摘 要:為了降低大豆的抗原性,通過糖基化反應(yīng)制備了大豆7S球蛋白-大棗多糖(7S-JP)復(fù)合物.采用非對稱場流分離技術(shù)在線聯(lián)用紫外可見光檢測器、多角度光散射檢測器和示差折光檢測器(AF4-UV-MALS-dRI)研究糖基化反應(yīng)溫度、時間和物料比對7S-JP復(fù)合物結(jié)構(gòu)的影響,對7S-JP復(fù)合物的回轉(zhuǎn)半徑、摩爾質(zhì)量和構(gòu)象進行表征;采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法探究7S-JP復(fù)合物的抗原性.AF4-UV-MALS-dRI結(jié)果表明:在反應(yīng)溫度為70 ℃、反應(yīng)時間為20 min時,7S與JP糖基化反應(yīng)效果最佳;當(dāng)7S與JP的質(zhì)量比為1∶3時,形成的7S-JP復(fù)合物結(jié)構(gòu)緊密,有利于破壞其空間抗原表位,抗原抑制率為(69.1±0.99)%.
關(guān)鍵詞:
大豆7S球蛋白;大棗多糖;非對稱場流分離
中圖分類號:
O657"" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:
A"" 文章編號:
1000-1565(2024)03-0254-07
Preparation, characterization and antigenicity of soybean 7S globulin-jujube polysaccharide complexes
ZHANG Chenjing1, ZHANG Xirui2, GUO Ziyao1, HAN Dandan2, DOU Haiyang1
(1. Key Laboratory of Pathogenesis Mechanism and Control of Inflammatory-Autoimmune Disease of Hebei Province, School of Basic Medical Sciences, Hebei University, Baoding 071000, China;
2. College of Public Health, Hebei University, Baoding 071000, China)
Abstract: In order to reduce the antigenicity of soybean, the soybean 7S globulin-Jujube polysaccharide (7S-JP) complexes were prepared by glycosylation reaction. The effects of reaction temperature, reaction time, and material ratio of 7S to JP on the structure of 7S-JP complexes were studied by asymmetrical flow field-flow fractionation coupled with online ultraviolet-visible detector, multi-angle light scattering detector, and differential refractive index detector (AF4-UV-MALS-dRI). Meanwhile, the radius of gyration, molar mass, and conformation of 7S-JP complexes were characterized by AF4-UV-MALS-dRI. The antigenicity of 7S-JP complexes was studied by indirect enzyme-linked immunosorbent assay. The results showed that: The 7S reacted with JP sufficiently at 70 ℃ in 20 min; The structure of 7S-JP complexes obtained with a material ratio of 1∶3 was more compact, which is beneficial to destroy its spatial epitope, and the antigen inhibition rate of 7S-JP (1∶3) achieved to be (69.1±0.99)%.
Key words: soybean 7S globulin; jujube polysaccharide; asymmetrical flow field-flow fractionation
豆類植物蛋白質(zhì)是人們攝入蛋白質(zhì)的重要來源,大豆7S球蛋白(soybean 7S globulin,7S)約占大豆總蛋白的30%,由α′、α和β亞基結(jié)合成糖蛋白[1].隨著大豆制品的廣泛應(yīng)用,人們對大豆過敏的發(fā)病率不斷增加[2],主要致敏原7S的抗原性較強且不易被食品加工所破壞,過敏患者在攝食大豆制品后會出現(xiàn)不同程度的不良反應(yīng),嚴(yán)重可致休克甚至死亡.全世界大約有0.3%~0.4%的人口對大豆過敏,限制了大豆在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用,降低7S抗原性成為當(dāng)前迫切需要解決的問題[3].
目前,7S的脫敏方法主要有熱處理法、超聲波法、酶解法、超高壓法和糖基化法[4],其中糖基化法是一種安全、快速的蛋白質(zhì)改性方法,原理為還原糖的羰基與7S的氨基脫水縮合形成復(fù)合物,掩蓋7S的線性抗原表位,或改變7S空間結(jié)構(gòu),破壞其空間抗原表位,從而降低7S抗原性[5].研究表明:單糖和低聚糖改性蛋白質(zhì)會產(chǎn)生晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs),AGEs可以刺激氧化應(yīng)激,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能改變、細(xì)胞凋亡和組織器官的損傷[6-8].多糖改性蛋白質(zhì)可以抑制AGEs的生成,蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物不僅可以提高蛋白質(zhì)的生物活性,而且對人體無害.然而,目前鮮有關(guān)于多糖改性7S的研究.
大棗是一種重要的藥食同源中藥材,含有糖類、酚酸和黃酮等多種生物活性物質(zhì),其中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)50%,多糖占總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的30%[9].研究證明大棗多糖(jujube polysaccharide, JP)具有抗氧化、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗衰老等多種生物活性,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、功能食品及保健品等領(lǐng)域[10].目前,鮮有關(guān)于JP改性7S降低其抗原性的報道.此外,JP結(jié)構(gòu)復(fù)雜,其分離表征極具挑戰(zhàn).
非對稱場流分離(asymmetrical flow field-flow fractionation, AF4)是一種基于樣品與外力相互作用對樣品進行分離的溫和分離方法.場流分離流道中沒有填充材料,降低了樣品在分離過程中剪切降解的風(fēng)險,已廣泛應(yīng)用于食品科學(xué)、生物制藥等領(lǐng)域[11-12].AF4聯(lián)用紫外可見光(ultraviolet-visible, UV)檢測器,多角度光散射(multi-angle light scattering, MALS)檢測器和示差折光(differential refractive index, dRI)檢測器(AF4-UV-MALS-dRI)可以對樣品的回轉(zhuǎn)半徑(radius of gyration, Rg)和摩爾質(zhì)量(molar mass, M)進行表征[13].本研究通過AF4-UV-MALS-dRI對7S和JP制備的復(fù)合物(7S-JP)進行分離表征,優(yōu)化7S-JP復(fù)合物的制備方法,探究其對7S抗原性的影響.
1 實驗部分
1.1 儀器與試劑
Eclipse AF4場流分離系統(tǒng)(德國Wyatt公司);1260液相泵(美國Agilent公司);1260紫外可見光檢測器(美國Agilent公司);DAWN HELEOS多角度光散射檢測器(美國Wyatt公司);1260RID示差折光檢測器(美國Agilent公司);DHG-9070A 電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);SQP電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);MS-H550-Pro磁力攪拌器(北京大龍興創(chuàng)實業(yè)有限公司);TG16-WS臺式高速離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司);1580R臺式冷凍離心機(武漢基因科技有限公司);RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);pH-050(A)干燥/培養(yǎng)兩用恒溫箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);INFINITE MNANO全波長光吸收酶標(biāo)儀(瑞士帝肯公司);5L-ModulyoD冷凍干燥機(美國熱電電子有限公司).脫脂大豆粕購自濟南君達(dá)化工科技有限公司;阜平大棗購自河北省保定當(dāng)?shù)爻?大豆7S球蛋白酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自上海紀(jì)寧實業(yè)有限公司;HCl、NaCl、NaOH、NaHSO3和正丁醇購自上海麥克林生化科技有限公司;CHCl3購自天津市福晨化學(xué)試劑有限公司;NaNO3、KBr和乙醇購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司.所用試劑均為分析級.
1.2 大豆7S球蛋白的制備
采用堿提取法,根據(jù)蛋白質(zhì)在不同的pH下溶解度不同進行7S的制備[14].將低溫脫脂的大豆粕粉碎,經(jīng)過80目(孔徑178 μm)篩分后與蒸餾水按照1∶15 (g∶mL)的料液比配制,調(diào)節(jié)pH至8.5,水浴40 ℃攪拌1 h,9 000g離心30 min,收集上清液,沉淀進行二次堿提.將2次堿提的上清液合并,加入NaHSO3使上清液中SO2-3濃度為0.01 mol/L,調(diào)節(jié)pH至6.4,4 ℃過夜放置后6 500g離心20 min,取上清液,加入NaCl使上清液中Cl-濃度為0.25 mol/L,調(diào)節(jié)pH至5.5,攪拌0.5 h后,9 000g離心30 min,加入等體積的水,調(diào)節(jié)pH至4.8,6 500g離心20 min,沉淀水洗,冷凍干燥得到7S.
1.3 大棗多糖的制備
清洗大棗,切塊并去除大棗核,鼓風(fēng)干燥箱40 ℃干燥12 h后粉碎,經(jīng)過40目(孔徑425 μm)篩分,進行脫脂處理.大棗粉末和體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液按照1∶8 (g∶mL)的料液比配制,70 ℃水浴浸泡2 h,重復(fù)提取2次,合并提取液.2 275g離心10 min,沉淀40 ℃干燥12 h得脫脂大棗粉末.采用熱水提取法提取JP,稱取定量的脫脂大棗粉末,按照1∶10 (g∶mL)的料液比配制,水浴90 ℃攪拌2 h,重復(fù)提取2次,合并提取液.2 275g離心10 min,取上清液,濃縮至原體積的1/10,加入4倍體積的無水乙醇沉淀多糖,4 ℃放置過夜后2 275g離心10 min得到粗JP.用無水乙醇洗滌粗JP,2 275g離心10 min,取沉淀,自然干燥后采用Sevag法除蛋白,樣品與Sevag試劑(三氯甲烷與正丁醇體積比為4∶1)的體積比為4∶1,振蕩10 min后1 465g離心10 min,取上清液.重復(fù)除蛋白操作7次,合并上清液濃縮、冷凍干燥得到JP.
1.4 7S-JP復(fù)合物的制備
采用糖基化反應(yīng)制備7S-JP復(fù)合物.將7S和JP混合,加入HCl (0.1 mol/L) 或NaOH (0.1 mol/L) 調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0,水浴加熱至設(shè)定溫度,250 r/min攪拌一定時間,將所得溶液濃縮、冷凍干燥得到7S-JP復(fù)合物.
1.5 7S-JP復(fù)合物的FTIR分析
稱取7S、JP和7S-JP各2.0 mg,分別與KBr以1∶100(質(zhì)量比)混勻研磨至細(xì)粉末狀,按壓成片.采用傅里葉變換紅外光譜儀對其進行表征,波長4 000~400 cm-1,掃描32次,采集樣品FTIR數(shù)據(jù).
1.6 7S-JP復(fù)合物的AF4分析
基于AF4-UV-MALS-dRI考察反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間和物料比對制備7S-JP復(fù)合物的影響.AF4分離系統(tǒng)采用350 μm聚酯墊片和截留相對分子質(zhì)量為10 000的再生纖維素膜組成的長流道,長度為26.5 cm.采用梯度洗脫程序,檢測器流速恒定為1.0 mL/min,初始交叉流流速為1.5 mL/min,半衰期(t1/2)為2.0 min,呈指數(shù)衰減至0.05 mL/min.載液為5 mmol/L NaNO3和50 mmol/L NaCl的超純水溶液,pH為7.0.進樣質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL,進樣體積為50 μL.
1.7 7S-JP復(fù)合物的抗原性
采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)法測定7S的抗原性[15],使用樣品稀釋液,將待測樣品稀釋5倍.稀釋后的樣品以50 μL/孔加入7S酶聯(lián)免疫分析試劑盒的酶標(biāo)板中,加入酶標(biāo)試劑(50 μL/孔),空白孔除外.輕輕振蕩后用膜封板,放入37 ℃恒溫箱中反應(yīng)60 min,棄液,每孔加滿洗滌液,靜置30 s棄液,重復(fù)洗滌5次后依次加入顯色劑A(50 μL/孔)和顯色劑B(50 μL/孔),輕輕振蕩混勻,37 ℃避光顯色15 min,加入終止液(50 μL/孔),混勻,立即于酶標(biāo)儀450 nm處測量吸光度(OD)值,抗原抑制率按公式(1)計算:
抗原抑制率=[1-(OD樣品-OD空白)/(OD對照-OD空白)]×100%,(1)
OD樣品是待測樣品的OD值,OD空白是超純水的OD值,OD對照是大豆7S球蛋白的OD值.
2 結(jié)果與討論
2.1 傅里葉變換紅外光譜分析
7S、JP和7S-JP的FTIR分析結(jié)果如圖1所示.3 382 cm-1處為-OH的伸縮振動峰,2 926 cm-1處為-CH2的伸縮振動峰(圖1a).1 746 cm-1處為磷脂中C=O的伸縮振動峰(圖1b),1 630~1" 650 cm-1為酰胺Ⅰ區(qū),7S-JP在1 637 cm-1處產(chǎn)生1個新峰(酰胺C=O伸縮振動),證明了復(fù)合物的形成[16].1 417 cm-1處為C-H的變角振動,800~1 200 cm-1為C—C、C—O伸縮振動以及C—H彎曲振動[17].結(jié)果表明通過糖基化反應(yīng)制備了7S-JP復(fù)合物.
2.2 反應(yīng)溫度對7S-JP復(fù)合物的影響
圖2為不同反應(yīng)溫度下制備的7S-JP復(fù)合物的AF4-UV-MALS-dRI洗脫圖譜.7S和JP質(zhì)量比為1∶1,反應(yīng)時間為20 min,反應(yīng)溫度分別為60、70、80、90 ℃.圖2a為7S-JP復(fù)合物的AF4-dRI洗脫圖譜.2.3 min和3.7 min處的樣品洗脫峰分別對應(yīng)JP和7S.Rg表征結(jié)果表明JP的粒徑小于7S.根據(jù)場流分離原理,在正常洗脫模式下,粒徑小的樣品先被洗脫出來,與Rg表征結(jié)果一致.由于JP沒有紫外吸收,因此JP在2.3 min處沒有顯著的UV信號(圖2b).反應(yīng)溫度為60 ℃時,在7.8 min處AF4-dRI和AF4-UV出現(xiàn)1個顯著的洗脫峰,同時3.7 min處的UV信號強度顯著降低.AF4-UV-dRI結(jié)果證明7S和JP形成了復(fù)合物,與FTIR表征結(jié)果一致.當(dāng)反應(yīng)溫度升高至70 ℃時,7S-JP復(fù)合物AF4-UV-dRI洗脫峰的保留時間延長,同時7S的UV信號強度進一步降低,7S-JP復(fù)合物的Rg(圖2a)和M(圖2c)增大.AF4-UV-MALS-dRI結(jié)果表明70 ℃促進了7S和JP的糖基化反應(yīng),生成了相對分子質(zhì)量更大的復(fù)合物.由圖2c可見7S-JP復(fù)合物的MALS信號強度顯著高于7S和JP,這是由于7S-JP的粒徑顯著大于7S和JP,而MALS是質(zhì)量檢測器,其信號強度受樣品濃度和粒徑影響[18].當(dāng)反應(yīng)溫度升高至80 ℃或者90 ℃時,7S-JP復(fù)合物的洗脫峰保留時間進一步延長.然而,反應(yīng)溫度為80 ℃和90 ℃時,2.3 min處的 dRI信號強度高于70 ℃時的信號強度.這主要是因為7S的變性溫度為74 ℃,當(dāng)反應(yīng)溫度高于70 ℃時,7S開始變性生成了粒徑較小的熱聚集產(chǎn)物[19],不利于與JP發(fā)生糖基化反應(yīng).因此選擇70 ℃為糖基化反應(yīng)溫度.
2.3 反應(yīng)時間對7S-JP復(fù)合物的影響
圖3為不同反應(yīng)時間制備的7S-JP復(fù)合物的AF4-UV-MALS-dRI洗脫圖譜.7S和JP質(zhì)量比為1∶1,反應(yīng)溫度為70 ℃,反應(yīng)時間分別為5、20、60、80 min.當(dāng)反應(yīng)時間為5 min時,7S-JP在9.5 min處出現(xiàn)1個顯著的AF4-UV-MALS-dRI洗脫峰,同時3.7 min處的UV信號強度(圖3b)顯著降低.當(dāng)反應(yīng)時間增加到20 min時,7S-JP復(fù)合物的AF4-UV-dRI洗脫峰的保留時間延長,7S的UV信號強度進一步降低,7S-JP復(fù)合物的Rg(圖3a)和M(圖3c)增大.AF4-UV-MALS-dRI結(jié)果表明延長反應(yīng)時間增加了7S和JP的糖基化反應(yīng)程度,生成了相對分子質(zhì)量更大的復(fù)合物,當(dāng)反應(yīng)時間增加到60 min或80 min時,7S-JP復(fù)合物洗脫峰的保留時間和信號強度沒有顯著變化.結(jié)果表明,反應(yīng)時間為20 min時,7S與JP已充分反應(yīng),因此選擇20 min為糖基化反應(yīng)時間.
2.4 物料比對7S-JP復(fù)合物的影響
圖4為不同物料比制備的7S-JP復(fù)合物的AF4-UV-MALS-dRI洗脫圖譜,反應(yīng)溫度為70 ℃,反應(yīng)時間為20 min,7S和JP質(zhì)量比分別為1∶1、1∶2、1∶3和1∶5.由圖4可見,隨著物料比的增加,7S-JP復(fù)合物的AF4-UV-MALS-dRI洗脫峰強度和保留時間逐漸增加,說明更多的JP與7S形成了7S-JP復(fù)合物.圖5是根據(jù)圖4中7S-JP復(fù)合物的Rg和M的對數(shù)曲線,根據(jù)其斜率可以得到不同物料比反應(yīng)生成的7S-JP復(fù)合物的構(gòu)象信息.研究報道斜率0.3為實心球結(jié)構(gòu),斜率0.5~0.6為無規(guī)線團結(jié)構(gòu),斜率Ⅰ為棒狀結(jié)構(gòu)[20].糖基化反應(yīng)可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)由無規(guī)線團向α螺旋的構(gòu)象轉(zhuǎn)變,改變分子的構(gòu)象[21].如圖5所示,隨著log M增大,對數(shù)曲線的斜率分為2部分,第二部分(Ⅱ)斜率與第一部分(Ⅰ)斜率相比均降低,表明相對分子質(zhì)量較大的7S-JP復(fù)合物構(gòu)象由無規(guī)線團結(jié)構(gòu)向?qū)嵭那蚪Y(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變.隨著投入反應(yīng)的JP含量增加,生成的7S-JP復(fù)合物的斜率Ⅱ呈先下降后上升的趨勢:當(dāng)質(zhì)量比為1∶3時斜率最?。?.323 1),此時7S-JP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)最為緊密;當(dāng)質(zhì)量比為1∶5時,7S-JP復(fù)合物為無規(guī)線團結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)變得松散.這可能是由于JP含量增加導(dǎo)致空間位阻增大,阻礙其轉(zhuǎn)變?yōu)閷嵭那蚪Y(jié)構(gòu).
2.5 7S-JP復(fù)合物的抗原性
采用間接競爭ELISA法考察了不同物料比制備的7S-JP復(fù)合物對7S抗原性的影響(表1).JP的抗原抑制率為(95.7±0.60)%,結(jié)果表明JP沒有7S抗原性,并且JP中未除去的蛋白質(zhì)不影響7S抗原性的測定.此外,不同物料比制備的7S-JP復(fù)合物的抗原抑制率之間具有顯著性差異:當(dāng)7S與JP的質(zhì)量比為1∶1時,抗原抑制率為(34.7±1.92)%,表明7S-JP復(fù)合物抑制了7S抗原性;當(dāng)7S與JP的質(zhì)量比為1∶3時,7S-JP抗原抑制率最高(69.1±0.99)%,這可能是由于隨著JP的增加,更多的7S的線性抗原表位被掩蓋,同時破壞了7S空間抗原表位;當(dāng)7S與JP的質(zhì)量比為1∶5時,抗原抑制率降低到(55.2±1.61)%,這可能是由于7S-JP復(fù)合物由緊密結(jié)構(gòu)變成了松散結(jié)構(gòu),導(dǎo)致其抗原抑制率降低[22].
3 結(jié)論
AF4-UV-MALS-dRI和FTIR表征結(jié)果證明形成了7S-JP復(fù)合物:當(dāng)反應(yīng)溫度70 ℃、反應(yīng)時間為20 min時,糖基化反應(yīng)效果最佳.當(dāng)反應(yīng)溫度高于70 ℃,7S開始變性形成了粒徑較小
的熱聚集產(chǎn)物,不利于糖基化反應(yīng)進行.當(dāng)7S和JP的質(zhì)量比為1∶3時,形成的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)緊密,有利于降低7S的抗原性,抗原抑制率為(69.1±0.99)%.研究結(jié)果證明,AF4-UV-MALS-dRI是一種有力的分離表征7S-JP復(fù)合物的方法,7S通過糖基化反應(yīng)與JP形成復(fù)合物可以有效降低其抗原性,為大豆蛋白功能食品的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持.
參 考 文 獻(xiàn):
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(責(zé)任編輯:梁俊紅)
收稿日期:2024-01-24;修回日期:2024-03-12
基金項目:
河北省重點研發(fā)項目(22372505D);河北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(S202310075055);河北大學(xué)實驗室開放項目(sy202245)
第一作者:張晨婧(2000—),女,河北大學(xué)在讀碩士研究生,主要從事場流分離研究.
E-mail: zhangccc10@163.com
通信作者:竇海洋(1983—),男,河北大學(xué)副教授,博士,主要從事場流分離研究.
E-mail: douhaiyang-1984@163.com
韓丹丹(1981—),女,河北大學(xué)教授,博士,主要從事衛(wèi)生檢驗研究. E-mail: hdd@hbu.edu.cn