木薯MeHsfB3b轉(zhuǎn)錄因子與MeFKBP20蛋白互作關(guān)系驗(yàn)證

王超群 李琳琳 陳銀華 張肖飛 姚遠(yuǎn) 耿夢(mèng)婷

關(guān)鍵詞：熱激轉(zhuǎn)錄因子；FKBP 型肽脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶；酵母雙雜交；雙分子熒光互補(bǔ)

木薯（Manihot esculenta Crantz）具有高光合效率、高淀粉產(chǎn)量、耐旱、耐貧瘠等特性，廣泛種植于非洲、南美洲和亞洲熱帶地區(qū)，為105個(gè)國(guó)家的近10 億人提供主食[1-2]，同時(shí)也是生產(chǎn)淀粉、生物乙醇及其他生物基產(chǎn)品的重要工業(yè)原料[3]。木薯細(xì)菌性枯萎病（cassava bacterial blight，CBB） 是由菜豆黃單胞菌木薯枯萎致病變種（Xanthomonas phaseoli pv. manihotis， Xpm）引起的檢疫性病害[4-5]。病原菌主要由葉面氣孔或傷口侵入經(jīng)維管束擴(kuò)散至全株，初期癥狀表現(xiàn)葉組織出現(xiàn)水浸狀半透明角斑不規(guī)則分布，而后擴(kuò)大形成深褐色斑塊并伴隨乳白色或黃橙色分泌物，后期葉片卷曲呈現(xiàn)焦枯癥狀或全株凋亡[6-7]。CBB對(duì)木薯生產(chǎn)存在巨大破壞性，甚至是毀滅性的，被認(rèn)為是限制木薯產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的病害之一，是僅次于木薯花葉病毒病的第二大病害[6， 8]。

植物在與病原菌互作過(guò)程中存在廣泛的信號(hào)交流，通過(guò)感知病原菌作出應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)自身抗病性[9-11]。熱激轉(zhuǎn)錄因子（heat stress transcriptionfactors， HSFs）作為逆境信號(hào)傳導(dǎo)的主要調(diào)控因子，不但參與高溫、干旱、滲透及缺氧等非生物脅迫，還參與了植物對(duì)病原菌侵染的響應(yīng)過(guò)程[12-15]。HSFs 在進(jìn)化上高度保守，根據(jù)結(jié)構(gòu)域分為A、B、C 三個(gè)亞類(lèi)，木薯基因組中，存在32 個(gè)HSFs 成員，其中A 類(lèi)18 個(gè)，B 類(lèi)12 個(gè)，C 類(lèi)2 個(gè)。HSFs參與木薯對(duì)Xpm 病原菌侵染過(guò)程。木薯MeHsf3基因表達(dá)量下調(diào)，導(dǎo)致木薯對(duì)細(xì)菌性枯萎病表現(xiàn)易感。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MeHsf3 轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)對(duì)下游靶基因MeEDS1 和MePR4 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控激活木薯對(duì)CBB 的免疫反應(yīng)[13]。MeHsfB3b（MeHsf20）轉(zhuǎn)錄因子正向調(diào)控木薯褪黑素合成關(guān)鍵基因MeASMT2 表達(dá)，通過(guò)積累更多的褪黑素提高木薯抗病性[16]。

本實(shí)驗(yàn)室前期利用酵母雙雜交技術(shù)篩選獲得MeHsfB3b 的候選互作蛋白MeFKBP20 。MeFKBP20 蛋白屬于FK506 結(jié)合蛋白（FK506binding protein， FKBP）家族[17]。FKBP 家族成員參與蛋白質(zhì)折疊、運(yùn)輸、激素信號(hào)傳導(dǎo)、植物生長(zhǎng)和應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程[18-20]。例如，小麥FKBP73、FKBP77 蛋白以及擬南芥FKBP62、FKBP65 蛋白受傷害、NaCl 脅迫和丙二醛處理誘導(dǎo)，進(jìn)而誘導(dǎo)非生物脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)做出應(yīng)激反應(yīng)[21-22]。在植物中FKBP 型PPIase 可以作為分子伴侶與其他蛋白相互作用，調(diào)控廣泛的發(fā)育過(guò)程、脅迫反應(yīng)和植物防御[23]。FKBP15-2 作為辣椒疫霉RXLR效應(yīng)因子PcAvr3a12 的直接靶標(biāo)，正向調(diào)節(jié)植物對(duì)疫霉菌免疫反應(yīng)[24]。本研究擬克隆木薯MeFKBP20 基因，分析該基因的表達(dá)模式，利用酵母雙雜和雙分子熒光互補(bǔ)驗(yàn)證MeFKBP20與MeHsfB3b 的互作關(guān)系及互作區(qū)域。研究結(jié)果有利于進(jìn)一步解析木薯MeHsfB3b 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控褪黑素積累抵御Xpm 侵染的分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 華南8 號(hào)木薯苗（SC8）、本生煙草（Nicotiana. benthamiana）為實(shí)驗(yàn)室保存株。

1.1.2 菌株 大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、農(nóng)桿菌GV3101（pSoup-p19）、酵母AH109 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司。病原菌XpmCHN11 為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 質(zhì)粒載體 中間載體pEASY-Blunt 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司（TransGen Biotech）；酵母雙雜交載體pGBKT7、pGADT7 為實(shí)驗(yàn)室保存；雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)載體pNC-BiFC-Enc、pNC-BiFC-Ecc 為中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所周鵬老師實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.4 酶及藥品試劑 2×Rapid Taq Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。質(zhì)粒小提、瓊脂糖凝膠回收、PCR 產(chǎn)物柱回收試劑盒等均購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司。SeamlessAssembly Cloning Kit 試劑盒購(gòu)自中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司。TB Green? Premix ExTaq?購(gòu)自TaKaRa 公司。RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（離心柱型DP441）購(gòu)自天根生化科技（ 北京） 有限公司， Q5?High-Fidelity DNA Polymerases 購(gòu)自NEB 公司。引物合成及測(cè)序由深圳華大基因科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 互作蛋白MeFKBP20 基因克隆及序列分析根據(jù)Phytozome v13 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//phytozomenext.jgi.doe.gov）公布MeFKBP20 基因（登錄號(hào)：Manes.07G117900）序列，使用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）Primer-BLAST 工具設(shè)計(jì)該基因的特異性擴(kuò)增引物及qPCR 定量檢測(cè)引物（表1）。以SC8 木薯葉片cDNA 作為模板，使用Q5 DNA Polymerase（50 ℃退火20 s，72 ℃延伸 50 s）進(jìn)行CDS 區(qū)序列擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物純化后回收目的片段，構(gòu)建至中間載體pEASY-Blunt，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽(yáng)性克隆送深圳華大基因科技有限公司Sanger 測(cè)序，選取序列正確的陽(yáng)性單克隆搖菌提取重組質(zhì)粒。

使用DNAMAN v6 軟件進(jìn)行木薯、擬南芥、麻風(fēng)樹(shù)、山谷櫟、橡膠樹(shù)、蓖麻、水稻、番木瓜、甜橙、大豆、銀白楊的FKBP20 蛋白氨基酸序列比對(duì)。

1.2.2 MeFKBP20 基因表達(dá)模式分析 以SC8 木薯新葉、成熟葉、頂芽、葉柄、塊根木質(zhì)部、塊根韌皮部、須根及病原菌XpmCHN11 侵染0、3、6 h 和1、3、6 d 葉片的cDNA 為模板，木薯Tubulin基因作內(nèi)參，使用 TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析MeFKBP20 基因的表達(dá)模式。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 酵母雙雜交驗(yàn)證蛋白MeHsfB3b 與MeFKBP20 的互作關(guān)系 將MeFKBP20 基因構(gòu)建至pGBKT7 載體，與空載體pGADT7 通過(guò)酵母轉(zhuǎn)化液共轉(zhuǎn)至AH109 酵母細(xì)胞， 涂布在SD/-Trp/-Leu（SD/TL）平板篩選陽(yáng)性克隆。液體SD/TL培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)陽(yáng)性單克隆， 梯度稀釋?zhuān)?點(diǎn)SD/-Trp/-Leu （SD/TL ）、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade（SD/TLHA）、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/+X-α-Gal平板進(jìn)行毒性及自激活檢測(cè)。

將無(wú)毒性、無(wú)自激活活性重組質(zhì)粒pGBKT7-MeFKBP20 與pGADT7-MeHsfB3b 、pGADT7-MeHsfB3b（1～127 AA）、pGADT7-MeHsfB3b（1～201 AA）、pGADT7-MeHsfB3b（127～241 AA）分別共轉(zhuǎn)化AH109 酵母細(xì)胞，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選，驗(yàn)證互作關(guān)系及互作區(qū)域。

1.2.4 雙分子熒光互補(bǔ)驗(yàn)證蛋白MeHsfB3b 與MeFKBP20 的互作關(guān)系 使用Nimble Cloning 試劑盒將MeHsfB3b 蛋白融合在nEYFP 的N 端獲得pNC-BiFC-Enc-MeHsfB3b 載體，將MeFKBP20 蛋白融合在cEYFP 的N 端獲得pNC-BiFC-Ecc-MeFKBP20 載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101（pSoupp19）菌株。按照驗(yàn)證組（pNC-BiFC-Enc-MeHsfB3b+pNC-BiFC-Ecc-MeFKBP20）和對(duì)照組（pNC-BiFCEnc+pNC-BiFC-Ecc 、pNC-BiFC-Enc-MeHsfB3b+pNC-BiFC-Ecc 、pNC-BiFC-Enc+pNC-BiFC-Ecc-MeFKBP20）的菌液體積1∶1 混合注射本生煙草葉片，常規(guī)培養(yǎng)48～72 h，使用激光共聚焦顯微鏡觀察YFP 熒光，拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeFKBP20 基因克隆及序列分析

根據(jù)木薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息設(shè)計(jì)MeFKBP20基因的特異性引物，通過(guò)RT-PCR 擴(kuò)增SC8 木薯品種的MeFKBP20 基因編碼區(qū)， 結(jié)果獲得約600 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1）。Sanger 測(cè)序顯示獲得1 個(gè)561 bp 基因片段，編碼186 個(gè)氨基酸殘基。蛋白序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，木薯MeFKBP20 蛋白與麻風(fēng)樹(shù)、橡膠樹(shù)的FKBP20 同源性最高，分別為92.00%、91.43%，與山谷櫟、蓖麻、番木瓜、甜橙、銀白楊的FKBP20 同源性均大于84.00%，而與擬南芥、大豆、水稻的FKBP20 相似性較低，分別為82.29%、81.14%、80.11%。上述蛋白均具有完整的FKPB_C（FKBP-typepeptidyl-prolylcistransisomerase，PPIase）結(jié)構(gòu)域（圖2）。

2.2 MeFKBP20 基因表達(dá)模式分析

為了分析候選互作蛋白的潛在功能，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究其在不同組織部位及響應(yīng)病原菌XpmCHN11 侵染的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，木薯MeFKBP20 基因在木薯成熟葉、塊根木質(zhì)部、塊根韌皮部和須根的表達(dá)量均較高，而新葉、頂芽、葉柄的表達(dá)量則相對(duì)較低；木薯葉片在接種病原菌XpmCHN11 后，MeFKBP20 基因表達(dá)在6 h后顯著升高，至接種的第6 天基因表達(dá)量較對(duì)照組增高近3.5 倍（圖3）。以上結(jié)果表明，MeFKBP20基因的表達(dá)受到病原菌XpmCHN11 的誘導(dǎo)。

2.3 酵母雙雜交點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證蛋白MeHsfB3b與MeFKBP20 的互作關(guān)系及互作位點(diǎn)

使用酵母轉(zhuǎn)化液將誘餌載體pGBKT7-MeFKBP20 與空載pGADT7 共轉(zhuǎn)至酵母AH109菌株，進(jìn)行毒性及自激活活性檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。共轉(zhuǎn)有誘餌載體pGBKT7-MeFKBP20+pGADT7 的酵母細(xì)胞，只能在SD/-Trp/-Leu 培養(yǎng)基生長(zhǎng)，與陰性對(duì)照（pGADT7-T+pGBKT7-Lam）一致；而陽(yáng)性對(duì)照（pGADT7-T+pGBKT7-p53）在所有缺陷型培養(yǎng)基均能正常生長(zhǎng)，并且能夠激活MEL1 報(bào)告基因合成α-半乳糖苷酶水解底物X-α-Gal 使菌斑呈現(xiàn)藍(lán)色。以上結(jié)果表明，MeFKBP20 蛋白對(duì)酵母細(xì)胞無(wú)毒性且無(wú)自激活活性，可用于酵母雙雜交點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證。

木薯MeHsfB3b 蛋白與MeFKBP20 蛋白酵母雙雜交驗(yàn)證結(jié)果如圖5 所示，共轉(zhuǎn)pGADT7-MeHsfB3b 和pGBKT7-MeFKBP20 質(zhì)粒的AH109酵母菌生長(zhǎng)同陽(yáng)性對(duì)照相似，能夠在所有缺陷型培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，同時(shí)可以激活報(bào)告基因MEL1表達(dá)水解底物X-α-Gal 使菌斑呈現(xiàn)藍(lán)色；而陰性對(duì)照則無(wú)法在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/+X-α-Gal 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。以上結(jié)果表明MeHsfB3b 蛋白與MeFKBP20 蛋白存在互作關(guān)系。

為了進(jìn)一步研究 MeHsfB3b 蛋白與MeFKBP20蛋白的互作區(qū)域，根據(jù)MeHsfB3b 蛋白序列保守區(qū)域逐級(jí)截短為3 段（圖6），分別構(gòu)建至pGADT7載體。將含有MeHsfB3b 基因截短片段的重組質(zhì)粒與pGBKT7-MeFKBP20 組合，共轉(zhuǎn)化AH109酵母細(xì)胞，進(jìn)行互作驗(yàn)證。結(jié)果如圖7 所示，所有的菌落均可以在SD/-Trp/-Leu 培養(yǎng)基正常生長(zhǎng)，而在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 培養(yǎng)基上陰性對(duì)照與pGADT7-MeHsfB3b（1～127 aa）+pGBKT7-MeFKBP20 、pGADT7-MeHsfB3b （ 1～201 aa ） +pGBKT7-MeFKBP20 菌落均無(wú)法生長(zhǎng)，僅含有pGADT7-MeHsfB3b （ 127～241 aa ） +pGBKT7-MeFKBP20 菌落能夠正常生長(zhǎng)并且在含有X-α-Gal 的平板變藍(lán)色，與陽(yáng)性對(duì)照一致。說(shuō)明MeHsfB3b 蛋白通過(guò)201～241 aa 區(qū)域與MeFKBP20蛋白相互作用。

2.4 雙分子熒光互補(bǔ)驗(yàn)證蛋白MeHsfB3b 與MeFKBP20 的互作關(guān)系

將MeHsfB3b 蛋白融合在nEYFP 的N 端、MeFKBP20 蛋白融合在cEYFP 的N 端構(gòu)建BiFC驗(yàn)證載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)化驗(yàn)證其互作關(guān)系。如圖8 所示，所有對(duì)照組均無(wú)黃色熒光， 驗(yàn)證組pNC-BiFC-Enc-MeHsfB3b+pNC-BiFC-Ecc-MeFKBP20 在細(xì)胞膜發(fā)出黃色熒光。表明，MeHsfB3b 蛋白與MeFKBP20 蛋白在細(xì)胞膜發(fā)生相互作用。

3 討論

熱激轉(zhuǎn)錄因子作為植物體內(nèi)重要的調(diào)控因子，廣泛參與包括極端溫度脅迫、干旱脅迫、鹽堿脅迫的非生物脅迫響應(yīng)以及病原菌、害蟲(chóng)造成的生物脅迫防御過(guò)程[10-11]。熱激轉(zhuǎn)錄因子家族HsfA 亞族在其C 端具有AHA 基序的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域， 可獨(dú)立調(diào)控下游基因的表達(dá)。擬南芥AtHsfA6a 基因通過(guò)ABA 依賴(lài)性信號(hào)通路調(diào)節(jié)大量與脅迫相關(guān)的靶基因增強(qiáng)種子萌發(fā)期和幼苗期對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫的耐受性[25]。ZHOU 等[26]研究發(fā)現(xiàn)番茄受到RKNs（根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)屬的植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)）攻擊時(shí)，HsfA1a 作為關(guān)鍵性調(diào)控因子接受應(yīng)激信號(hào)轉(zhuǎn)錄表達(dá)，激活Wfi1（whitefly induced1）依賴(lài)性ROS 信號(hào)誘導(dǎo)受損細(xì)胞周?chē)l(fā)生超敏反應(yīng)（HR），進(jìn)而防御RKNs 對(duì)植株的侵害。HsfB和HsfC 缺少該基序無(wú)轉(zhuǎn)錄激活活性無(wú)法調(diào)控下游基因[27]。有研究表明，HsfB 亞族可通過(guò)與其他蛋白的相互作用協(xié)同調(diào)控下游基因表達(dá)做出應(yīng)激反應(yīng)。番茄在熱應(yīng)激狀態(tài)下，分子伴侶HSP90 協(xié)同HsfB1 既可作為熱應(yīng)激誘導(dǎo)基因（HS-gene）的中間阻遏物進(jìn)行負(fù)調(diào)控，又可以作為其他轉(zhuǎn)錄因子的共激活因子被招募到管家基因（HK-gene）啟動(dòng)子區(qū)的Hsf 結(jié)合位點(diǎn)正調(diào)控基因表達(dá)[28]。木薯MeHsfB3b 基因分屬于B 族，不具備轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域[29]，可能通過(guò)與其他蛋白相互作用協(xié)同調(diào)控下游靶基因表達(dá)響應(yīng)病原菌XpmCHN11 侵染。前期通過(guò)酵母雙雜交文庫(kù)篩選，獲得候選互作蛋白MeFKBP20。本研究通過(guò)酵母雙雜交點(diǎn)對(duì)點(diǎn)、雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明MeHsfB3b 蛋白通過(guò)201～241 aa 區(qū)域與MeFKBP20 蛋白作用。

FKBPs 屬于FK506 結(jié)合蛋白家族，參與廣泛的生物過(guò)程，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)折疊、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫抑制[30] 。CYBELLE 等[31] 發(fā)現(xiàn)PASTICCINO1（一種FKBP 蛋白）蛋白通過(guò)C 端結(jié)構(gòu)域控制著蛋白的亞細(xì)胞分布以及與其他蛋白的相互作用，同時(shí)能夠招募轉(zhuǎn)錄因子NAC 家族的成員，并將該轉(zhuǎn)錄因子靶向到細(xì)胞核中。有研究表明，過(guò)量表達(dá)辣椒FKBP15-2 可以增強(qiáng)植物對(duì)疫霉菌的免疫反應(yīng)[24]。擬南芥敲除AtFKBP65 基因?qū)е聦?duì)丁香假單胞菌的敏感性增強(qiáng)，而過(guò)量表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)WRKY33 和bGS2 基因轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞壁積累更多的胼胝質(zhì)阻止丁香假單胞菌快速侵入植物組織[32]。本研究通過(guò)對(duì)MeFKBP20 基因的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)該基因在華南8 號(hào)木薯多組織部位高表達(dá)，并且該基因的表達(dá)受到木薯細(xì)菌性枯萎病病原菌XpmCHN11 的誘導(dǎo)，表明該基因可能參與木薯對(duì)CBB 的響應(yīng)過(guò)程。因此推測(cè)XpmCHN11病原菌侵染木薯誘導(dǎo)MeFKBP20 和MeHsfB3b 蛋白表達(dá)并相互作用，協(xié)同調(diào)控褪黑素合成基因表達(dá)，增強(qiáng)抗病性。在后續(xù)研究中，本課題組將通過(guò)轉(zhuǎn)基因及基因編輯進(jìn)行穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步驗(yàn)證MeFKBP20-MeHsfB3b 分子模塊調(diào)控木薯抗病的功能，深入挖掘抗病功能基因資源，為培育抗細(xì)菌性枯萎病的木薯新種質(zhì)提供理論依據(jù)和新的策略。