刁風偉 黃琰哲 許子榮 王保平 周靜 王秀紅

摘要 利用阿須貝氏無氮培養(yǎng)基在番茄根際土中篩選到5株細菌菌株，鑒定菌株生物學分類；然后以番茄為供試植物，分別添加5株菌株菌液為處理，研究根際細菌對番茄幼苗生長和根系結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，5株菌株均顯著降低了番茄幼苗的株高和SPAD值。FN2和FN6菌株顯著降低了植物的干重、鮮重和地上部的投影面積。FN6菌株還降低了植物的根總表面積和根總體積。5株菌株都未呈現(xiàn)出正向促進效應。該研究為開發(fā)根際細菌存在的潛在風險提供警惕。

關(guān)鍵詞 根際細菌；番茄；根系結(jié)構(gòu)；抑制生長

中圖分類號 S641.2? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）11-0032-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.11.008

Effect of? Rhizobacteria on Growth in Tomato Seedling

DIAO Feng-wei，HUANG Yan-zhe，XU Zi-rong et al

（Shanxi Institute of Organic Dryland Farming， Shanxi Agricultural University/Key Laboratory of Sustainable Dryland Agriculture （Co-construction by Ministry of Agriculture and Rural Affairs and Shanxi Province），Taiyuan， Shanxi 030031）

Abstract Five bacterial strains were selected in tomato rhizosphere soil using Ashbys nitrogen-free agar medium，and their biological classifications were identified，respectively. Tomato was used to study the effects of five rhizobacteria on growth and root architecture.The results showed that all five strains significantly decreased the plant height and SPAD index in tomato seedlings.FN2 and FN6 significantly decreased the dry weight，fresh weight and shoot projected area.FN6 also decreased the total root surface area and total root volume of tomato.In a word，the five rhizobacteria did not emerge a positive effect，and this study provided a vigilance against the potential risks on application of rhizobacteria.

Key words Rhizobacteria;Tomato;Root architecture;Inhibition of growth

基金項目 山西省青年科學研究項目（202103021223152）；山西農(nóng)業(yè)大學博士科研啟動項目（2021BQ132）；山西省博士畢業(yè)生、博士后研究人員來晉工作獎勵經(jīng)費科研項目（SXBYKY2022-084） 。

作者簡介 刁風偉（1990—），男，山東聊城人，助理研究員，博士，從事微生物學研究。*通信作者，副研究員，博士，碩士生導師，從事微生物學研究。

收稿日期 2023-08-01

土壤微生物能分解和合成有機物，參與全球元素循環(huán)，它們能夠以互利共生的方式活躍于植物根表，形成結(jié)構(gòu)復雜的根際微生物群落，影響植物營養(yǎng)吸收和健康［1］。這些聚集于根際的微生物群落形成了植物“第二基因組”［2-3］。根際微生物與植物的關(guān)系類似于腸道微生物與人體的關(guān)系［4］。植物能通過根際分泌物以及免疫系統(tǒng)物質(zhì)調(diào)節(jié)根際微生物群落的構(gòu)成，而根際微生物也能通過代謝活動參與到植物的生長發(fā)育、養(yǎng)分吸收和脅迫響應等過程［1］。盡管越來越多的根際微生物被研究，揭示出有促生與生防功能，但根際微生物與植物建立的作用關(guān)系是否長久穩(wěn)定，仍不清楚。

隨著人們對過度施用化肥引起的生態(tài)環(huán)境問題的重視，農(nóng)業(yè)綠色持續(xù)發(fā)展的關(guān)注，包括尿素、二胺等氮肥過剩引起的土壤元素不平衡、植物徒長、果實品質(zhì)低和水體污染、富營養(yǎng)化，甚至誘發(fā)大氣中氮氧化物等溫室氣體含量增加等問題［5］。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，替代如氮肥等化肥，減輕其引起的環(huán)境問題，已經(jīng)刻不容緩。微生物研究者關(guān)注到根際微生物的潛在價值，憑借微生物的固氮作用，探究施用菌劑替代氮肥的可行性。雷海英等［6］采用阿須貝氏（Ashby）無氮培養(yǎng)基，從苦參的根際土中篩選到2株根際固氮菌，分別隸屬于芽孢桿菌屬和假單孢菌屬，將菌劑添加到苦參幼苗中，生長30 d后顯示出添加菌劑增加了植株的株高和葉片數(shù)，促進了植物幼苗生長。薛智權(quán)等［7］采用Ashby無氮培養(yǎng)基篩選到2株具有固氮能力的細菌，黃芪種子分別經(jīng)2種菌液浸泡后種植，與未浸泡菌液的對照相比，株高分別增加了17.8%和64.4%，葉片數(shù)也顯著增加。程杰杰等［8］研究分離自玉米根際的固氮菌株對玉米和水稻的促生效果，結(jié)果顯示，施用菌液對玉米和水稻的生長具有促進作用。然而，篩選的根際促生細菌是否能夠穩(wěn)定地促進植物生長，或者頻繁地施加促生菌菌劑是否會對植物產(chǎn)生負效應，卻鮮有報道。

番茄（Lycopersicon esculentum）屬于管狀花目茄科番茄屬，是世界上價值較高的水果和蔬菜［9］。我國是世界上最大的番茄生產(chǎn)和消費國家之一，2021年我國番茄產(chǎn)量達6 609萬t，在蔬菜作物中位居榜首［10-11］。我國番茄種植方式已從露天種植逐步轉(zhuǎn)向大棚設施內(nèi)，提質(zhì)、增效和集約化管理、生物防治、減肥減藥的原則逐漸深入人心［10］。探究施用根際細菌對番茄生長的影響，具有推動番茄健康發(fā)展的重要意義。筆者采用Ashby無氮培養(yǎng)基從番茄根際土中篩選根際固氮菌，研究根際細菌對番茄幼苗根系及生長的影響，揭示根際細菌在番茄栽培中的應用潛力與風險。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株篩選于番茄根際土壤，該土壤樣品為2022年3月采集于山西農(nóng)業(yè)大學東陽試驗基地大棚內(nèi)結(jié)果期番茄植株根際。

盆栽試驗供試番茄品種為晉番茄四號；栽培基質(zhì)采用蛭石；栽培花盆的規(guī)格為直徑12.0 cm×高12.5 cm×底徑10.0 cm。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸出粉5.0 g，NaCl 10.0 g，一次水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.4。121 ℃高壓蒸汽滅菌21 min備用。

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸出粉5.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂16.0 g，一次水定容至1 000 mL，pH 7.0～7.4。121 ℃高壓蒸汽滅菌21 min備用。

阿須貝氏（Ashby）無氮培養(yǎng)基：甘露醇10.0 g，KH2PO4 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.1 g，CaCO3 5.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，瓊脂15.0 g，一次水定容至1 000 mL，pH 6.8～7.0。

1.3 菌株篩選與鑒定

稱量采集的番茄根際土1 g，將土樣置于含有玻璃珠的錐形瓶中，添加99 mL無菌水，然后37 ℃、170 r/min振蕩30 min，獲得土壤懸濁液。取懸濁液1 mL，使用梯度稀釋法，稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6濃度的懸濁液。然后每一濃度吸取200 μL涂布到Ashby無氮培養(yǎng)基平板上。上述過程重復３次。37? ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察菌落的大小、顏色、邊緣、光澤、透明度等。使用接種環(huán)挑取不同形態(tài)的菌落，分別在新的Ashby無氮培養(yǎng)基平板上反復純化，挑取單菌落反復純化至少7次。將純化的菌株接種到LB固體培養(yǎng)基斜面和Ashby無氮培養(yǎng)基斜面上，置于4 ℃冰箱保存以供下一步使用。另添加20%甘油若滴，保存于-80? ℃冰箱內(nèi)。該過程最終篩選獲得5株菌株，分別命名為F1、FN1、FN2、FN3、FN6。

菌株鑒定采用16S rDNA的分子鑒定方法。收集1 mL OD600為1.0～1.5的細菌菌液，離心棄上清后加入含有酶RNase A的緩沖液，加入溶菌酶，室溫靜置5 min，反復離心、沖洗與水浴，提取細菌的基因組DNA。采用引物27F和1492R（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）進行PCR擴增。反應體系為基因組DNA 1.0 μL， 10×Buffer（含Mg2+）5.0 μL，Taq聚合酶1.0 μL，dNTP 1.0 μL，正反引物各1.5 μL，補充ddH2O至50.0 μL。程序為95? ℃預變性5 min，然后95? ℃變性30 s，58 ℃退火 30 s，72? ℃延伸1.5 min，進行35個循環(huán)，最終72 ℃延伸7 min。按照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒說明書進行PCR產(chǎn)物的回收。使用ABI3730-XL測序儀進行DNA測序，將測序結(jié)果與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得物質(zhì)序列相似性最大的物種信息，作為鑒定結(jié)果。

1.4 菌液的制備

使用接種環(huán)分別挑取在LB固體培養(yǎng)基平板上活化的5株菌株的單菌落，接種至250 mL LB液體培養(yǎng)基中，重復3次。30 ℃ 170 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)3 d，獲得菌液。將重復培養(yǎng)獲得的菌液混合搖勻，用于盆栽試驗。

1.5 盆栽試驗

自2023年2月12日至3月28日，在山西農(nóng)業(yè)大學玻璃溫室內(nèi)進行盆栽試驗，以自然光為光照條件，溫度維持在15～35? ℃，濕度維持在40%～65%。采用完全隨機設計，以番茄作為供試植物，分別添加篩選到的菌株F1、FN1、FN2、FN3、FN6菌液作為處理，添加未接種菌株的培養(yǎng)液作為對照CK，設置6個重復，每盆保留2株植株，共36盆。

挑選外形大小一致且飽滿的番茄種子，用75%乙醇溶液浸泡5 min進行消毒，然后使用蒸餾水沖洗3次，再將種子浸泡在含有無菌水的培養(yǎng)皿內(nèi)。栽培基質(zhì)選取蛭石，先采用高壓蒸汽滅菌法121 ℃、90 min進行滅菌，然后晾干?；ㄅ枋褂?5%乙醇進行消毒。在每個花盆中裝入滅菌的蛭石500 g，然后將番茄種子點播到蛭石表面2 cm以下，每盤點播3粒。采用稱重法保持含水量為80%。10 d出苗后，保留長勢一致的植株，每盆間苗為2株，每盆澆灌Hogland營養(yǎng)液20 mL。繼續(xù)種植14 d后，進行施用菌劑處理。分別添加F1、FN1、FN2、FN3、FN6菌株制成的菌液和未接種菌株的培養(yǎng)液100 mL，24和34 d后，都再次施用相應的菌液100 mL。44 d后，測量番茄植株的株高、莖粗和SPAD值，然后收獲植株。

1.6 指標測量

株高的測量使用精度為1 mm的直尺；莖粗的測量使用精度為0.01 mm的游標卡尺；SPAD值的測量使用葉綠素儀SPAD-502 Plus（Konnica Monlta，日本）。

鮮重的測量使用精度為0.01 g的電子天平稱量植株的地上部和根系；干重的測量使用烘箱70 ℃對測完鮮重的植物樣品烘干2 d，再使用精度為0.000 1 g的電子天平稱量。

根直徑、根總長、根總面積和根總體積的測量使用根系掃描儀Epson Twain Pro（Epson，日本）對平鋪的植物根系進行掃描，然后使用根系形態(tài)學和結(jié)構(gòu)分析軟件WINRhizo分析計算；地上部投影面積的測量同樣使用根系掃描儀Epson Twain Pro對平鋪的植物地上部（包括葉片和莖）進行掃描，然后使用軟件WINRhizo分析計算。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

分別將5種菌株處理的指標與對照的指標進行t檢驗分析，統(tǒng)計結(jié)果P<0.05標記*，P<0.01標記**。統(tǒng)計分析使用軟件SPSS 16.0進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的生物學鑒定

使用Ashby無氮培養(yǎng)基，從連作的番茄根際土中分離篩選到5株菌株，編號為F1、FN1、FN2、FN3和FN6。使用16S rDNA方法對5株菌株進行分子生物學鑒定。結(jié)果顯示，F(xiàn)1、FN1、FN2、FN3和FN6分別與菌株P(guān)aenibacillus mucilaginosus、Mycolicibacterium smegmatis、Nocardioides panacihumi、Mycobacterium asiaticum和Pseudomonas laurentiana具有高度同源性，同源性百分比均大于99%（表1）。5株菌株F1、FN1、FN2、FN3和FN6分別屬于類芽孢桿菌屬（Paenibacillus），分枝菌酸桿形菌屬（Mycolicibacterium），類諾卡氏菌屬（Nocardioides），分枝桿菌屬（Mycobacterium），假單孢菌屬（Pseudomonas）。

2.2 根際細菌對番茄鮮重和干重的影響

由圖1可知，與CK相比，添加5種菌株都呈降低番茄植株生物量的趨勢，F(xiàn)N2和FN6顯著降低植株的地上部鮮重、干重和根系的鮮重和干重。FN2分別降低了36.5%和31.9%的地上部干重和根干重，F(xiàn)N6分別降低了39.1%和33.3%的地上部干重和根干重。

2.3 根際細菌對番茄苗期株高和莖粗的影響

5種菌株都顯著抑制了番茄植株的株高，與對照相比分別降低了13.2%、15.1%、24.6%、20.0%和22.1%，特別是FN2、FN3、FN6達極顯著效果（圖2a）。5種菌株都未顯著影響植物的莖粗（圖2b）。

2.4 根際細菌對番茄葉片SPAD值和地上部投影面積的影響

5種菌株都顯著降低了番茄葉片的SPAD值，且F1、FN1、FN3和FN6達極顯著水平，降幅分別為15.7%、22.7%、20.0%、15.8%和23.8%（圖3a）。

FN2和FN6顯著降低了番茄地上部的投影面積，降幅分別為37.0%和38.7%（圖3b）。

2.5 根際細菌對番茄根系特性的影響

與CK相比，F(xiàn)N1和FN2顯著降低了番茄根直徑，降幅分別為11.7%和11.2%（圖4a）。5種菌株都未顯著影響番茄根總長（圖4b）。與CK相比，F(xiàn)N6顯著降低了根總表面積，降幅為28.9%（圖4c）。與CK相比，F(xiàn)N2和FN6顯著降低了根總體積，降幅分別為32.0%和33.4%（圖4d）。

3 結(jié)論與討論

植物根際促生菌（PGPR）憑借自身的固氮、解磷、解鉀或分泌生長素等多種功能，通常促進植物的生長［12-14］。迄今為止，從自然界中已鑒定出的PGPR菌株有20多個屬，包括假單孢菌屬（Pseudomonas）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）等［15］。其中根際固氮菌屬于PGPR中的一類，因為他們能夠固定空氣中的氮氣，從而增加土壤含氮量，進而促進植物的生長［16-18］。該研究利用Ashby無氮培養(yǎng)基選擇性地篩選出具有固氮能力的根際細菌5株，分別隸屬于5個不同的菌屬，包括假單孢菌屬（Pseudomonas）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、分枝菌酸桿形菌屬（Mycolicibacterium）、類諾卡氏菌屬（Nocardioides）和分枝桿菌屬（Mycobacterium）。

采用Ashby無氮培養(yǎng)基篩選出的細菌菌株，通常表現(xiàn)出促進植物生長的效果。王楠等［19］從植物根際土中篩選到5株根際固氮菌，用于番茄幼苗的促生研究，結(jié)果顯示根際固氮菌增加了番茄幼苗的生物量。雷海英等［6］篩選到的根際固氮菌增加了苦參幼苗子葉的數(shù)目和株高的高度。薛智權(quán)等［7］篩選的根際固氮菌同樣促進了黃芪植株的生長。程杰杰等［8］施用根際固氮菌促進了玉米和水稻的生長。然而，何建清等［20］篩選到10株根際固氮菌應用于青稞幼苗的生長中，結(jié)果顯示， 5株菌株抑制了植物的生長，6株菌株顯著降低了植物的干重，只有1株菌株促進了干物質(zhì)的積累。該試驗結(jié)果顯示，篩選到的5株根際細菌都呈現(xiàn)出抑制番茄幼苗的生長，F(xiàn)N2和FN6還顯著降低了番茄幼苗的地上部和根部干重和鮮重。FN6菌株的負效應還表現(xiàn)在影響根系的表型結(jié)構(gòu)，F(xiàn)N6處理顯著降低了幼苗的根總面積和根總體積。這種負向結(jié)果暗示，根際細菌有時與宿主植物未能保持良好的互利共生關(guān)系?？赡芗毦鷶?shù)量在一定閾值范圍內(nèi)或者共生關(guān)系建立在某些特定生境下，植物才可能在這種共生關(guān)系中受益且被促進生長［21-22］。該研究結(jié)果提示，在利用根際細菌時，應當警惕其引起的負面效益，不可盲目開發(fā)利用。

從番茄根際土中篩選獲得的5株根際細菌，應用于番茄幼苗生長中時，都未呈現(xiàn)正效應。尤其是，F(xiàn)N2和FN6菌株顯著降低了番茄的株高、地上投影面積，抑制了植物生物量的積累，干擾了葉綠素的合成。FN6菌株還對番茄根系生長呈現(xiàn)出抑制效應。這些結(jié)果提醒不能盲目地開發(fā)利用根際細菌，深入地探究根際細菌與植物之間的互作機制很有必要。

參考文獻

［1］崔中利，葉現(xiàn)豐，張宇，等.根際微生物組組裝與植物健康［J］.微生物學雜志，2022，42（6）：1-9.

［2］ 郝志敏，錢欣雨，董金皋.植物微生物組的功能及應用研究進展［J］.微生物學雜志，2021，41（3）：1-7.

［3］ TKACZ A，POOLE P.Role of root microbiota in plant productivity［J］.Journal of experimental botany，2015，66（8）：2167-2175.

［4］ 張瑞福.根際微生物：農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展中大有作為的植物第二基因組［J］.生物技術(shù)通報，2020，36（9）：1-2.

［5］ 楊忠妍.化肥施用過量對農(nóng)作物的危害［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2020（21）：203-204，212.

［6］ 雷海英，趙青松，楊瀟，等.苦參根際高效固氮菌的分離及復合菌肥對幼苗的促生效應［J］.生物技術(shù)通報，2020，36（9）：157-166.

［7］ 薛智權(quán)，唐中偉，李浩，等.山西黃芪根際固氮菌的分離與應用［J］.山西農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2016，36（7）：483-488.

［8］ 程杰杰，殷超凡，薩爾山別克·熱阿合曼，等.固氮菌 Kosakonia radicincitans GXGL-4A 對玉米和水稻的促生作用及其根際定殖動態(tài)［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2018，46（2）：33-37．

［9］ TIEMAN D，ZHU G T，RESENDE M F R，JR，et al.A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor［J］.Science，2017，355（6323）：391-394.

［10］ 牛艷，王曉靜，陳翔，等.中國番茄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)狀問題和對策及寧夏番茄產(chǎn)業(yè)發(fā)展成效［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2022（12）：70-74.

［11］ 霍建勇.中國番茄產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及安全防范［J］.蔬菜，2016（6）：1-4.

［12］ 周益帆，白寅霜，岳童，等.植物根際促生菌促生特性研究進展［J］.微生物學通報，2023，50（2）：644-666.

［13］ 何宏濤，王玉虎，周洪友，等.番茄根際產(chǎn)生長素菌株分離及其對番茄和馬鈴薯幼苗的促生作用［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2022，50（19）：219-225.

［14］? 田婧，李邵，馬寧，等.植物根際促生菌作用機理研究進展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2016，44（10）：1-2，39.

［15］ 韓學東，杜春梅，董錫文.植物根際促生菌研究綜述［J］.鄉(xiāng)村科技，2023，14（5）：87-90.

［16］ 杜普旋，陳榮華，鄧權(quán)清，等.花生根瘤菌的分離篩選及應用［J］.南方農(nóng)業(yè)學報，2023，54（1）：102-109.

［17］ COBAN O，DE DEYN G B，VAN DER PLOEG M.Soil microbiota as game-changers in restoration of degraded lands［J］.Science，2022，375（6584）：1-11.

［18］ 靳海洋，王慧，張燕輝，等.基于基因組的一株土壤固氮菌分離菌株鑒定及其促生作用［J］.微生物學報，2021，61（10）：3249-3263.

［19］ 王楠，李剛強，李云龍，等.固氮類芽孢桿菌的分離鑒定及其促生、抑菌活性的測定［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導報，2019，21（5）：95-103.

［20］ 何建清，張格杰，趙偉進，等.青稞根際優(yōu)良聯(lián)合固氮菌的篩選及鑒定［J］.干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2019，37（5）：182-186，192.

［21］ 曾青，熊超，尹梅，等.植物微生物組生態(tài)功能與群落構(gòu)建過程研究進展［J］.生物多樣性，2023，31（4）：182-198.

［22］ CHERNOV T I，SEMENOV M V.Management of soil microbial communities：Opportunities and prospects （a review）［J］.Eurasian soil science，2021，54（12）：1888-1902.