陳艷俏，楊翠，陳少軍

摘要目的：分析特定microRNA在血瘀型急性非ST段抬高型心肌梗死病人血漿中的分布特點。方法：入選北京中醫(yī)醫(yī)院懷柔醫(yī)院心血管科2018年12月—2020年12月住院的40例中醫(yī)辨證為血瘀型病人，入院后診斷為急性非ST段抬高型心肌梗死者32例為觀察組，未診斷為急性非ST段抬高型心肌梗死病人8例為對照組，收集兩組病人血清肌鈣蛋白I（cTnI）、B型鈉尿肽（BNP）及左室射血分數(shù)（LVEF）等資料，并對兩組病人血漿中特定microRNA進行檢測分析比較。結(jié)果：與對照組相比，觀察組cTnI及BNP明顯升高，LVEF 低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；觀察組病人血漿miR-133 aRNA、miR-208 RNA、miR-1 RNA表達水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而觀察組病人血漿miR-21RNA與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論：血漿miR-133a、miR-208、miR-1在血瘀型急性非ST段抬高型心肌梗死病人中表達水平顯著升高，其可能成為預測急性非ST段抬高型心肌梗死及輔助評估心功能的潛在指標。

關(guān)鍵詞急性非ST段抬高型心肌梗死；血瘀型；血漿microRNA；血清肌鈣蛋白I；B型鈉尿肽；左室射血分數(shù)

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.08.026

隨著生活方式及人口結(jié)構(gòu)的改變，急性心肌梗死發(fā)病率逐年升高，并有向低齡化發(fā)展的趨勢，因其致死率高、預后差，成為當今人類健康的頭號殺手。急性非ST段抬高型心肌梗死（non ST-segment elevation myocardial infarction，NSTEMI）屬于非ST段抬高型急性冠脈綜合征的一種，最新版《2020年歐洲心臟病學會非ST段抬高型急性冠狀動脈綜合征管理指南》［1］指出，胸痛癥狀、體征、心電圖、肌鈣蛋白檢測用于NSTEMI早期診斷，血漿腦鈉肽（BNP）或者N末端B型腦鈉肽前體（NT-proBNP）用于風險或預后評估。同時，越來越多研究發(fā)現(xiàn)，microRNA在急性心肌梗死的病理發(fā)生發(fā)展過程中起到關(guān)鍵作用，心肌梗死發(fā)生時，特定的microRNA能以穩(wěn)定的形式釋放至循環(huán)血液中，可能成為新型的生物標志物而具有潛在的臨床應用價值［2-3］。本研究以血漿 microRNA 為切入點，觀察中醫(yī)辨證屬血瘀型非 ST 段抬高型心肌梗死病人發(fā)病階段特異性血漿microRNA的表達特征，初步探索了血漿microRNA對血瘀型NSTEMI的診斷價值。

1資料與方法

1.1臨床資料

選擇2018年12月—2020年12月入住北京中醫(yī)醫(yī)院懷柔醫(yī)院心血管科的32例辨證屬血瘀證的NSTEMI病人為觀察組，8例中醫(yī)辨證屬血瘀證的未診斷為NSTEMI病人為對照組。觀察組，男20例，女12例，年齡37～79（63.59±10.18歲）；對照組，男5例，女3例，年齡37～74（57.63±11.99）歲。兩組病人均患有高脂血癥，觀察組與對照組年齡、性別、合并基礎(chǔ)病等基線資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。詳見表1。所有參與研究病人均按照相關(guān)指南獲得相應干預及對癥治療。本研究已獲得北京中醫(yī)醫(yī)院懷柔醫(yī)院倫理委員會批準，所有參與研究的病人或病人家屬均對本研究內(nèi)容充分知情，并簽署了知情同意書。

1.2診斷標準

1.2.1NSTEMI診斷標準

參考 2018 年第4版心肌梗死全球統(tǒng)一定義［4-5］制定。血清心肌標志物（主要是肌鈣蛋白）升高，并至少伴有以下一項臨床指標：1）缺血癥狀；2）新發(fā)生的缺血性心電圖改變（新的ST-T改變或左束支傳導阻滯）；3）心電圖病理性Q波形成；4）影像學證據(jù)顯示有新的心肌活性喪失或新發(fā)的局部室壁運動異常；5）冠狀動脈造影或尸檢證實冠狀動脈內(nèi)有血栓。結(jié)合心電圖ST-T改變，除外急性ST段抬高型心肌梗死。

1.2.2血瘀證診斷標準

參考 2018 年《急性心肌梗死中西醫(yī)結(jié)合診療指南》［6］制定標準。氣虛血瘀：胸部刺痛、悶滯，活動后加重，可伴身體乏力，氣短，出汗，心悸，查體可有四肢肌膚瘀斑或甲錯，舌質(zhì)暗淡或有瘀點瘀斑，舌苔薄白，脈虛無力或弦細無力。氣滯血瘀：心胸滿悶，刺痛陣發(fā)，痛有定處，常欲嘆息，情志不遂時易誘發(fā)或加重，查體可見面色黧黑，唇甲青紫，皮膚出現(xiàn)瘀斑，舌質(zhì)紫暗，可見紫點或紫斑，舌底靜脈曲張，舌苔薄，脈弦澀。痰阻血瘀：劇烈胸痛，胸悶如窒，氣短，形體沉重肥胖，咳嗽痰多，納呆惡心，可伴頭昏目眩，腦脹，舌紫暗或暗紅，可有瘀斑，舌下瘀筋，舌苔厚膩，脈滑或澀。

1.3納入與排除標準

1.3.1納入標準

1）年齡 18～80歲；2）符合NSTEMI急性診斷標準；3）中醫(yī)辨證屬血瘀證。

1.3.2排除標準

1）嚴重感染或自身免疫性疾病者；2）嚴重心功能不全者，左室射血分數(shù)（LVEF）＜35%；3）未控制的嚴重高血壓或1型糖尿病病人；4）嚴重瓣膜性心臟病者；5）合并嚴重肝、腎或造血系統(tǒng)及精神疾病、惡性腫瘤者；6）依從性差；7）妊娠期或哺乳期婦女；8）拒絕簽署知情同意書者。

1.4研究方法

1.4.1一般情況

記錄入組病人的一般情況及急性心肌梗死相關(guān)危險因素情況，包括性別、年齡及合并疾病情況。觀察指標：血清BNP、血清肌鈣蛋白I（cTnI）等指標由我院檢驗科檢測；LVEF數(shù)據(jù)由我院超聲科提供。

1.4.2目標基因microRNA檢測

1）使用EDTA 血漿分離管采集符合入組標準的病人靜脈血樣，以二次離心法獲得血漿樣本后，置于－80 ℃條件保存；2）使用Trizol 法分別提取各組標本的總 RNA，經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄后制備目標 cDNA 模板；3）設(shè)計目標基因上游引物，選擇合適的內(nèi)參基因，應用通用引物的 SYBR Green 染料法對備選目標基因進行實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測，檢測重復進行3次，取3次檢測結(jié)果的平均值。4）根據(jù)qRT-PCR原始檢測結(jié)果，計算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果，即其他各個樣品相對于對照樣品，目的microRNA基因轉(zhuǎn)錄水平的差異。

1.5統(tǒng)計學處理

血漿microRNAs表達采用2－△△Ct相對定量計算公式，其中△△Ct＝（觀察組目的基因平均Ct值—觀察組內(nèi)參基因平均Ct值）—（對照組目的基因平均Ct值—對照組內(nèi)參基因平均Ct值）。定量資料為正態(tài)分布且方差齊時，采用兩獨立樣本t檢驗，用均數(shù)±標準差（x±s）表示；定性資料兩組間比較應用χ2檢驗。采用SPSS25.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1兩組TNI、BNP及LVEF比較

與對照組相比，觀察組cTnI及BNP明顯升高，LVEF明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見表2。

2.2兩組血漿目標基因microRNA表達結(jié)果比較

對microRNA在NSTEMI病人中的表達特點進行分析，選定4個目標microRNA（miR-133a、miR-208、miR-21及miR-1）進行轉(zhuǎn)錄水平測定。本研究結(jié)果顯示，觀察組病人血漿miR-133a RNA、miR-208 RNA、miR-1 RNA表達水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而觀察組病人血漿miR-21 RNA與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表3。

3討論

NSTEMI是臨床常見的心血管疾病，現(xiàn)代醫(yī)學研究認為，其發(fā)病機制與冠狀動脈粥樣斑塊不穩(wěn)定、斑塊破裂、血栓形成、血液微循環(huán)障礙、心肌供氧不足及失衡等諸多因素密切相關(guān)。本病發(fā)病率及致死率高，對其早期鑒別診斷有助于及時選擇個體化的抗栓或血運重建等干預措施，對本病的發(fā)展趨勢及預后評估有著重要的意義，快速而準確的診斷一直以來都是研究的熱點。大量研究發(fā)現(xiàn)，microRNA在許多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起到關(guān)鍵的作用，不僅在心肌組織中特異性表達，而且還能以穩(wěn)定的形式存在于循環(huán)血液中，其異常表達與組織損傷或病理變化呈現(xiàn)出明顯的動態(tài)相關(guān)性，可能成為新一代生物標志物［2，7-9］。

NSTEMI屬于中醫(yī)學“胸痹”“心痛”范疇，中醫(yī)認為，本病為本虛標實之證，以心氣、心陽虛衰為本，氣滯、血瘀、痰飲、寒凝為標。心氣、心陽虛損，無力鼓動血脈，導致瘀血痹阻心脈，血瘀貫穿胸痹心痛疾病發(fā)展病理過程的始終。血瘀證是非ST段抬高型心肌梗死的最為常見的證型，是眾多心血管中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的方向。故本研究選取中醫(yī)辨證屬血瘀證的NSTEMI病人為研究對象，探討特定microRNA在血漿中的分布規(guī)律。

心血管疾病發(fā)生時，心肌細胞或內(nèi)皮細胞受到損傷，特異性microRNA可由受刺激的細胞釋放至血液循環(huán)中而被檢測到，是潛在的新型診斷標志物［7-9］。有研究發(fā)現(xiàn)在胸痛后早期肌酸磷酸肌酶和肌鈣蛋白T還未升高時，血清miR-1 RNA和miR-133a RNA就已經(jīng)升高［10］。另有研究對急性冠脈綜合征病人血漿心肌相關(guān)性microRNAs進行檢測，發(fā)現(xiàn)心肌梗死病人血漿miR-208b RNA和miR-499-5p RNA明顯高于非心肌梗死病人，ST段抬高型心肌梗死病人血漿miR-208b RNA和miR-499-5p RNA明顯高于NSTEMI病人［11］。Olivieri等［12］對92例NSTEMI心肌梗死病人、81例急性心力衰竭病人和99名健康對照老年人血漿miR水平進行qRT-PCR檢測，急性心肌梗死病人與健康對照組相比，血漿miR-1 RNA、miR-21 RNA、miR-133a RNA和miR-423-5p RNA水平上調(diào)3～10倍，而miR-499-5p RNA上調(diào)超過80倍，此外，在區(qū)分NSTEMI和急性充血性心力衰竭時，血漿miR-499-5p診斷的精確度高于心肌肌鈣蛋白T，其可能是NSTEMI敏感的生物標志物。國內(nèi)有研究表明，循環(huán)miRNA-21是急性冠脈綜合征病人經(jīng)皮冠狀動脈介入（PCI）術(shù)后預后的獨立危險因素［13］。

本研究在前期研究基礎(chǔ)上，通過查閱大量文獻，檢索國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫，收集、分析和研究microRNA在NSTEMI病人中的表達特點，選定4個目標microRNA（miR-133a、miR-208、miR-21及miR-1）進行測定。研究結(jié)果顯示，相比對照組，觀察組病人血漿miR-133a RNA、miR-208 RNA、miR-1 RNA表達水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而觀察組病人血漿miR-21 RNA與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，血漿miR-133a、miR-208、miR-1在血瘀型NSTEMI病人中表達水平顯著升高，其可能成為預測NSTEMI病人及輔助評估心功能的潛在指標。

綜上所述，在血瘀證人群的臨床診療工作中，血漿miR-133a RNA、miR-208 RNA、miR-1 RNA檢測可對NSTEMI病人進行早期的、更有針對性的診斷，從而進行快速介入治療或藥物干預，降低病人心肌梗死進一步加重的風險。血瘀證是中醫(yī)基礎(chǔ)證候之一，本研究作為一項探索性研究，檢測了血瘀證NSTEMI病人的microRNA表達特點。在下一步工作中，將擴大研究的樣本量，檢測氣滯血瘀證、氣虛血瘀證、痰瘀互結(jié)證等以血瘀證為基礎(chǔ)的復合證候NSTEMI病人的microRNA表達特點，為microRNA檢測對NSTEMI病人的診斷提供更多依據(jù)。

參考文獻：

［1］JEAN-PHILIPPE C，HOLGER T，EMANUELE B，et al.2020 ESC guidelines for the management of acute coronary syndromes in patients presenting without persistent ST-segment elevation［J］.European Heart Journal，2020，42（14）：1289-1367.

［2］LEI Z，HAN D，YUAN Z et al.Circulating microRNAs：biogenesis and clinical significance in acute myocardial infarction［J］.Frontiers in Physiology，2020，11：1088.

［3］LIU P，WANG S Y，LI K Y，et al.Exosomal microRNA-4516，microRNA-203 and SFRP1 are potential biomarkers of acute myocardial infarction［J］.Molecular Medicine Reports，2023，27（6）：124.

［4］THYGESEN K.What，new in the fourth universal definition of myocardial infarction？［J］.European Heart Journal，2018，39（42）：3757-3758.

［5］THYGESEN K，ALPERT J S，JAFFE A S，et al.Fourth universal definition of myocardial infarction（2018）［J］.European Heart Journal，2019，40（3）：33.

［6］中國醫(yī)師協(xié)會中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)師分會，中國中西醫(yī)結(jié)合學會心血管病專業(yè)委員會，中國中西醫(yī)結(jié)合學會重癥醫(yī)學專業(yè)委員會，等.急性心肌梗死中西醫(yī)結(jié)合診療指南［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2018，38（3）：272-284.

［7］FUNG EN C，BUTT ASIF N，JARLATH E，et al.Circulating microRNA in cardiovascular disease［J］.Advances in Clinical Chemistry，2019，91：99-122.

［8］MARTA O P，DOROTA G，AGNIESZKA F W，et al.Circulating microRNAs in cardiovascular diseases［J］.Acta Biochimica Polonica，2016，63（4）：725-729.

［9］MARIA B，NATALIA F，EDINA C，et al.Micrornas as potential biomarkers in coronary artery disease［J］.Current Topics in Medicinal Chemistry，2022，23（6）：454-469.

［10］KUWABARA Y，ONO K，HORIE T，et al.Increased microRNA-1 and microRNA-133a levels in serum of patients with cardiovascular disease indicate myocardial damage［J］.Circulation Cardiovascular Genetics，2011，4（4）：446-454.

［11］GIDLF O，SMITH J G，MIYAZU K，et al.Circulating cardio-enriched microRNAs are associated with long-term prognosis following myocardial infarction［J］.BMC Cardiovascular Disorders，2013，13：12.

［12］OLIVIERI F，ANTONICELLI R，LORENZI M，et al.Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction［J］.Int J Cardiol，2013，167（2）：531-536.

［13］郝中堅，呂吉元，郭紅菊，等.microRNA-21與經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)后急性冠脈綜合征病人預后的關(guān)系探討［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2019，17（24）：4093-4095.

（收稿日期：2022-10-24）

（本文編輯王雅潔）