前期研究表明，以骨膠原蛋白為原料制備功能活性肽是實現(xiàn)骨蛋白深加工、資源化、功能化及高效利用的主要方法[1,5]。Ye Mengliang等[6]研究發(fā)現(xiàn)，將膠原蛋白水解后獲得的牦牛骨膠原蛋白肽具有促進成骨細胞增殖的作用。目前，制備骨膠原蛋白肽的方法主要包括酶解法、發(fā)酵法和化學法（酸水解和堿水解）。與化學法相比，酶法制備骨膠原蛋白肽的條件溫和、水解過程對氨基酸破壞較小、安全性高。與發(fā)酵法相比，酶法不用進行復(fù)雜的菌株篩選過程[7]。利用蛋白酶水解膠原蛋白制備生物活性肽，不僅可以保持水解物的營養(yǎng)質(zhì)量，還能獲得確定的肽類特征。

目前用于骨膠原蛋白肽的商品酶有堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶等。白恩俠等[8]用2.5%的胰酶酶解高溫蒸煮后的牛骨溶液，經(jīng)分離除雜后制得分子質(zhì)量小于7 000 Da的骨小肽。劉振鋒等[9]使用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步水解魷魚皮獲得分子質(zhì)量基本小于3 000 Da的膠原蛋白肽。但采用商品酶水解膠原蛋白的效果受底物結(jié)構(gòu)影響較大，蛋白酶水解法只會分解膠原蛋白中特定結(jié)構(gòu)的肽鍵，導(dǎo)致膠原蛋白水解不徹底[10]。脯氨酰內(nèi)肽酶（prolyl endopeptidase，PEP）（EC 3.4.21.26）又稱脯氨酰寡肽酶，是一種新型絲氨酸肽酶家族水解酶，屬于蛋白內(nèi)切酶，能夠特異性識別底物肽鏈中的脯氨酸殘基并進行酶解切割。畜禽骨膠原蛋白氨基酸組成中脯氨酸占比高達15%，僅次于甘氨酸[11]。脯氨酸屬于亞氨基酸，常見的蛋白內(nèi)切酶無法水解脯氨酸形成的肽鍵，導(dǎo)致骨膠原蛋白底物水解效率較低[12]。PEP能夠特異性水解脯氨酸羧基端肽鍵，從而特異性得到大量小分子肽[13]。目前，有關(guān)PEP在食品領(lǐng)域的應(yīng)用主要集中在奶酪、烘焙和啤酒生產(chǎn)過程?？党琜14]研究發(fā)現(xiàn)添加PEP可以降低奶酪的苦味；烘焙過程中PEP能夠加速面粉中富含脯氨酸的谷蛋白降解，從而降低面包中谷蛋白免疫原性；在啤酒釀造過程中添加PEP能夠水解谷蛋白使啤酒澄清[15-16]。基于骨膠原蛋白氨基酸組成中脯氨酸含量高這一特點，PEP非常適合作為酶解骨膠原蛋白的候選用酶，但是目前有關(guān)PEP在膠原蛋白酶解方面的研究鮮見報道。

本研究以牛骨膠原蛋白（bovine bone collagen，BBC）、豬骨膠原蛋白（porcine bone collagen，PBC）、雞骨膠原蛋白（chicken bone collagen，CBC）為原料，解析不同骨膠原蛋白氨基酸序列特點，預(yù)測PEP潛在的酶解作用位點，通過PEP對3 種骨膠原蛋白進行酶解，測定3 種骨膠原蛋白水解液的分子質(zhì)量分布，觀察水解前后膠原蛋白結(jié)構(gòu)變化，探究PEP對不同物種來源骨膠原蛋白的水解效應(yīng)，以期為骨膠原蛋白肽的酶法制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三氟乙酸 國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（質(zhì)譜級）美國Thermo Fisher Scientific公司；乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、桿菌肽 北京索萊寶科技有限公司；抑肽酶、甘氨酰肌氨酸、細胞色素c 上海源葉生物科技有限公司；PEP 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Alpha 2-4 LD plus冷凍干燥器 德國Martin Christ公司；Allegra X-12型臺式高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；1260-II高效液相色譜系統(tǒng)美國Agilent公司；TSK gel G2000 SWXL色譜柱（7.8 mm×300 mm）日本Tosoh公司；XSR205DU型分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；Merlin Compact場發(fā)射掃描電鏡 德國蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 不同骨膠原蛋白的氨基酸序列分析

3 種骨膠原蛋白的氨基酸序列信息從UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）下載獲得。其中，BBC的α1鏈編號為P02453，BBC的α2鏈編號為P02465；PBC的α1鏈編號為A0A287A1S6，PBC的α2鏈編號為F1SFA7；CBC的α1鏈編號為P02457，CBC的α2鏈編號為P02467。

使用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）的ProtParam工具對3 種骨膠原蛋白兩條鏈的理化性質(zhì)進行預(yù)測，包括總平均親水性、分子質(zhì)量、不穩(wěn)定指數(shù)和脂肪族氨基酸指數(shù)。

通過BIOPEP-UWM數(shù)據(jù)庫（http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep）中的“enzyme action”程序?qū)σ阎被嵝蛄械? 種骨膠原蛋白通過PEP進行虛擬水解。

1.3.2 不同骨膠原蛋白酶解樣品制備

實驗室前期分別將牛骨、豬骨、雞骨經(jīng)堿處理、脫脂脫鈣、酶解、透析、冷凍干燥制得不同來源的膠原蛋白，3 種膠原蛋白均具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，且不溶于水[7]。為增大膠原蛋白與酶的接觸面積，將膠原蛋白剪成5 mm×5 mm×5 mm大小后置于pH 8.0的磷酸鹽緩沖液中，配制成質(zhì)量分數(shù)為0.5%的溶液，按酶底質(zhì)量比1∶50分別加入PEP，在55 ℃水浴進行酶解。分別在0、0.5、1、2、3、4、5、6 h取樣。水解結(jié)束后，將水解液于100 ℃沸水浴加熱5 min滅酶，在4 ℃、8 000 r/min條件下離心20 min，上清液經(jīng)冷凍干燥機凍干后，保存于-20 ℃以備后續(xù)分析。

1.3.3 不同骨膠原蛋白水解度測定

參考葉孟亮[7]的方法并稍加改進。分別向0.6 mL 0、0.5、1、2、3、4、5、6 h取樣的酶解液加0.4 mL體積分數(shù)1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液，調(diào)整至適宜的氨基濃度。取混合后酶解液0.25 mL，依次加入2 mL磷酸緩沖鹽、2 mL體積分數(shù)為0.1%的2,4,6-三硝基苯磺酸振蕩混勻，放入50 ℃恒溫水浴60 min，再依次向各管加入4 mL 0.1 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，振蕩使之混勻，冷卻至室溫，于420 nm波長處測定吸光度。以亮氨酸濃度（0～5.0 mmol/L）繪制標準曲線，用所測得水解液游離氨基濃度代替被裂解的肽鍵數(shù)[17]。按下式計算水解度：

式中：c2為水解后水解液中的肽鍵濃度/（mmol/L）；c1為水解前水解液中的肽鍵濃度/（mmol/L）；ρ0為膠原蛋白溶液的質(zhì)量濃度/（g/L）；htot為骨膠原蛋白中總肽鍵數(shù)（8.41 mmol/g）。

1.3.4 不同骨膠原蛋白水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布測定

采用高效液相色譜測定3 種骨膠原蛋白分別在0、2、4、6 h水解液的分子質(zhì)量分布。試樣液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，采用TSK gel G2000 SWXL色譜柱（7.8 mm×300 mm）；柱溫：40 ℃；流動相為三氟乙酸-乙腈-超純水（體積比0.1∶45∶54.9）。將樣品的進樣體積設(shè)置為10 μL，恒定梯度洗脫速率為0.5 mL/min。標準品分別為Gly-Sar（146 Da）、Gly-Gly-Tyr-Arg（451 Da）、桿菌肽（1 422 Da）、抑肽酶（6 511 Da）和細胞色素c（12 327 Da）。

1.3.5 不同骨膠原蛋白水解物的濁度測定

參考Gruppi等[18]的方法，先將樣品進行渦流處理以防止立即分離，然后使用SynergyTMHT平板閱讀器在室溫條件下讀取313 nm波長處的吸光度，表示溶液的濁度（200 μL樣品體積）。

1.3.6 不同骨膠原蛋白水解前后微觀結(jié)構(gòu)觀察

采用掃描電子顯微鏡對水解0 h和水解4 h骨膠原蛋白的微觀結(jié)構(gòu)進行掃描觀察。將水解后的膠原蛋白底物進行冷凍干燥，干燥后將其碾成粉末，粘貼在雙面碳膠帶上，再進行真空噴金處理，然后對其進行微觀結(jié)構(gòu)觀察，放大倍數(shù)設(shè)置為1 000。

1.3.7 不同骨膠原蛋白水解產(chǎn)物的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

用SDS-PAGE檢測水解前后膠原蛋白的蛋白圖譜。樣品溶解在0.5 mol/L乙酸溶液中，配制成10 mg/mL的溶液，再用高濃度NaOH溶液將樣品溶液pH值調(diào)至中性，加入等體積的上樣緩沖液混勻，100 ℃水浴5 min，冷卻至室溫，4 ℃、8 000 r/min離心2 min，取上清液即為制備好的樣品。準確移取20 μL樣品，標準蛋白Marker上樣量為5 μL。電泳采用體積分數(shù)為4%的濃縮膠和體積分數(shù)為7.5%的分離膠，濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為120 V。電泳結(jié)束后采用考馬斯亮藍快速染色液染色2 h，然后用考馬斯亮藍快速脫色液進行脫色，至背景無色，最終在凝膠成像系統(tǒng)上進行成像拍照。

1.3.8 紅外光譜分析

采用紅外光譜對水解前后膠原蛋白進行特征官能團分析，分析膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)變化。將KBr與干燥樣品（質(zhì)量比100∶1）置于瑪瑙研缽中壓成1 mm薄片，并在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)以4 cm-1的分辨率在傳輸模式下進行分析[5]。

1.3.9 圓二色光譜分析

將樣品溶于0.5 mol/L乙酸溶液中，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的溶液，在4 ℃平衡48 h，以0.1 mol/L乙酸溶液作空白對照，分別在190～260 nm范圍內(nèi)進行掃描，在25 ℃使用光程1 mm的石英池記錄圓二色光譜[19]。

1.3.10 X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）分析

XRD具體參數(shù)：在Cukα射線下，X光管電壓40 kV，管電流40 mA，5°～60°范圍內(nèi)，掃描頻率為2°/min，掃描步寬為0.02°，疊掃3 次，測定XRD圖譜[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 2022b軟件制圖。數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，采用LSD檢驗對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，在95%置信區(qū)間被認為具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種不同來源畜禽骨膠原蛋白序列分析

畜禽骨膠原蛋白以I型膠原蛋白為主，氨基酸序列具有典型的(Gly-X-Y)n結(jié)構(gòu)，其中X通常為脯氨酸[21]。3 種骨膠原蛋白中脯氨酸氨基酸含量均相對較高，其中，BBC脯氨酸占比18.5%，PBC脯氨酸占比18.7%，CBC脯氨酸占比18.5%[21]。從表1可以看出，3 種骨膠原蛋白均由兩條鏈構(gòu)成（α1鏈和α2鏈）。BBC的α1鏈由1 463 個氨基酸組成，分子質(zhì)量為138.94 kDa，α2鏈由1 364 個氨基酸組成，分子質(zhì)量為129.06 kDa；PBC的α1鏈由1 466 個氨基酸組成，分子質(zhì)量為139.30 kDa，α2鏈由1 356 個氨基酸組成，分子質(zhì)量為129.09 kDa；CBC的α1鏈由1 452 個氨基酸組成，分子質(zhì)量為137.57 kDa，α2鏈由1 363 個氨基酸組成，分子質(zhì)量為128.99 kDa。3 種骨膠原蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)均小于40。脂肪族氨基酸指數(shù)是蛋白質(zhì)脂肪側(cè)鏈氨基酸占蛋白質(zhì)總氨基酸的百分比，由丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸的含量所決定，在一定程度上反映蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，脂肪族氨基酸指數(shù)越高，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性越好[22]。由表1可知，3 種骨膠原蛋白的α2鏈穩(wěn)定性均高于α1鏈。

表1 3 種骨膠原蛋白的理化特性Table 1 Physicochemical properties of three bone collagen proteins

運用ProtScale工具（https://web.expasy.org/protscale）分別對骨膠原蛋白兩條鏈的親疏水狀況進行預(yù)測分析，如圖1所示，BBC的α1鏈氨基酸最大和最小預(yù)測值分別為2.633和-3.200，α2鏈氨基酸最大和最小預(yù)測值分別為2.467和-2.733；PBC的α1鏈氨基酸最大和最小預(yù)測值分別為2.633和-3.200，α2鏈氨基酸最大和最小預(yù)測值分別為2.467和-2.844；CBC的α1鏈氨基酸最大和最小預(yù)測值分別為2.978和-3.133，α2鏈氨基酸最大和最小預(yù)測值分別為2.689和-3.133。正值越大代表疏水性越強，負值絕對值越大代表親水性越強。該結(jié)果表明膠原蛋白的3 條單鏈均能溶于水中，這為后面3 種骨膠原蛋白的酶解實驗提供了依據(jù)。

圖1 牛骨I型膠原蛋白α1鏈（A）和α2鏈（B）、豬骨α1鏈（C）和α2鏈（D）、雞骨α1鏈（E）和α2鏈（F）疏水性測定結(jié)果Fig.1 Hydrophobicity determination of α1 chain (A) and α2 chain (B) in type I BBC,α1 chain (C) and α2 chain (D) in PBC,and α1 chain (E) and α2 chain (F) in CBC

2.2 PEP對3 種骨膠原蛋白的潛在酶切位點預(yù)測分析

通過BIOPEP-UWM數(shù)據(jù)庫對3 種骨膠原蛋白的α1鏈和α2鏈分別進行PEP酶切位點預(yù)測分析，得到理論水解度、酶切位點數(shù)和肽段總數(shù)[21]。由表2可知，3 種骨膠原蛋白的理論水解度無明顯差異，均在18%左右。BBC、PBC、CBC產(chǎn)生的肽段總數(shù)分別為517、524和521，表明PEP有潛力作為酶解骨膠原蛋白制備小分子活性肽的候選用酶。

表2 3 種骨膠原蛋白的理論水解度和酶切位點數(shù)Table 2 Theoretical hydrolysis degree and number of enzymatic cleavage sites of three collagens

2.3 PEP對不同骨膠原蛋白水解度的影響

蛋白水解度的增加意味著肽鏈長度不斷減小[23]。3 種骨膠原蛋白水解度隨時間變化關(guān)系如圖2所示。加入PEP后3 種骨膠原蛋白水解度在0～2 h顯著增加（P＜0.05），在3～6 h，CBC和BBC增加趨于平緩，PBC水解度在3～4 h仍顯著增加，4 h后也趨于平緩，直至6 h。這可能由于PEP可切割脯氨酸殘基的N-末端肽段數(shù)目不斷減少，酶在反應(yīng)體系中的活性逐漸降低以及底物和水解產(chǎn)物之間的競爭性抑制作用[24]。最終BBC、PBC和CBC在PEP水解4 h后水解度分別達到22.81%、51.35%和29.81%。相較于其他酶對膠原蛋白的水解，PEP在膠原蛋白降解方面更具優(yōu)勢，如吳敏等[25]使用中性蛋白酶和胰蛋白酶分步水解BBC，其水解度為18.34%；Wu Wenmin等[26]用堿性蛋白酶與中性蛋白酶同時水解PBC，其水解度為13.97%；周婷等[27]在超聲輔助堿性蛋酶水解雞爪膠原蛋白的優(yōu)化條件下，雞爪膠原蛋白的水解度達28.65%；符群[28]分別通過堿性蛋白酶單酶水解和堿性蛋白酶、風味蛋白酶復(fù)合酶解水解CBC，水解度分別為12.96%和19.68%。PEP對膠原蛋白進行水解得到的實際水解度比理論水解度高，可能是因為理論水解度是根據(jù)底物膠原蛋白的氨基酸序列結(jié)合PEP的底物特異性預(yù)測可能的酶解位點，推測出可能產(chǎn)生的肽段并計算其理論水解度，但是在對不同膠原蛋白實際酶解實驗中，除了要考慮底物的氨基酸序列外，還需考慮膠原蛋白的氨基酸修飾、酶解位點在二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)中的位置等影響因素，這些都將會對其水解度產(chǎn)生影響。3 種骨膠原蛋白的水解度進一步證實了PEP酶解骨膠原蛋白的應(yīng)用潛力。

圖2 不同來源骨膠原蛋白水解度Fig.2 Hydrolysis degrees of bone collagens from different sources

2.4 不同骨膠原蛋白酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布分析

蛋白肽的分子質(zhì)量與其功能活性密切相關(guān)，因此骨膠原蛋白酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布是評價其品質(zhì)的重要指標[29]。膠原蛋白肽分子質(zhì)量與生物利用度直接相關(guān)[30]。由3～9 個氨基酸殘基組成的短鏈肽被稱為低聚肽（分子質(zhì)量范圍為180～1 000 Da），人體消化吸收率高[31]。從圖3可以看出，3 種不同來源骨膠原蛋白的分子質(zhì)量差異較小，分子質(zhì)量分布呈先集中后分散的趨勢。其中，BBC水解前分子質(zhì)量主要集中在10 000 Da以上，比例為56.77%，其次為500 Da以下，比例為19.71%；水解后膠原蛋白的分子質(zhì)量多集中于500 Da以下，水解2 h的比例為84.52%，水解4 h為88.77%，水解6 h為90.13%。PBC水解前分子質(zhì)量也主要集中在10 000 Da以上，比例為50.37%，其次為5 000～10 000 Da，比例為19.03%；水解后膠原蛋白的分子質(zhì)量同樣多集中于500 Da以下，水解2 h的比例為81.53%，水解4 h為86.09%，水解6 h為87.76%。CBC水解前分子質(zhì)量多集中于10 000 Da以上，比例為51.51%，其次為500 Da以下，比例為20.33%，水解后膠原蛋白的分子質(zhì)量多集中于500 Da以下，水解2 h的比例為81.05%，水解4 h為85.67%，水解6 h為87.42%。水解0 h與水解2、4、6 h的譜圖差異明顯，水解0 h的樣品分子質(zhì)量多集中在5 000 Da以上，水解后樣品分子質(zhì)量多集中在500 Da以下，說明通過PEP可以有效獲得低分子質(zhì)量的膠原蛋白肽。胡頎[32]通過對牛骨進行高溫高壓處理后再用胰酶酶解得到樣品分子質(zhì)量小于1 500 Da的部分占68.76%。葉孟亮[7]采用不同酶對BBC進行酶解，結(jié)果表明木瓜蛋白酶酶解液低分子質(zhì)量（＜3 kDa）肽組分所占比例最大，為84.6%，其次為復(fù)合蛋白酶（81.8%）、中性蛋白酶（80.5%）、堿性蛋白酶（77.3%）和風味蛋白酶（77.1%）。與膠原蛋白肽的傳統(tǒng)酶法制備相比[6,20]，PEP在獲得低分子質(zhì)量膠原蛋白肽上更有優(yōu)勢。而低分子質(zhì)量肽在吸收性和消化穩(wěn)定性上更有優(yōu)勢，低分子質(zhì)量肽特別是二/三肽進入人體后，可以不被腸道消化降解直接被人體吸收。此外，三肽的吸收效率可能是五肽的1 000 倍以上[33]。

圖3 3 種骨膠原蛋白肽分子質(zhì)量分布Fig.3 Molecular mass distribution of peptides from three bone collagens

2.5 PEP酶解作用對不同骨膠原蛋白表觀濁度的影響

溶液的濁度取決于蛋白質(zhì)濃度、未溶解顆粒的存在情況、顆粒大小和單位體積的顆粒數(shù)[17]。如圖4所示，與水解0 h相比，3 種骨膠原蛋白溶液的濁度基本都顯著增加；當水解時間達到2 h后，濁度增長隨時間變化不顯著，但BBC在水解4 h和PBC在水解5 h時濁度下降，可能是實驗過程中測量誤差所致。3 種骨膠原蛋白中，BBC的濁度整體偏高，CBC次之，PBC最低。膠原蛋白溶液濁度增加可能與PEP作用下蛋白疏水域的暴露有關(guān)。水解膠原蛋白使其分散在溶液中導(dǎo)致濁度增加[34]。濁度的大小與蛋白顆粒的大小有關(guān)，蛋白顆粒越大，溶液的濁度越大，因此BBC溶液中的蛋白顆粒最大，CBC次之，PBC最小，進一步說明PEP更容易將PBC降解。

圖4 不同來源骨膠原蛋白水解前后表觀濁度變化Fig.4 Changes in apparent turbidity before and after hydrolysis of bone collagen peptides from different sources

2.6 PEP酶解作用對不同骨膠原蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響

如圖5所示，3 種骨膠原蛋白在水解前片段均較大，且在形狀上存在一定差異。其中，BBC表面光滑，存在許多尖銳的尖端；PBC、CBC表面相對粗糙，且與PBC相比，CBC呈更大的塊狀，表面分散著一些較小的片段。經(jīng)PEP消化后，BBC尖端消失，產(chǎn)生大量小片段和顆粒；PBC產(chǎn)生大量的圓球狀顆粒堆疊在一起，CBC呈小片段均勻分布。研究結(jié)果表明，水解后3 種骨膠原蛋白的片段均明顯減小，相較于水解前分布更加均勻。說明PEP能夠?qū)? 種骨膠原蛋白進行有效的降解。水解后3 種骨膠原蛋白片段大小與濁度結(jié)果一致（水解后膠原蛋白的片段越大，濁度越大）。以上結(jié)果表明，PEP對PBC水解效果最好，CBC次之，BBC最差。造成這種差異的原因可能是在相同酶解條件下，不同種源畜禽骨蛋白一級結(jié)構(gòu)末端肽的長度和序列不同，從而形成多肽片段的大小和數(shù)量不同。

圖5 不同來源骨膠原蛋白水解前后的微觀結(jié)構(gòu)Fig.5 Microstructure of bone collagens from different sources before and after hydrolysis

2.7 不同骨膠原蛋白酶解前后SDS-PAGE對比分析

如圖6所示，3 種骨膠原蛋白均具有典型的I型膠原蛋白特征：能夠觀察到α1鏈、α2鏈，在CBC的條帶中還可以觀察到β帶[35]。水解后3 種骨膠原蛋白的條帶均消失，表明大分子質(zhì)量的膠原蛋白在PEP作用下發(fā)生降解。膠原蛋白降解為多肽后，因其酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量較小，導(dǎo)致蛋白條帶完全消失[36]。

圖6 不同來源骨膠原蛋白水解前后SDS-PAGEFig.6 SDS-PAGE patterns of bone collagen proteins from different sources before and after hydrolysis

2.8 不同骨膠原蛋白酶解前后紅外光譜分析

紅外光譜中酰胺帶特征吸收峰可以反映膠原蛋白的三股螺旋構(gòu)象[37]，BBC、PBC和CBC水解前后的紅外光譜如圖7所示。3 種骨膠原蛋白均含有酰胺A、B、I、II、III帶的特征波段[35]。酰胺A帶的特征紅外吸收與N—H拉伸振動有關(guān)，通常在3 400～3 440 cm-1之間觀測到。當肽鍵上的N—H基團與羰基形成氫鍵時，位置轉(zhuǎn)移到較低的波數(shù)，通常在3 300 cm-1左右[38]。3 種骨膠原蛋白水解后均向較低波數(shù)輕微移動，其中BBC的酰胺A帶由3 485 cm-1移到3 435 cm-1，PBC由3 425 cm-1移到3 417 cm-1，CBC由3 485 cm-1移到3 425 cm-1，表明膠原蛋白在水解過程中N—H基團參與了氫鍵的形成。酰胺B帶與CH2基團的不對稱拉伸有關(guān)，通常在2 920 cm-1附近[38]。3 種骨膠原蛋白水解前后的酰胺B帶均在2 920 cm-1附近。1 640～1 660 cm-1范圍內(nèi)酰胺I帶的吸收峰是由C＝O基團沿多肽主鏈的拉伸振動引起，酰胺I帶決定著膠原蛋白中的分子有序程度[38]，是多肽二級結(jié)構(gòu)的標志[39]。酰胺I帶向較低波數(shù)方向移動，這與分子序降低有關(guān)[40]。酰胺II帶是由N—H的彎曲振動、C—N的拉伸振動、β-折疊和無規(guī)卷曲的疊加產(chǎn)生[41]。酰胺III帶的吸收峰（1 235～1 240 cm-1）涉及膠原分子間相互作用和三螺旋結(jié)構(gòu)，這也是由甘氨酸和脯氨酸的CH2基團搖擺振動引起[35]。在1 240 cm-1附近的酰胺III帶表明存在三螺旋結(jié)構(gòu)。酰胺III帶與1 450 cm-1附近的峰強度比越接近于1，所提取的膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)越完整[35]。而在水解后的3 種骨膠原蛋白均未在1 240 cm-1附近位置出現(xiàn)吸收峰，說明膠原蛋白降解后三螺旋結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞[38]。此外，水解后的膠原蛋白在877 cm-1附近出現(xiàn)了新峰，可能是芳香族氨基酸引起[42]。水解后的膠原蛋白均在較低波數(shù)（800～1 200 cm-1）處出現(xiàn)中等強度的峰，可能為酶解時加入的PEP所產(chǎn)生。

圖7 不同來源骨膠原蛋白水解前后傅里葉變換紅外光譜Fig.7 Fourier transform infrared spectra of bone collagen proteins from different sources before and after hydrolysis

2.9 不同骨膠原蛋白酶解前后圓二色光譜分析

圓二色光譜可以反映蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)信息，其圓二色性表現(xiàn)為生色基團和折疊結(jié)構(gòu)的總和[43]，正吸收峰的強度可以反映膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的完整性。如果完全破壞三螺旋結(jié)構(gòu)，則正吸收峰可能消失，負吸收峰可能紅移[41]。由圖8可以看出，水解前的3 種骨膠原蛋白均在221 nm波長處出現(xiàn)正峰，此處出現(xiàn)的正吸收峰是左旋聚脯氨酸構(gòu)型的典型特征。正峰強度絕對值與負峰強度的比值（RPN）用于判斷三螺旋構(gòu)象是否存在，若RPN＜1，則可以判斷提取的膠原蛋白具有三螺旋結(jié)構(gòu)[35]。RPN與膠原蛋白的螺旋程度呈正相關(guān)，反映了膠原蛋白肽分子中的螺旋區(qū)域與非螺旋區(qū)域的相對含量[44]。如圖8所示，3 種骨膠原蛋白均在221.2 nm波長處有正峰，分別在197.6、197.3 nm和197.8 nm波長處有負峰，它們的RPN分別為0.893、0.892和0.894，均小于1，說明3 種骨膠原蛋白均具有天然的三螺旋結(jié)構(gòu)。水解后的PBC、CBC在220 nm波長處的正峰完全消失，BBC在220 nm波長處的橢圓度降低，圓二色光譜變得平滑，這均說明3 種骨膠原蛋白水解后發(fā)生了變性，三螺旋結(jié)構(gòu)減少。

圖8 不同來源骨膠原蛋白水解前后的圓二色光譜Fig.8 Circular dichroism spectra of bone collagen proteins from different sources before and after hydrolysis

2.10 不同骨膠原蛋白酶解前后XRD分析

如圖9所示，未水解的膠原蛋白有3 個主要峰，第1個峰在2θ為10°附近出現(xiàn)，這是由膠原蛋白分子內(nèi)部晶體結(jié)構(gòu)引起。第2個寬峰出現(xiàn)在2θ為20°附近，這是由于膠原蛋白內(nèi)部無定形區(qū)域的彌散散射引起。利用布拉格方程計算重復(fù)間距的最小值（d）[45]。水解前BBC、PBC和CBC的第1個相對尖峰的d值分別為3.76、3.82 ?和3.80 ?，顯示了分子鏈之間的距離。第1個尖峰與膠原蛋白的三重螺旋結(jié)構(gòu)有關(guān)[46]。水解后3 種骨膠原蛋白在第1個峰的位置沒有出現(xiàn)峰，可能是水解后三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致峰消失。水解后3 種骨膠原蛋白的衍射峰強度較高，可能是酶解過程中添加的PEP對信號產(chǎn)生了干擾[20]。

圖9 不同來源骨膠原蛋白水解前后的XRDFig.9 XRD patterns of bone collagen proteins from different sources before and after hydrolysis

3 結(jié)論

以牛骨、豬骨、雞骨的膠原蛋白為原料，首先對3 種骨膠原蛋白序列進行分析，預(yù)測虛擬酶解位點，發(fā)現(xiàn)3 種骨膠原蛋白均可以被PEP降解。通過PEP對3 種骨膠原蛋白進行降解，探究PEP酶解骨膠原蛋白制備膠原蛋白肽的效果。通過掃描電鏡以及SDS-PAGE分析表明大分子膠原蛋白被降解成小片段分散在溶液中，水解度測定結(jié)果表明PEP對3 種不同來源骨膠原蛋白均有顯著水解效應(yīng)，且對PBC的水解效果最好，水解度高達51.35%。3 種骨膠原蛋白水解液分子質(zhì)量多分布在500 Da以下，且同一水解時間的分子質(zhì)量分布情況差異不顯著。通過二、三級結(jié)構(gòu)分析可知，PEP在對膠原蛋白進行降解時膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，三螺旋結(jié)構(gòu)解開后更多的酶切位點暴露，從而更易獲得低分子質(zhì)量的膠原蛋白肽。本研究可為PEP酶解膠原蛋白獲得生物活性肽提供依據(jù)。