張 研,李 剛,張 茜△,哈小琴,吳 濤

(1.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院血液科,蘭州 730050;2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,蘭州 730000;3.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院檢驗(yàn)科,蘭州 730050)

流行性感冒(以下簡(jiǎn)稱流感)是由流感病毒引起的一種急性呼吸道疾病,主要臨床表現(xiàn)為高熱和寒戰(zhàn)、頭痛、全身無(wú)力、肌肉和關(guān)節(jié)嚴(yán)重疼痛,以及呼吸道癥狀(咽痛、干咳和咳嗽等),嚴(yán)重危害人類健康安全[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球每年因流感導(dǎo)致重癥300萬(wàn)～500萬(wàn)例,死亡29萬(wàn)～65萬(wàn)例[2]。流感病毒屬于正黏病毒科,是一種多節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒,感染潛伏期為18～72 h[3],分為甲、乙、丙、丁型流感病毒4種類型,其中甲型流感病毒(influenza A virus,IVA)變異性最強(qiáng)。IVA具有高度傳染性,傳播速度快,每年都會(huì)引起全球大流行。據(jù)報(bào)道,甲型H1N1流感病毒有感染免疫力低下宿主的傾向,此類人群被感染后會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)和相關(guān)并發(fā)癥,導(dǎo)致死亡率升高[4]。目前主要通過(guò)接種疫苗和抗病毒治療兩種措施防治流感[5]。而病毒突變或重組會(huì)改變其生物學(xué)特性,降低疫苗的效力,增加人群被頻繁感染的可能性,導(dǎo)致免疫力低下人群的重癥率、死亡率升高。目前仍未研制出能對(duì)抗不斷變異的流感病毒的通用疫苗,因此,研制能夠直接攻擊病毒感染靶細(xì)胞的藥物或通用疫苗成為科學(xué)界亟須解決的問(wèn)題。自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK細(xì)胞)在非致敏狀態(tài)下迅速進(jìn)入免疫應(yīng)答狀態(tài)發(fā)揮抗病毒作用,并在1～4 h識(shí)別感染靶細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用,還具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用和記憶效應(yīng),基于以上特點(diǎn),NK細(xì)胞有望成為流感的治療性藥物或疫苗。本文就NK細(xì)胞及其免疫激活在甲型流感中的作用進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

1 NK細(xì)胞與IVA

流感對(duì)各年齡段人群均有影響,重癥流感患者多由IVA感染引起。兒童是重癥流感的高危人群,尤其低齡兒童因免疫系統(tǒng)不夠健全極易受病毒攻擊。兒童感染流感病毒可導(dǎo)致肺炎、腦病、腦炎、腦膜炎、脊髓炎、心肌損傷及中耳炎等并發(fā)癥,重癥患兒可迅速進(jìn)展為膿毒性休克、多臟器功能衰竭而死亡。NK細(xì)胞是固有淋巴樣細(xì)胞(innate lymphoid cells,ILC1s)的一部分,是類似于細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞。它通過(guò)抑制增殖、遷移和定植到遠(yuǎn)處組織來(lái)發(fā)揮天然細(xì)胞毒性,殺傷免疫逃逸的感染細(xì)胞[6],并在非致敏狀態(tài)下迅速進(jìn)入免疫應(yīng)答,快速識(shí)別、殺傷免疫逃逸的靶細(xì)胞,其上述特性為早期預(yù)防IVA提供了理論基礎(chǔ)。近年來(lái),使用NK細(xì)胞治療腫瘤及感染性疾病成為臨床研究熱點(diǎn),為獲得濃度更高的NK細(xì)胞用于臨床治療,學(xué)者們從誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)和臍帶血干細(xì)胞中分化NK細(xì)胞。從外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生的iPSC中提取的NK細(xì)胞,其抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)更強(qiáng),目前NK細(xì)胞回輸對(duì)部分腫瘤、感染性疾病的治療有效性已得到證實(shí),現(xiàn)結(jié)合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)總結(jié)回輸NK細(xì)胞防治IVA的研究進(jìn)展,為其藥用或疫苗研發(fā)提供理論依據(jù)。

1.1 NK細(xì)胞與免疫系統(tǒng)

免疫系統(tǒng)是機(jī)體執(zhí)行免疫應(yīng)答及免疫功能的重要系統(tǒng),分為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)和先天免疫系統(tǒng),均具有識(shí)別和清除外來(lái)病原體及腫瘤的功能。適應(yīng)性免疫主要由T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞組成,分別含有大量的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞受體,可以對(duì)體內(nèi)的抗原做出特異性反應(yīng)。先天免疫系統(tǒng)包括吞噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞,在病毒感染、腫瘤進(jìn)展的極早階段可快速而有效地發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤作用。NK細(xì)胞是重要的效應(yīng)淋巴細(xì)胞,其中外周血NK細(xì)胞是富含顆粒的大淋巴樣細(xì)胞,因此又稱為“大顆粒淋巴細(xì)胞”,其抗病毒和抗腫瘤活性最為突出[7]。NK細(xì)胞不僅產(chǎn)生γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)通過(guò)ADCC作用直接殺死靶細(xì)胞控制感染,還可以迅速檢測(cè)到被感染細(xì)胞,在非致敏情況下裂解靶細(xì)胞。當(dāng)NK細(xì)胞被靶細(xì)胞激活時(shí),與靶細(xì)胞形成突觸,裂解顆粒在微管上運(yùn)輸,最后匯聚到突觸后膜[8]。來(lái)自突觸的信號(hào)導(dǎo)致裂解顆粒(顆粒酶、顆粒溶素)極化并與細(xì)胞質(zhì)膜對(duì)接融合,在突觸后膜釋放,從而發(fā)揮抗病毒作用[9-10]。穿孔素為NK細(xì)胞含有的細(xì)胞毒性關(guān)鍵效應(yīng)物,穿孔素與靶細(xì)胞質(zhì)膜融合形成滲透裂解孔,通過(guò)孔轉(zhuǎn)移并激活半胱天冬酶,導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡,并且單個(gè)顆粒酶的釋放也可以殺死靶細(xì)胞。此外,溶酶體相關(guān)膜蛋白1(lysosome-associated membrane protein 1,LAMP1)又稱為CD107a,可通過(guò)脫顆粒作用殺死其他靶細(xì)胞[10]。此外,NK細(xì)胞還通過(guò)激活其他幾種免疫細(xì)胞,如B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞間接發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。

流感病毒屬于單鏈RNA病毒,缺乏病毒RNA聚合酶校對(duì),極易發(fā)生突變[11]。自然選擇有利于病毒傳播特征的演化[12],經(jīng)過(guò)不斷演化,流感病毒傳播能力、免疫逃逸能力明顯增強(qiáng)。NK細(xì)胞作用于靶細(xì)胞后殺傷作用出現(xiàn)較早,在體外1 h、體內(nèi)4 h即可表現(xiàn)出殺傷作用。NK細(xì)胞分為CD56dim、CD56bright、CD56neg 3個(gè)亞群,其中CD56dim NK細(xì)胞群對(duì)受感染細(xì)胞的連續(xù)殺傷作用尤為突出,能夠早期識(shí)別、清除病毒感染的細(xì)胞。因此,回輸NK細(xì)胞有助于降低兒童、老年人、免疫力低下及患有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病人群合并IVA的重癥率、病死率,為疾病的早期預(yù)防提供依據(jù)。

合并基礎(chǔ)性疾病的兒童IVA感染后死亡率增高,尤其應(yīng)關(guān)注<2歲的低齡兒童[13]。由于免疫系統(tǒng)紊亂導(dǎo)致人體90%的疾病發(fā)生、發(fā)展甚至患者死亡。NK細(xì)胞的雙重免疫調(diào)節(jié)作用可維持免疫系統(tǒng)平衡,同時(shí)識(shí)別異常細(xì)胞和正常細(xì)胞,減少對(duì)機(jī)體的損害,減少細(xì)胞因子風(fēng)暴的發(fā)生,降低急危重癥病死率[14]。NK細(xì)胞對(duì)于防治病毒感染均有良好的效果,尤其對(duì)于急危重癥病例可以考慮使用NK細(xì)胞回輸治療。

NK細(xì)胞與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在長(zhǎng)期的免疫反應(yīng)中發(fā)揮協(xié)同作用。雖然NK細(xì)胞被歸類為固有免疫細(xì)胞,但近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明,NK細(xì)胞能像適應(yīng)性免疫細(xì)胞(T、B淋巴細(xì)胞)一樣,具有免疫記憶、長(zhǎng)期存活并介導(dǎo)再次免疫應(yīng)答的作用[15]。其記憶效應(yīng)可以通過(guò)白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-12、IL-15和IL-18的短暫刺激來(lái)實(shí)現(xiàn)。在脂質(zhì)體(liposome,LPS)體內(nèi)給藥誘導(dǎo)的內(nèi)毒素血癥模型中發(fā)現(xiàn)全身炎癥驅(qū)動(dòng)記憶樣NK細(xì)胞的形成,這些NK細(xì)胞在體內(nèi)存活數(shù)周,再次受到抗原刺激后產(chǎn)生更多的IFN-γ使免疫效應(yīng)增強(qiáng)[16]。NK細(xì)胞不僅對(duì)炎性細(xì)胞、巨細(xì)胞病毒、猿免疫缺陷病毒、寨卡病毒等病毒感染具有記憶效應(yīng),對(duì)多種不同亞型的流感病毒(包括H1N1、H3N2、B型)也會(huì)產(chǎn)生記憶樣應(yīng)答,表明NK細(xì)胞對(duì)多種不同流感病毒亞型具有廣泛的免疫記憶,可促進(jìn)流感疫苗實(shí)現(xiàn)交叉保護(hù),這成為NK細(xì)胞疫苗研發(fā)的優(yōu)勢(shì)所在[17-18]。

1.2 NK細(xì)胞與呼吸系統(tǒng)

流感是一種急性病毒性呼吸道感染傳染病。作為內(nèi)部環(huán)境和外部環(huán)境之間的連接,呼吸道成為IVA最主要、最先攻擊的部位。因人群流感疫苗接種率較低,出現(xiàn)合并感染的風(fēng)險(xiǎn)較高[19]。流感病毒感染會(huì)導(dǎo)致過(guò)度炎癥和組織損傷,觸發(fā)NK細(xì)胞的激活并歸巢到受影響的組織[20]。從小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C明,NK細(xì)胞歸巢到感染部位對(duì)早期炎癥反應(yīng)和病毒遏制起到十分重要的作用[21]。一項(xiàng)研究以1 125例IVA感染兒童為研究對(duì)象,結(jié)果發(fā)現(xiàn):兒童IVA與其他病原體的共檢出率高,與腺病毒、肺炎支原體、細(xì)菌共檢出時(shí)可能導(dǎo)致病情加重,與其他兩種及以上病原體共檢出時(shí)易發(fā)生重型流感[22]。合并感染導(dǎo)致機(jī)體免疫反應(yīng)過(guò)度引起嚴(yán)重呼吸窘迫綜合征、低氧血癥及呼吸衰竭等。呼吸系統(tǒng)的第一道防線是固有免疫,當(dāng)IVA入侵宿主呼吸道后NK細(xì)胞作為急性反應(yīng)的效應(yīng)器,迅速殺死感染靶細(xì)胞,并在激活后迅速產(chǎn)生IFN-γ介導(dǎo)細(xì)胞免疫,而且NK細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞有保護(hù)作用。基于以上特性,NK細(xì)胞回輸治療雙重感染的急危重癥患者是一種行之有效的選擇。

1.3 NK細(xì)胞與消化系統(tǒng)

甲型H1N1流感的常見表現(xiàn)與季節(jié)性流感相似,常見癥狀包括發(fā)熱、咳嗽、頭痛、肌肉酸痛、乏力等,有時(shí)會(huì)出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、食欲減退等消化道癥狀,部分患者病情出現(xiàn)突然惡化。流感病毒感染者免疫力低下,易再次被其他病毒感染。研究顯示,免疫系統(tǒng)較弱的人群更容易感染諾如病毒[23],該病毒感染是胃腸炎和嚴(yán)重腹瀉疾病的主要原因,可導(dǎo)致嚴(yán)重脫水危及生命[24]。諾如病毒利用M細(xì)胞穿過(guò)腸道上皮屏障,感染腸黏膜上皮細(xì)胞。雖然諾如病毒感染引起的癥狀會(huì)迅速消失,但在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)依然可以在糞便中檢出病毒[25]。無(wú)癥狀感染者攜帶的病毒體內(nèi)清除時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)60 d,與有臨床癥狀的人群持續(xù)時(shí)間相同,免疫功能低下的患者可能需要數(shù)月甚至數(shù)年[26]。IVA感染延長(zhǎng)了諾如病毒感染恢復(fù)期,部分患者感染后會(huì)出現(xiàn)腸易激綜合征(postinfectious irritable bowel syndrome,PI-IBS)和炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)等并發(fā)癥。在一項(xiàng)關(guān)于胃腸道感染后PI-IBS中醫(yī)證型與輔助性T淋巴細(xì)胞(helper T lymphocyte,Th)1/Th2漂移的相關(guān)性研究中顯示,PI-IBS患者腸黏膜內(nèi)炎癥持續(xù)存在與Th1/Th2漂移存在一定關(guān)系[27]。Th1型細(xì)胞因子包括IL-2、IFN-γ、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-12,主要參與細(xì)胞免疫,抵抗細(xì)胞內(nèi)病原體感染;Th2型細(xì)胞因子包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-10,通過(guò)刺激B淋巴細(xì)胞成熟,參與體液免疫。黏膜持續(xù)的免疫激活狀態(tài)引起Th1/Th2漂移,進(jìn)而導(dǎo)致持續(xù)的腸道功能紊亂。當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染時(shí),Th1/Th2表達(dá)失衡向Th1或Th2漂移,而NK細(xì)胞可以維持Th1/Th2細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。IL-2、IL-12、IFN-α等炎性細(xì)胞因子可明顯提高NK的殺傷活性[28]。激活的NK細(xì)胞合成并釋放免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)定,進(jìn)而發(fā)揮免疫監(jiān)視、抗病毒等作用?？傊?基于以上闡述,NK細(xì)胞有助于改善病情,減少病毒感染后的胃腸道癥狀。

1.4 NK細(xì)胞與循環(huán)系統(tǒng)

流感常在冬季高發(fā),患有心臟基礎(chǔ)疾病者和65歲以上老人是其高危易感人群[29]。流感疫苗接種是預(yù)防流感感染及其并發(fā)癥最有效的方法[30]。一項(xiàng)關(guān)于重慶市1 804名65歲以上老年人的問(wèn)卷調(diào)查顯示,僅有46.90%的老年人愿意接種流感疫苗[31]。疫苗接種率低使流感重癥率和死亡率升高。流感可導(dǎo)致心血管系統(tǒng)急慢性損傷,引起呼吸功能障礙、循環(huán)系統(tǒng)衰竭、肝損傷、腎損傷、多器官衰竭甚至死亡。其中感染性心肌炎最常見,感染介導(dǎo)的Th1/Th2漂移引發(fā)“細(xì)胞因子風(fēng)暴”,進(jìn)而導(dǎo)致暴發(fā)性心肌炎的發(fā)生[32]。病毒感染引起的心肌損傷會(huì)增加原有心臟基礎(chǔ)疾病的治療難度。流感病毒感染合并心臟基礎(chǔ)疾病極易發(fā)展為菌血癥、敗血癥、膿毒血癥、感染性休克,出現(xiàn)循環(huán)系統(tǒng)衰竭甚至死亡[33-34]。健康人群Th1/Th2處于動(dòng)態(tài)平衡,當(dāng)受到病原體刺激時(shí),Th1/Th2平衡失調(diào)并向Th1或Th2漂移。Th1上調(diào)釋放促炎細(xì)胞因子,Th2下調(diào)引起免疫功能紊亂,進(jìn)而促進(jìn)敗血癥、膿毒血癥的發(fā)生、發(fā)展,引起循環(huán)系統(tǒng)衰竭[35-39]?？梢?Th1/Th2平衡是免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵[16],而NK細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)Th1/Th2比例,改變機(jī)體免疫活性,糾正免疫調(diào)節(jié)功能紊亂狀態(tài),減少感染性休克的發(fā)生。

2 NK細(xì)胞制備面臨的挑戰(zhàn)

NK細(xì)胞對(duì)多種病原體的防御至關(guān)重要,其主要來(lái)源于外周血、臍帶血、胚胎,目前臨床使用的NK細(xì)胞主要來(lái)源于外周血[40]。因外周血來(lái)源的NK細(xì)胞僅占外周血淋巴細(xì)胞的15%,生產(chǎn)大量NK細(xì)胞是當(dāng)前面臨的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)[41]。臍帶血因NK細(xì)胞比例較高,可作為外周血的替代,但存在采樣量較小、每單位總數(shù)較低、細(xì)胞毒性低的缺點(diǎn)[42]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),iPSC來(lái)源的NK細(xì)胞具有原料易獲得、高擴(kuò)增、高分化能力等優(yōu)勢(shì),這為大量培養(yǎng)NK細(xì)胞應(yīng)用于臨床帶來(lái)了希望[43]。但是,NK細(xì)胞制備工藝復(fù)雜,不同工藝生產(chǎn)的NK細(xì)胞純度、活性存在差異,并且會(huì)出現(xiàn)相關(guān)表型缺失和功能降低的現(xiàn)象,使其療效各異,也就使得NK細(xì)胞產(chǎn)品進(jìn)入臨床存在一定的限制性。因此,目前大多數(shù)NK細(xì)胞制劑的研發(fā)仍處于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。

3 小結(jié)與展望

盡管NK細(xì)胞產(chǎn)品逐漸進(jìn)入臨床,但仍然存在一定的限制。首先,回輸NK細(xì)胞的增殖活性沒有T淋巴細(xì)胞強(qiáng),導(dǎo)致其清除受病毒感染細(xì)胞的能力降低,只有注入更多的NK細(xì)胞才可以提升治療效果。其次,大多數(shù)NK細(xì)胞制劑仍處于臨床前研究階段[44]。但NK細(xì)胞有其優(yōu)勢(shì),其中最大優(yōu)勢(shì)是長(zhǎng)期冷凍保存不會(huì)影響細(xì)胞功能及殺傷作用;此外,在體內(nèi)存留時(shí)間短不會(huì)因免疫源性而引起副作用[45]?？紤]病毒變異株不斷出現(xiàn)導(dǎo)致疫苗的效力被削弱,充分利用NK細(xì)胞的臨床潛力研制出防治流感的新型藥物或疫苗十分必要,但同時(shí)仍存在著諸多挑戰(zhàn)。