鄒智 喬雪瑩 鄭玉皎 陽(yáng)江華

關(guān)鍵詞：乳管；水通道蛋白；亞細(xì)胞定位；雙分子熒光互補(bǔ)；酵母雙雜交

質(zhì)膜內(nèi)在蛋白（plasma membrane intrinsic protein，PIP）是一類原始而高度保守的水通道蛋白（aquaporin，AQP）[1]。根據(jù)進(jìn)化關(guān)系和序列特征，PIP 可分為PIP1 和PIP2 兩個(gè)亞類，前者具有較長(zhǎng)的N 端，而后者具有較長(zhǎng)的C 端[2-7]。在蟾蜍卵母細(xì)胞中的體外分析顯示，PIP2 具有高效的水分轉(zhuǎn)運(yùn)活性，而PIP1 無(wú)活性或活性極低，究其原因主要是因PIP1 不能有效定位到細(xì)胞膜所致[8-14]。在玉米原生質(zhì)中亞細(xì)胞定位分析顯示，隸屬于PIP2 亞類的ZmPIP2;1 和ZmPIP2;5 定位在細(xì)胞膜，而屬PIP1 亞類的ZmPIP1;1、ZmPIP1;2 和ZmPIP1;6 均定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[9]。雖然PIP 單體本身就具有水分轉(zhuǎn)運(yùn)活性，但其在生物膜上以四聚體的形式起作用[15]。PIP 不僅可形成同源四聚體，同時(shí)也可以形成異源四聚體[15-18]。

橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）隸屬于大戟科，是天然橡膠的主要商業(yè)來(lái)源[19-21]。生產(chǎn)上，橡膠通過(guò)用膠刀周期性地切割樹(shù)皮收集膠乳而獲得。膠乳系乳管細(xì)胞的胞質(zhì)成分，水分含量60%～70%，水分通過(guò)調(diào)節(jié)膠乳的粘稠度和乳管膨壓進(jìn)而影響橡膠樹(shù)的產(chǎn)排膠能力，是決定膠乳產(chǎn)量的關(guān)鍵因素[4， 11， 14， 22]。通過(guò)前期研究，本團(tuán)隊(duì)鑒定到1 個(gè)在乳管中高豐度表達(dá)的AQP 基因，即HbPIP2;3，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)水平與品系的膠乳產(chǎn)量和水分含量呈正相關(guān)，且該基因在蟾蜍中過(guò)表達(dá)可顯著提高卵母細(xì)胞的水分透性[4， 14]。為揭示HbPIP2;3 調(diào)控乳管水分平衡的分子機(jī)制，本研究在前期工作基礎(chǔ)上對(duì)其編碼蛋白的亞細(xì)胞定位和多聚化特征進(jìn)行分析，以增進(jìn)對(duì)乳管水分平衡的分子認(rèn)知，并為利用生物技術(shù)手段提高膠乳產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 基因克隆所用橡膠樹(shù)品系為熱研7-33-97；亞細(xì)胞定位和雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）所用材料為本氏煙草。

1.1.2 菌株及載體 大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌GV3101、pNC-Cam1304-SubN、pNC-BiFC-ENN和pNC-BiFC-ECN 由本實(shí)驗(yàn)室保存；Y2HGold 購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；酵母雙雜交載體購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（大連）有限公司。

1.1.3 主要試劑 各類酶、試劑盒及生化試劑詳見(jiàn)文獻(xiàn)[23-24]。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄 膠乳總RNA 的提取及cDNA 第一鏈的合成參照文獻(xiàn)[4]。

1.2.2 基因克隆與載體構(gòu)建 根據(jù)本地?zé)嵫?-33-97 的基因組序列設(shè)計(jì)引物（表1），并以膠乳來(lái)源的cDNA 作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。參照文獻(xiàn)[24]，利用同源重組法將HbPIP2;3 構(gòu)建到pNC-Cam1304-SubN、pNC-BiFC-ENN、pNC-BiFCECN、pGADT7 和pGBKT7。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 蛋白的理化特性、保守結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分別采用Protparam（https：//web.expasy.org/protparam/）、CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）、WoLF PSORT（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）和SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）等在線工具分析。根據(jù)與菠菜SoPIP2;1[15]進(jìn)行序列比對(duì)界定相應(yīng)的跨膜螺旋區(qū)，并利用其晶體結(jié)構(gòu)作為模板通過(guò)SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）在線軟件進(jìn)行3D 建模。

1.2.4 亞細(xì)胞定位和雙分子熒光互補(bǔ) 含重組質(zhì)粒農(nóng)桿菌浸染液的制備及煙草葉片的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)[24]，其中，煙草幼苗約為5 周齡，轉(zhuǎn)化48 h 后用共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光觀察。

1.2.5 酵母雙雜交 誘餌載體pGBKT7-HbPIP2;3的自激活檢測(cè)及點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的酵母雙雜交參照寶日醫(yī)酵母雙雜交試劑盒說(shuō)明書(shū)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆與載體構(gòu)建

以HbPIP2;3F/R 為引物的首輪PCR 成功擴(kuò)增到1 條約860 bp 的目的條帶。隨后，以第一輪PCR產(chǎn)物作為模板，分別以pCam1304-HbPIP2;3F/R、pNC-BiFC-HbPIP2;3F/R、pGADT7-HbPIP2;3F/R或pGBKT7-HbPIP2;3F/R 為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，目的條帶切膠回收后分別構(gòu)建pCam1304-HbPIP2;3、pNC-BiFC-ECN-HbPIP2;3、pNC-BiFCENN-HbPIP2;3、pGADT7-HbPIP2;3 和pGBKT7-HbPIP2;3 等載體。

2.2 序列的生物信息學(xué)分析

測(cè)序及序列分析表明，HbPIP2;3 的CDS 全長(zhǎng)為861 bp，預(yù)測(cè)編碼286 個(gè)氨基酸，理論分子量為30.58 kDa，等電點(diǎn)為8.50，脂肪族指數(shù)為100.38，總平均疏水指數(shù)為0.449，不穩(wěn)定系數(shù)為31.68。CDD 分析顯示，該蛋白含有1 個(gè)高度保守的MIP 結(jié)構(gòu)域，即32～267 位，共包含236 個(gè)殘基（圖1A）。序列比對(duì)顯示，HbPIP2;3 與HbPIP1;1、SoPIP2;1 的序列相似性分別為72.1%和85.1%，擁有6 個(gè)典型的跨膜螺旋（即TM1～6）和2 個(gè)半螺旋（即HB 和HE），其中，位于2 個(gè)半螺旋上的NPA 基序，以及位于TM2、TM5 和LE 上的ar/R 選擇性濾器完全一致，均為F-H-T-R；在5個(gè)Froger 位點(diǎn)（即P1～5）中，僅P1 存在變異，分別為Q-S-A-F-W、E-S-A-F-W 和M-S-A-F-W；此外，對(duì)應(yīng)于SoPIP2;1 S115 的磷酸化位點(diǎn)和L197門控位點(diǎn)也完全一致，而對(duì)應(yīng)于SoPIP2;1 S274 的磷酸化位點(diǎn)則只存在HbPIP2;3 和SoPIP2;1 中（圖1B）。SOPMA 分析顯示，HbPIP2;3 的α-螺旋占36.36%，延伸鏈結(jié)構(gòu)占17.48%，β-轉(zhuǎn)角占3.50%，無(wú)規(guī)則卷曲占42.66%；同源建模進(jìn)一步證實(shí)該蛋白含有6 個(gè)跨膜螺旋，同時(shí)也顯示其可以形成同源四聚體（ 圖1C）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，HbPIP2;3 定位在細(xì)胞膜。

2.3 亞細(xì)胞定位分析

以空載pNC-Cam1304-SubN 為對(duì)照，將含pCam1304-HbPIP2;3 的農(nóng)桿菌工程菌微量注射煙草葉片后進(jìn)行熒光觀察，結(jié)果如圖2 所示，轉(zhuǎn)空載的熒光信號(hào)散布于細(xì)胞的各個(gè)區(qū)域，包括細(xì)胞核，而實(shí)驗(yàn)組僅見(jiàn)于細(xì)胞膜，這表明HbPIP2;3 定位在細(xì)胞膜。

2.4 BiFC 分析

以轉(zhuǎn)pCam1304-HbPIP2;3 的為陽(yáng)性對(duì)照、單轉(zhuǎn)pNC-BiFC-ENN-HbPIP2;3 或pNC-BiFC-ECNHbPIP2;3 的為陰性對(duì)照，將分別含有pNC-BiFCENN-HbPIP2;3 和pNC-BiFC-ECN-HbPIP2;3 的農(nóng)桿菌工程菌等量混合后轉(zhuǎn)化煙草，熒光觀察結(jié)果如圖3 所示，2 個(gè)陰性對(duì)照均為未見(jiàn)信號(hào)，而實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照在細(xì)胞膜均發(fā)現(xiàn)強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，這表明HbPIP2;3 可在細(xì)胞膜上形成多聚體。

2.5 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)

自激活檢測(cè)顯示（圖4），轉(zhuǎn)pGADT7/pGBKT-7-HbPIP2;3 的陽(yáng)性對(duì)照在二缺（SD-TL）、三缺（SD-TLH）和四缺（SD-TLHA）營(yíng)養(yǎng)平板上生長(zhǎng)旺盛，而實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照類似，在四缺板上均無(wú)生長(zhǎng)，這表明pGBKT7-HbPIP2;3 無(wú)自激活活性。進(jìn)一步的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)顯示（圖5），實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照類似，在四缺板上生長(zhǎng)旺盛，而陰性對(duì)照無(wú)生長(zhǎng)，這表明HbPIP2;3 在體外也可形成多聚體。

3 討論

作為天然橡膠合成和貯藏的場(chǎng)所，橡膠樹(shù)乳管是一類高度分化的單一細(xì)胞類型組織[19]。與成熟葉片等組織不同，乳管無(wú)中央大液泡，取而代之的是成百上千的分散性小液泡，即所謂的黃色體[4， 19]。在成熟葉片中，水分的平衡由PIP 和液泡定位的液泡內(nèi)在蛋白（tonoplast intrinsic protein，TIP）共同決定，而乳管的水分平衡則主要由PIP決定[7]，因此，分離和鑒定乳管表達(dá)的PIP 具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值[4， 11-14]。在3 個(gè)乳管高豐度表達(dá)的PIP 中，HbPIP1;4 和HbPIP2;7 在蟾蜍卵母細(xì)胞中異源表達(dá)均無(wú)水分轉(zhuǎn)運(yùn)活性[13]，而HbPIP2;3 的活性與HbPIP2;1 相當(dāng)[11， 14]。由于HbPIP2;1 在乳管中的表達(dá)豐度很低， 因此，HbPIP2;3 被認(rèn)為是調(diào)控乳管水分平衡的關(guān)鍵基因[4， 14]。

本研究結(jié)果顯示，HbPIP2;3 含有一個(gè)AQP 家族特有的MIP 結(jié)構(gòu)域（Pfam 登錄號(hào)為PF00230），其中包含6 個(gè)典型的跨膜螺旋和2 個(gè)半螺旋，等電點(diǎn)>7.0，總平均疏水指數(shù)>0，不穩(wěn)定系數(shù)為<40，屬于穩(wěn)定的疏水型堿性蛋白。與隸屬于PIP1 亞類的HbPIP1;1 相比，HbPIP2;3 與SoPIP2;1 的序列相似性更高，具有較短的N 端和較長(zhǎng)的C 端，且C 端含有1 個(gè)PIP2 亞類特有的磷酸化位點(diǎn)[15]。與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果一致，在煙草葉片中的亞細(xì)胞定位分析顯示HbPIP2;3 定位在細(xì)胞膜。與基于同源建模的3D 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)一致，BiFC 和點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)均表明HbPIP2;3 可形成同源四聚體。HbPIP1;1 雖然在煙草中也定位在細(xì)胞膜[24]，但與HbPIP2;3 和SoPIP2;1 不同的是，其在蟾蜍中并無(wú)水分轉(zhuǎn)運(yùn)活性[12]。雖然本研究試圖通過(guò)序列比較尋求答案，但HbPIP1;1 具有HbPIP2;3 和SoPIP2;1 類似的ar/R 選擇性濾器（F-H-T-R）以及典型的NPA 基序，理論上HbPIP1;1 應(yīng)具有高效的水分轉(zhuǎn)運(yùn)活性，因此，相關(guān)的決定因子還有待進(jìn)一步研究。另外一種可能是，HbPIP1;1 自身原本不能定位到細(xì)胞膜，但可以跟煙草中的PIP2蛋白互作進(jìn)而有效定位。事實(shí)上，PIP1 和PIP2之間的異源互作廣泛存在于不同植物中，如玉米、擬南芥、煙草、葡萄、甜菜、草莓、棉花、大麥，甚至還包括卷柏[8-9， 16-18， 25-27]。因此，進(jìn)一步篩選和鑒定與HbPIP1;1 互作的PIP2 蛋白有助于闡明復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。

綜上，本研究證實(shí)HbPIP2;3 在細(xì)胞膜上可通過(guò)同源四聚體的方式調(diào)控橡膠樹(shù)乳管的水分平衡，但是否存在異源互作模式還有待進(jìn)一步研究。