馬繼花 張萍 牛春 石彥鵬

收稿日期：2023-06-08

作者簡(jiǎn)介：馬繼花，助理工程師，主要從事抗生素發(fā)酵菌種生產(chǎn)、選育研究。

*通信作者：石彥鵬，檢驗(yàn)師，主要從事微生物發(fā)酵菌種選育研究。

摘要：通過(guò)單因素及多因素實(shí)驗(yàn)對(duì)卡那鏈霉菌生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化研究。結(jié)果表明：影響卡那鏈霉菌生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基主要因素有碳源的選擇及培養(yǎng)基滅菌前pH值調(diào)節(jié)，實(shí)驗(yàn)確定最佳的碳源為飴糖，培養(yǎng)基滅菌前pH：7.50左右；影響卡那鏈霉菌積累代謝產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)基主要因素有碳源的選擇，微量元素的添加，實(shí)驗(yàn)確定結(jié)果為：最佳碳源是乳糖，其次培養(yǎng)基中添加0.03%FeSO4后發(fā)酵液的濾速比對(duì)照提高了65.0%，搖瓶效價(jià)比對(duì)照提高了21.97%。

關(guān)鍵詞：卡那鏈霉菌；培養(yǎng)基；pH值；微量元素；濾速；搖瓶發(fā)酵

中圖分類號(hào)：R978.1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ?文章編號(hào)：1001-8751（2024）02-0100-09

Optimization of Carbon and Nitrogen Sources and Trace Elements for

Streptomyces kanamyceticus Production

Ma Ji-hua，Zhang Ping，Niu Chun，Shi Yan-peng

（Ningxia Tairui Pharmaceutical Co.， Ltd.，? ?Yinchuan? ?750101）

Abstract： The growth and reproduction medium of Streptomyces kanamyceticus was optimized by a series of single-factor and multi-factor experiments. The results showed that the main factors affecting the growth of the solid medium of Streptomyces kanamyceticus were the choice of carbon source and the pH adjustment before the medium sterilization. The experiment found that caramel was the optimum carbon source， and that the pH of the medium was approximately 7.50 prior to medium sterilization. The choice of carbon source and the inclusion of trace elements are the primary factors determining the accumulation of metabolites in the Streptomyces kanamyceticus fermentation medium. The experimental results are as follows： the best carbon source is lactose， followed by the filtration of fermentation broth after adding 0.03% FeSO4 to the medium. The speed was increased by 65.0% compared with the control， and the potency of the shake flask was increased by 21.97% compared with the control.

Key words： Streptomyces kanamyceticus;? ?medium;? ?pH value;? ?trace elements;? ?filtration rate;? ?shake flask fermentation

卡那霉素是由卡那鏈霉菌產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素，是合成地貝卡星和阿貝卡星的主要原料，臨床上多用于治療敗血癥和重癥感染等?？擎溍咕a(chǎn)生卡那霉素的主要組分卡那霉素A，但制備半合成抗生素阿貝卡星和地貝卡星的關(guān)鍵原料是卡那霉素Ｂ，而卡那霉素Ｂ的主要來(lái)源是從生產(chǎn)卡那霉素Ａ的廢液中分離得到。目前，由于分離工藝復(fù)雜，含量少，得來(lái)不易，難以滿足工業(yè)化需求，從而大大制約了阿貝卡星與地貝卡星的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用[1]。因此嘗試應(yīng)用微生物轉(zhuǎn)化方法對(duì)卡那霉素進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，利用微生物中特定的酶將一種物質(zhì)（底物）轉(zhuǎn)化成為另一種物質(zhì)（產(chǎn)物），從而得到一個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的衍生物，有望達(dá)到工業(yè)化應(yīng)用需求[2]。

本文主要是以優(yōu)化驗(yàn)證得到適合該菌種生長(zhǎng)繁殖的固體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基為目的，考察研究固體培養(yǎng)基的成分及菌種最適生長(zhǎng)環(huán)境，進(jìn)一步優(yōu)化得到積累卡那霉素代謝產(chǎn)物的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基成分及確定關(guān)鍵的影響因素，以搖瓶驗(yàn)證結(jié)果為指導(dǎo)可以應(yīng)用到發(fā)酵罐擴(kuò)大生產(chǎn)中，提高發(fā)酵產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌種

卡那霉素鏈霉菌，編號(hào)CGMCC4.1441，為中國(guó)科學(xué)院普通微生物菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 固體培養(yǎng)基

（1）酵母抽提物0.4 g，麥芽提取物0.4 g，葡萄糖0.4 g，燕麥片2.0 g，瓊脂2.0 g，定容至100 mL，pH7.0，28.0 ℃，培養(yǎng)8 d（該培養(yǎng)基為CGMCC提供菌種擴(kuò)培培養(yǎng)基）。

（2）牛肉膏0.3 g，蛋白胨0.5 g，氯化鈉0.5 g，飴糖1.0～1.5 g，瓊脂2.0 g，定容至100 mL，pH7.5，26.8～27.0 ℃，培養(yǎng)8 d[3]。

（3）牛肉膏0.2 g，蛋白胨0.5 g，氯化鈉0.3 g，葡萄糖.5 g，瓊脂2.5 g，定容至100 mL，pH7.5，27 ℃，培養(yǎng)5 d[4]。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

（1）可溶性淀粉2.0 g，葡萄糖0.5 g，氯化鈉0.4 g，豆餅粉2.5 g，硝酸鈉0.5 g，碳酸鈣0.1 g，定容至100 mL，pH自然[4]。

（2）可溶性淀粉1.5 g，葡萄糖0.5 g，蛋白胨0.5 g，酵母粉0.5 g，氯化鈉0.05 g，硫酸銨0.05 g，磷酸氫二鉀0.05 g，硫酸鎂0.05 g，碳酸鈣0.1 g，定容至100 mL，pH7.5，28 ℃，220 r/min，48 h[2]。

（3）可溶性淀粉2.0 g，葡萄糖0.5 g，酵母粉0.1 g，氯化鈉0.4 g，豆餅粉2.0 g，玉米粉1.0 g，硝酸鈉0.1 g，碳酸鈣0.5 g，定容至100 mL，pH7.2～7.5，27.0～28 ℃，220 r/min，46～50 h[5]。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

（1）可溶性淀粉2.5 g，黃豆餅粉3.0 g，麥芽糖2.5 g，硝酸鈉0.8 g，硫酸鋅0.01 g，定容至100 mL，pH7.2，27 ℃，230～240 r/min，接種量10%，144 h[6]。

（2）可溶性淀粉4.0 g，葡萄糖0.5 g，蛋白胨0.5 g，花生餅粉2.0 g，磷酸氫二鉀0.05 g，硫酸鎂0.05 g，碳酸鈣0.1 g，定容至100 mL，pH7.8，28 ℃，240 r/min，接種量8%，120 h[2]。

（3）可溶性淀粉6.0 g，黃豆餅粉5.0 g，硝酸鈉0.8 g，硫酸鋅0.02 g，葡萄糖0.5 g，麥芽粉4.0 g，定容至100 mL，pH7.2～7.5，27.0～28.0 ℃，接種量10%，120～130 h[5]。

1.3 主要儀器及試劑

電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）、酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、離心機(jī)（上海安享科學(xué)儀器廠）、生化培養(yǎng)箱（上海申光儀器儀表有限公司）、搖瓶機(jī)（樂(lè)山長(zhǎng)征制藥機(jī)械有限公司）、凈化工作臺(tái)（無(wú)錫市百凈凈化科技有限公司）、紫外風(fēng)光光度計(jì)（日本島津有限公司）。試劑均為分析純。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 固體培養(yǎng)基篩選及優(yōu)化方法

通過(guò)文獻(xiàn)查閱得到上述固體培養(yǎng)基配方，按照三種配方制備空白平板，用培養(yǎng)成熟的新鮮斜面按照10倍稀釋分離法分離，觀察平板上菌落生長(zhǎng)情況，初步篩選出卡那鏈霉菌菌落生長(zhǎng)較好的固體培養(yǎng)基配方，然后用單因素試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基配方中的碳源葡萄糖、麥芽糖、乳糖、飴糖和蔗糖進(jìn)行篩選，觀察記錄平板上菌落生長(zhǎng)情況。

1.4.2 種子培養(yǎng)基篩選

對(duì)卡那鏈霉菌生長(zhǎng)的不同種子培養(yǎng)基配方進(jìn)行初步篩選，得到較適合菌絲體生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)基配方。

1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)基篩選及優(yōu)化方法

通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)[2，5-6]進(jìn)行檢索，對(duì)產(chǎn)卡那霉素的不同發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行初步篩選，得到較適合該菌種生長(zhǎng)繁殖的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，然后利用正交試驗(yàn)對(duì)初選發(fā)酵培養(yǎng)基配方中的物料可溶性淀粉、黃豆餅粉、麥芽糖、硝酸鈉和硫酸鋅進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇正交表L18（37）進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.4 培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)：用75%的酒精脫脂棉對(duì)凍干管外表面進(jìn)行消毒后，用火焰加熱其頂端，滴少量無(wú)菌水至加熱的凍干管頂端使之破裂，用鑷子敲下破裂的頂端玻璃，加1 mL滅菌純化水完全溶解，取適量菌懸液加到斜面培養(yǎng)基上均勻劃線，放于26.8～27.0 ℃，培養(yǎng)8 d[3]。

種瓶培養(yǎng)：取活化的新鮮斜面挖塊0.5 cm2接到裝有30 mL種子培養(yǎng)基的300 mL三角瓶中培養(yǎng)，27.0～28 ℃，220 r/min，46～50 h[5]。

發(fā)酵瓶培養(yǎng)：按照10%的接種量（V/V）將種子液接入“1.2.3”三種不同發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基裝量為300 mL三角瓶中，裝培養(yǎng)基40 mL，27.0～28.0 ℃，接種量10%，120～130 h[5]。

1.4.5 菌體濃度測(cè)定

取10 mL發(fā)酵液，以3000 r/min，離心10 min，測(cè)量上清液體積，計(jì)算得出菌體濃度（%）=（10－上清液體積）/10×l00%。

1.4.6 效價(jià)檢測(cè)方法配制

（1）卡那霉素試劑溶液配制? ?1.86 g/L，稱取卡那霉素0.186 g，用水溶解后，定容于100 mL容量瓶中，備用。茚三酮溶液：10.00 g/L，稱取茚三酮 1.00 g，用無(wú)水乙醇溶解后，定容于100 mL容量瓶中，備用。乙酸—乙酸鈉緩沖溶液：分別配制0.1 mol/L 的乙酸和乙酸鈉溶液，在pH計(jì)調(diào)控下，配制不同pH的緩沖溶液，備用。 卡那霉素、茚三酮、氫氧化鈉、冰乙酸和無(wú)水乙醇均為分析純，試驗(yàn)用水為純化水[7]。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制? ?取10 mL燒杯8個(gè)，分別加入卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液0.40 mL，0.70 mL，1.00 mL，1.30 mL，1.60 mL，1.90 mL，2.20 mL和2.50 mL，然后依次加入乙酸一乙酸鈉溶液1.00 mL，茚三酮溶液1.00 mL，按試驗(yàn)方法處理，以試劑空白為參比，測(cè)量其在563 nm處的吸光度[7]。

（3）搖瓶發(fā)酵液處理? ?取發(fā)酵液用鹽酸調(diào)節(jié)pH為5.0～6.0，過(guò)濾，取稀釋倍數(shù)適量的樣品1.00 mL+乙酸—乙酸鈉緩沖溶液1.00 mL+茚三酮溶液1.00 mL，然后沸水浴20 min，純化水定容至25 mL，在563 nm處測(cè)量其吸光度[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 固體培養(yǎng)基初選實(shí)驗(yàn)

2.1.1 不同固體培養(yǎng)基對(duì)卡那鏈霉菌菌落生長(zhǎng)的影響

選用新鮮斜面刮取0.5～1.0 cm2斜面孢子制成適宜濃度的菌懸液，按照10倍稀釋分離法取10-6和10-7各0.1 mL菌懸液加入到三種分離平板上，用刮棒涂布均勻，按照相應(yīng)的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)并觀察記錄。

卡那鏈霉菌為放線菌，菌體生長(zhǎng)較快，孢子豐富，呈白色，因此由表1可知，固體培養(yǎng)基配方編號(hào)2的配方較好。但是該平板在2～8 ℃冰箱保存過(guò)程中發(fā)現(xiàn)隨著保藏時(shí)間延長(zhǎng)，菌落上的孢子會(huì)減少，出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，這可能是培養(yǎng)基中采用葡萄糖做碳源受到影響[3]。

2.1.2 固體培養(yǎng)基中碳源對(duì)菌落與斜面生長(zhǎng)的影響

固體培養(yǎng)基是供菌種繁殖大量孢子的培養(yǎng)基，對(duì)這種培養(yǎng)基的要求是能使菌體生長(zhǎng)快，產(chǎn)孢子數(shù)最多且質(zhì)量好并且不會(huì)引起菌種變異，能保持菌種優(yōu)良特性，因而選擇一個(gè)適合的產(chǎn)孢子培養(yǎng)基非常關(guān)鍵，下面對(duì)葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、飴糖和D-半乳糖進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

從表2中觀察記錄的菌落形態(tài)與斜面外觀看，培養(yǎng)卡那鏈霉菌的固體培養(yǎng)基中比較適合的碳源依次是飴糖、麥芽糖和葡萄糖。從菌落生長(zhǎng)外觀描述看，飴糖培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落菌層厚，飽滿結(jié)構(gòu)緊密而堅(jiān)硬，呈褶皺狀，能產(chǎn)豐富的白色孢子，麥芽糖略差一些；而葡萄糖培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落菌層厚、軟，有少量的白色孢子，由此可確定飴糖是較適合的碳源。但是不同批號(hào)的飴糖質(zhì)量不同，對(duì)斜面產(chǎn)孢子的影響很大。陳舊的飴糖和酸度高的飴糖效果不佳，表現(xiàn)為斜面氣生菌絲短，不產(chǎn)孢子或產(chǎn)孢子量少，因而斜面呈灰白色，菌落光禿，結(jié)構(gòu)致密，前期生長(zhǎng)過(guò)快，后期生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵單位偏低。其影響因素估計(jì)與飴糖制備工藝中微量元素以及其他維生素含量有關(guān)，陳舊飴糖由于儲(chǔ)存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，儲(chǔ)存條件不好，溫度過(guò)高引起發(fā)酵變酸，產(chǎn)生少量乙醇從而大大影響飴糖的質(zhì)量。

2.1.3 葡萄糖、麥芽糖和飴糖斜面生產(chǎn)力驗(yàn)證

通過(guò)在固體培養(yǎng)基上菌落的外觀觀察得出飴糖營(yíng)養(yǎng)成分更適合該菌種的生長(zhǎng)，將三種不同碳源培養(yǎng)基上的菌體接搖瓶培養(yǎng)驗(yàn)證，確定最佳碳源。

如表3所示，通過(guò)搖瓶驗(yàn)證得出三種碳源搖瓶效價(jià)接近，結(jié)合表2中菌體外觀觀察結(jié)果，以葡萄糖作碳源的培養(yǎng)基，pH值降低速度較其他兩種較快，導(dǎo)致卡那霉素產(chǎn)量低，飴糖性能不穩(wěn)定，因此可用麥芽糖來(lái)替代飴糖。

2.1.4 斜面培養(yǎng)周期對(duì)產(chǎn)孢情況的影響

從表4對(duì)不同培養(yǎng)周期的斜面外觀及斜面菌體壓片觀察記錄的結(jié)果看，斜面培養(yǎng)9～10 d可得到白色、孢子量豐富的菌體斜面，因此該斜面培養(yǎng)周期至少培養(yǎng)9 d。

2.1.5 固體培養(yǎng)基pH對(duì)單菌落生長(zhǎng)的影響

由于在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)平板培養(yǎng)基pH不同，導(dǎo)致分離平板上菌落生長(zhǎng)有較大的差異性，因此將培養(yǎng)基的pH按照自然pH（5.04）、5.50、6.00、6.50、7.00、7.50進(jìn)行梯度驗(yàn)證。

由表5可知不同pH的平板培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)相差很大，因此可確定固體培養(yǎng)基pH值在7.50左右較好。

2.2 種子培養(yǎng)基初選實(shí)驗(yàn)

2.2.1 不同種子培養(yǎng)基對(duì)菌絲體生長(zhǎng)的影響

種子培養(yǎng)基就是為了擴(kuò)大菌絲體繁殖，能在短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)量多質(zhì)量高的菌種，以滿足發(fā)酵生產(chǎn)的需要，對(duì)“1.2.2”中三種不同種子培養(yǎng)基配方進(jìn)行驗(yàn)證，在相同培養(yǎng)條件下，篩選出菌體濃度高，菌絲形態(tài)好的培養(yǎng)基配方即可作為卡那鏈霉菌生長(zhǎng)繁殖菌絲體的配方。

由表6記錄的各參數(shù)值及菌絲形態(tài)看，種子培養(yǎng)基配方1比較適合該菌種菌絲體擴(kuò)大培養(yǎng)。

2.2.2 種子培養(yǎng)周期對(duì)生產(chǎn)能力的影響

用篩選得到的種子培養(yǎng)基配方1配制種子培養(yǎng)基，用發(fā)酵培養(yǎng)基初選得到的發(fā)酵培養(yǎng)基配方1作為搖瓶配方，驗(yàn)證最佳的種子培養(yǎng)周期對(duì)生產(chǎn)能力的影響。

由表7和圖1所示，隨著種子培養(yǎng)周期的增加種子pH和菌體濃度逐漸上升，培養(yǎng)48 h菌體菌濃呈下降趨勢(shì)，其對(duì)應(yīng)的生產(chǎn)能力達(dá)到最高，經(jīng)驗(yàn)證數(shù)據(jù)分析得種子培養(yǎng)周期48 h最佳。

2.3 卡那鏈霉菌生產(chǎn)發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基選擇

2.3.1 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)卡那鏈霉菌搖瓶效價(jià)的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基是發(fā)酵生產(chǎn)中最主要的培養(yǎng)基，由于發(fā)酵培養(yǎng)基的主要作用是為了最大限度地獲得目的產(chǎn)物，因此必須根據(jù)菌體自身生長(zhǎng)規(guī)律及產(chǎn)物合成的特點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)培養(yǎng)基。下面對(duì)查閱文獻(xiàn)[2，5-6]得到的發(fā)酵培養(yǎng)基配方進(jìn)行搖瓶驗(yàn)證，以搖瓶發(fā)酵液檢測(cè)的效價(jià)單位來(lái)判定比較適合卡那鏈霉菌菌種代謝產(chǎn)物積累的發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

由表8可知發(fā)酵培養(yǎng)基配方1搖瓶驗(yàn)證效價(jià)較高，重復(fù)性較好，但是發(fā)酵液過(guò)濾濾速較慢，因此對(duì)初選出的培養(yǎng)基配方采用正交試驗(yàn)方法對(duì)培養(yǎng)基各種成分及配比進(jìn)一步優(yōu)化驗(yàn)證。

2.3.2 初選搖瓶培養(yǎng)基配方正交試驗(yàn)優(yōu)化

采用正交試驗(yàn)對(duì)可溶性淀粉、黃豆餅粉、麥芽糖、硝酸鈉和硫酸鋅的配比進(jìn)一步優(yōu)化，選用L18（37）正交表，其正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表9，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表10。

采用SPSS 18.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。由表10可知，雖每批試驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有完全重復(fù)，按照培養(yǎng)基中原材料成分占比綜合分析各因素對(duì)產(chǎn)卡那霉素效價(jià)的影響程度為：麥芽糖＞黃豆餅粉＞硫酸鋅＞硝酸鈉＞可溶性淀粉，試驗(yàn)最優(yōu)組合為可溶性淀粉4.0 g、黃豆餅粉4.0 g、麥芽糖2.5 g、硝酸鈉0.8 g和硫酸鋅0.05 g。

2.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基中添加FeSO4對(duì)搖瓶效價(jià)及發(fā)酵液濾速的影響

趙靜巖等[8]研究發(fā)現(xiàn)用發(fā)酵罐擴(kuò)大生產(chǎn)，硫酸鋅加量為0.02%效價(jià)最好，另外提出鐵是菌體細(xì)胞、細(xì)胞色素氧化酶和過(guò)氧化酶的輔基，對(duì)菌絲體生長(zhǎng)發(fā)育和形成卡那霉素來(lái)說(shuō)是必需的微量元素。由于培養(yǎng)基組成和配比以及發(fā)酵條件不同，發(fā)酵罐和搖瓶利于提高效價(jià)的最適鐵離子濃度存在很大差異。生產(chǎn)罐卡那霉素發(fā)酵培養(yǎng)液鐵離子的適合濃度是50 μg/mL，下面需要對(duì)搖瓶培養(yǎng)基中硫酸亞鐵的加量進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

由表11顯示的搖瓶效價(jià)得知，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同量的FeSO4后搖瓶效價(jià)比不添加FeSO4的搖瓶效價(jià)均有不同程度的提高，其中添加量以0.03%較好；其次發(fā)現(xiàn)添加FeSO4后發(fā)酵液的濾速比對(duì)照提高了65.0%，發(fā)酵液搖瓶效價(jià)比對(duì)照提高了21.97%。

2.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同碳源對(duì)產(chǎn)卡那霉素的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中選擇不同的碳源對(duì)積累代謝產(chǎn)物有一定的影響。選取葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、飴糖和乳糖進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。葡萄糖幾乎是所有微生物都能利用的速效碳源。麥芽糖、可溶性淀粉、蔗糖和飴糖水解產(chǎn)物都可得到葡萄糖，乳糖是由葡萄糖和半乳糖組成的雙糖。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入生產(chǎn)后期，葡萄糖降解物具有抑制N-乙?？敲顾仵０匪饷负铣傻淖饔茫档涂敲顾禺a(chǎn)量。因此，發(fā)酵碳源必須以多糖為主，既利于發(fā)酵前期菌體快速生長(zhǎng)，又能確保生產(chǎn)期菌體緩慢利用，提高卡那霉素產(chǎn)量。

從表12中數(shù)據(jù)可知，經(jīng)搖瓶驗(yàn)證供卡那鏈霉菌菌種生長(zhǎng)較好的碳源有飴糖、乳糖、麥芽糖+可溶性淀粉，其次是可溶性淀粉。經(jīng)Umezawa氏證實(shí)發(fā)酵液pH值在8.00～8.60之間是較適合合成卡那霉素[9]。從發(fā)酵液pH值可知，飴糖與麥芽糖+可溶性淀粉為碳源的發(fā)酵液pH值不在合成卡那霉素最適的pH值范圍，并且搖瓶效價(jià)均低于乳糖，而乳糖在發(fā)酵5 d周期時(shí)搖瓶效價(jià)已達(dá)到最高，延長(zhǎng)發(fā)酵周期搖瓶效價(jià)并沒(méi)有增長(zhǎng)，因此確定最佳碳源是乳糖。

2.3.5 優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方驗(yàn)證

培養(yǎng)基最佳配方通過(guò)驗(yàn)證可以確定。初選配方：可溶性淀粉2.5 g，黃豆餅粉3.0 g，麥芽糖2.5 g，硝酸鈉0.8 g，硫酸鋅0.01 g，定容至100 mL，pH7.2；優(yōu)化配方：乳糖6.5 g、黃豆餅粉4.0 g、硝酸鈉0.8 g、硫酸鋅0.03 g、硫酸亞鐵0.03 g，定容至100? mL，pH7.2；按照上述配方做搖瓶驗(yàn)證，搖瓶培養(yǎng)5? d放瓶測(cè)效價(jià)。

從表13結(jié)果分析可知，優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基更適合卡那鏈霉菌代謝產(chǎn)物的合成，優(yōu)化后配方平均搖瓶效價(jià)比對(duì)照提高了50.32%。

3 結(jié)果與討論

通過(guò)對(duì)卡那鏈霉菌生長(zhǎng)繁殖的固體培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)，以葡萄糖為原料的平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落挑單轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上，菌體生長(zhǎng)較快，但產(chǎn)孢子量很少，斜面不白；以飴糖為原料的平板培養(yǎng)基生長(zhǎng)的菌落菌層厚硬色白，是卡那鏈霉菌生長(zhǎng)的較優(yōu)碳源；其次培養(yǎng)基pH值是影響菌體生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證確定固體培養(yǎng)基自然pH值（5.04），消前pH值在7.50左右較好。影響卡那鏈霉菌積累代謝產(chǎn)物的發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)優(yōu)化驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)最佳的碳源是乳糖，其次搖瓶培養(yǎng)基中添加0.03%FeSO4后發(fā)酵液的濾速比對(duì)照提高了65.0%，搖瓶效價(jià)比對(duì)照提高了21.97%。通過(guò)對(duì)正交試驗(yàn)優(yōu)化配方進(jìn)行驗(yàn)證，優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基配方平均搖瓶效價(jià)比對(duì)照提高了50.32%。

本文通過(guò)對(duì)卡那鏈霉菌菌種生長(zhǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基優(yōu)化后，確定了最佳培養(yǎng)基成分，后期可將搖瓶驗(yàn)證的相關(guān)物料試用于發(fā)酵罐中試驗(yàn)驗(yàn)證，有望提高產(chǎn)量，增加收益。

參 考 文 獻(xiàn)

陳暉， 溫淑平， 洪文榮. 卡那霉素B工程菌的構(gòu)建及其發(fā)酵特性研究[J]. 寧夏大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2017， 38（1）：83-89.

楊良. 氨基糖苷類抗生素卡那霉素B的微生物轉(zhuǎn)化[D]. 福州： 福建醫(yī)科大學(xué)， 2012.

于心若. 影響卡那霉素及紅霉素產(chǎn)生菌孢子質(zhì)量諸因素的探討[J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)， 1988， 5：18-22.

王嶽五，賈新康，吳正愷.卡那霉素產(chǎn)生菌Kp958-4菌株中與抗菌素產(chǎn)生有關(guān)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化[J].遺傳學(xué)報(bào)，1980（03）：276-280.

顧漱鋒， 吳家琳， 趙靜巖. 卡那霉素發(fā)酵研究[J]. 抗生素， 1980， 4：9-10+8.

趙靜巖， 李靜英， 陳岳花， 等. 卡那霉素鏈霉菌亞硝基胍誘變育種[J]. 遺傳， 1980， 2（3）：17-19.

張雪嬌， 劉春葉， 楊黎燕，等. 可見(jiàn)分光光度法測(cè)定卡那霉素的含量[J]. 期刊論文， 2016， 52（5）：510-513.

趙靜巖， 鐘秀寶. 微量元素鋅、鐵、對(duì)卡那霉素鏈霉菌生物合成卡那霉素的作用[J]. 抗生素， 1980， 4：6-8.

毛振瑪. 生產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌對(duì)碳源及氮源的利用[J]. 中國(guó)抗生素雜志， 1976， 1：40-44.