摘 要：為了降低大豆的抗原性，通過糖基化反應(yīng)制備了大豆7S球蛋白-大棗多糖（7S-JP）復(fù)合物.采用非對稱場流分離技術(shù)在線聯(lián)用紫外可見光檢測器、多角度光散射檢測器和示差折光檢測器（AF4-UV-MALS-dRI）研究糖基化反應(yīng)溫度、時間和物料比對7S-JP復(fù)合物結(jié)構(gòu)的影響，對7S-JP復(fù)合物的回轉(zhuǎn)半徑、摩爾質(zhì)量和構(gòu)象進行表征;采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法探究7S-JP復(fù)合物的抗原性.AF4-UV-MALS-dRI結(jié)果表明：在反應(yīng)溫度為70 ℃、反應(yīng)時間為20 min時，7S與JP糖基化反應(yīng)效果最佳;當(dāng)7S與JP的質(zhì)量比為1∶3時，形成的7S-JP復(fù)合物結(jié)構(gòu)緊密，有利于破壞其空間抗原表位，抗原抑制率為（69.1±0.99）%.

關(guān)鍵詞：

大豆7S球蛋白;大棗多糖;非對稱場流分離

中圖分類號：

O657"" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

A"" 文章編號：

1000-1565（2024）03-0254-07

Preparation， characterization and antigenicity of soybean 7S globulin-jujube polysaccharide complexes

ZHANG Chenjing1， ZHANG Xirui2， GUO Ziyao1， HAN Dandan2， DOU Haiyang1

（1. Key Laboratory of Pathogenesis Mechanism and Control of Inflammatory-Autoimmune Disease of Hebei Province， School of Basic Medical Sciences， Hebei University， Baoding 071000， China;

2. College of Public Health， Hebei University， Baoding 071000， China）

Abstract： In order to reduce the antigenicity of soybean， the soybean 7S globulin-Jujube polysaccharide （7S-JP） complexes were prepared by glycosylation reaction. The effects of reaction temperature， reaction time， and material ratio of 7S to JP on the structure of 7S-JP complexes were studied by asymmetrical flow field-flow fractionation coupled with online ultraviolet-visible detector， multi-angle light scattering detector， and differential refractive index detector （AF4-UV-MALS-dRI）. Meanwhile， the radius of gyration， molar mass， and conformation of 7S-JP complexes were characterized by AF4-UV-MALS-dRI. The antigenicity of 7S-JP complexes was studied by indirect enzyme-linked immunosorbent assay. The results showed that： The 7S reacted with JP sufficiently at 70 ℃ in 20 min; The structure of 7S-JP complexes obtained with a material ratio of 1∶3 was more compact， which is beneficial to destroy its spatial epitope， and the antigen inhibition rate of 7S-JP （1∶3） achieved to be （69.1±0.99）%.

Key words： soybean 7S globulin; jujube polysaccharide; asymmetrical flow field-flow fractionation

豆類植物蛋白質(zhì)是人們攝入蛋白質(zhì)的重要來源，大豆7S球蛋白（soybean 7S globulin，7S）約占大豆總蛋白的30%，由α′、α和β亞基結(jié)合成糖蛋白［1］.隨著大豆制品的廣泛應(yīng)用，人們對大豆過敏的發(fā)病率不斷增加［2］，主要致敏原7S的抗原性較強且不易被食品加工所破壞，過敏患者在攝食大豆制品后會出現(xiàn)不同程度的不良反應(yīng)，嚴(yán)重可致休克甚至死亡.全世界大約有0.3%～0.4%的人口對大豆過敏，限制了大豆在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用，降低7S抗原性成為當(dāng)前迫切需要解決的問題［3］.

目前，7S的脫敏方法主要有熱處理法、超聲波法、酶解法、超高壓法和糖基化法［4］，其中糖基化法是一種安全、快速的蛋白質(zhì)改性方法，原理為還原糖的羰基與7S的氨基脫水縮合形成復(fù)合物，掩蓋7S的線性抗原表位，或改變7S空間結(jié)構(gòu)，破壞其空間抗原表位，從而降低7S抗原性［5］.研究表明：單糖和低聚糖改性蛋白質(zhì)會產(chǎn)生晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products， AGEs），AGEs可以刺激氧化應(yīng)激，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能改變、細(xì)胞凋亡和組織器官的損傷［6-8］.多糖改性蛋白質(zhì)可以抑制AGEs的生成，蛋白質(zhì)-多糖復(fù)合物不僅可以提高蛋白質(zhì)的生物活性，而且對人體無害.然而，目前鮮有關(guān)于多糖改性7S的研究.

大棗是一種重要的藥食同源中藥材，含有糖類、酚酸和黃酮等多種生物活性物質(zhì)，其中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)50%，多糖占總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的30%［9］.研究證明大棗多糖（jujube polysaccharide， JP）具有抗氧化、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗衰老等多種生物活性，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、功能食品及保健品等領(lǐng)域［10］.目前，鮮有關(guān)于JP改性7S降低其抗原性的報道.此外，JP結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其分離表征極具挑戰(zhàn).

非對稱場流分離（asymmetrical flow field-flow fractionation， AF4）是一種基于樣品與外力相互作用對樣品進行分離的溫和分離方法.場流分離流道中沒有填充材料，降低了樣品在分離過程中剪切降解的風(fēng)險，已廣泛應(yīng)用于食品科學(xué)、生物制藥等領(lǐng)域［11-12］.AF4聯(lián)用紫外可見光（ultraviolet-visible， UV）檢測器，多角度光散射（multi-angle light scattering， MALS）檢測器和示差折光（differential refractive index， dRI）檢測器（AF4-UV-MALS-dRI）可以對樣品的回轉(zhuǎn)半徑（radius of gyration， Rg）和摩爾質(zhì)量（molar mass， M）進行表征［13］.本研究通過AF4-UV-MALS-dRI對7S和JP制備的復(fù)合物（7S-JP）進行分離表征，優(yōu)化7S-JP復(fù)合物的制備方法，探究其對7S抗原性的影響.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Eclipse AF4場流分離系統(tǒng)（德國Wyatt公司）;1260液相泵（美國Agilent公司）;1260紫外可見光檢測器（美國Agilent公司）;DAWN HELEOS多角度光散射檢測器（美國Wyatt公司）;1260RID示差折光檢測器（美國Agilent公司）;DHG-9070A 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;SQP電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）;MS-H550-Pro磁力攪拌器（北京大龍興創(chuàng)實業(yè)有限公司）;TG16-WS臺式高速離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）;1580R臺式冷凍離心機（武漢基因科技有限公司）;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）;pH-050（A）干燥/培養(yǎng)兩用恒溫箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;INFINITE MNANO全波長光吸收酶標(biāo)儀（瑞士帝肯公司）;5L-ModulyoD冷凍干燥機（美國熱電電子有限公司）.脫脂大豆粕購自濟南君達(dá)化工科技有限公司;阜平大棗購自河北省保定當(dāng)?shù)爻?大豆7S球蛋白酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自上海紀(jì)寧實業(yè)有限公司;HCl、NaCl、NaOH、NaHSO3和正丁醇購自上海麥克林生化科技有限公司;CHCl3購自天津市福晨化學(xué)試劑有限公司;NaNO3、KBr和乙醇購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司.所用試劑均為分析級.

1.2 大豆7S球蛋白的制備

采用堿提取法，根據(jù)蛋白質(zhì)在不同的pH下溶解度不同進行7S的制備［14］.將低溫脫脂的大豆粕粉碎，經(jīng)過80目（孔徑178 μm）篩分后與蒸餾水按照1∶15 （g∶mL）的料液比配制，調(diào)節(jié)pH至8.5，水浴40 ℃攪拌1 h，9 000g離心30 min，收集上清液，沉淀進行二次堿提.將2次堿提的上清液合并，加入NaHSO3使上清液中SO2-3濃度為0.01 mol/L，調(diào)節(jié)pH至6.4，4 ℃過夜放置后6 500g離心20 min，取上清液，加入NaCl使上清液中Cl-濃度為0.25 mol/L，調(diào)節(jié)pH至5.5，攪拌0.5 h后，9 000g離心30 min，加入等體積的水，調(diào)節(jié)pH至4.8，6 500g離心20 min，沉淀水洗，冷凍干燥得到7S.

1.3 大棗多糖的制備

清洗大棗，切塊并去除大棗核，鼓風(fēng)干燥箱40 ℃干燥12 h后粉碎，經(jīng)過40目（孔徑425 μm）篩分，進行脫脂處理.大棗粉末和體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液按照1∶8 （g∶mL）的料液比配制，70 ℃水浴浸泡2 h，重復(fù)提取2次，合并提取液.2 275g離心10 min，沉淀40 ℃干燥12 h得脫脂大棗粉末.采用熱水提取法提取JP，稱取定量的脫脂大棗粉末，按照1∶10 （g∶mL）的料液比配制，水浴90 ℃攪拌2 h，重復(fù)提取2次，合并提取液.2 275g離心10 min，取上清液，濃縮至原體積的1/10，加入4倍體積的無水乙醇沉淀多糖，4 ℃放置過夜后2 275g離心10 min得到粗JP.用無水乙醇洗滌粗JP，2 275g離心10 min，取沉淀，自然干燥后采用Sevag法除蛋白，樣品與Sevag試劑（三氯甲烷與正丁醇體積比為4∶1）的體積比為4∶1，振蕩10 min后1 465g離心10 min，取上清液.重復(fù)除蛋白操作7次，合并上清液濃縮、冷凍干燥得到JP.

1.4 7S-JP復(fù)合物的制備

采用糖基化反應(yīng)制備7S-JP復(fù)合物.將7S和JP混合，加入HCl （0.1 mol/L） 或NaOH （0.1 mol/L） 調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0，水浴加熱至設(shè)定溫度，250 r/min攪拌一定時間，將所得溶液濃縮、冷凍干燥得到7S-JP復(fù)合物.

1.5 7S-JP復(fù)合物的FTIR分析

稱取7S、JP和7S-JP各2.0 mg，分別與KBr以1∶100（質(zhì)量比）混勻研磨至細(xì)粉末狀，按壓成片.采用傅里葉變換紅外光譜儀對其進行表征，波長4 000～400 cm-1，掃描32次，采集樣品FTIR數(shù)據(jù).

1.6 7S-JP復(fù)合物的AF4分析

基于AF4-UV-MALS-dRI考察反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間和物料比對制備7S-JP復(fù)合物的影響.AF4分離系統(tǒng)采用350 μm聚酯墊片和截留相對分子質(zhì)量為10 000的再生纖維素膜組成的長流道，長度為26.5 cm.采用梯度洗脫程序，檢測器流速恒定為1.0 mL/min，初始交叉流流速為1.5 mL/min，半衰期（t1/2）為2.0 min，呈指數(shù)衰減至0.05 mL/min.載液為5 mmol/L NaNO3和50 mmol/L NaCl的超純水溶液，pH為7.0.進樣質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，進樣體積為50 μL.

1.7 7S-JP復(fù)合物的抗原性

采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）法測定7S的抗原性［15］，使用樣品稀釋液，將待測樣品稀釋5倍.稀釋后的樣品以50 μL/孔加入7S酶聯(lián)免疫分析試劑盒的酶標(biāo)板中，加入酶標(biāo)試劑（50 μL/孔），空白孔除外.輕輕振蕩后用膜封板，放入37 ℃恒溫箱中反應(yīng)60 min，棄液，每孔加滿洗滌液，靜置30 s棄液，重復(fù)洗滌5次后依次加入顯色劑A（50 μL/孔）和顯色劑B（50 μL/孔），輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min，加入終止液（50 μL/孔），混勻，立即于酶標(biāo)儀450 nm處測量吸光度（OD）值，抗原抑制率按公式（1）計算：

抗原抑制率=［1-（OD樣品-OD空白）/（OD對照-OD空白）］×100%，（1）

OD樣品是待測樣品的OD值，OD空白是超純水的OD值，OD對照是大豆7S球蛋白的OD值.

2 結(jié)果與討論

2.1 傅里葉變換紅外光譜分析

7S、JP和7S-JP的FTIR分析結(jié)果如圖1所示.3 382 cm-1處為-OH的伸縮振動峰，2 926 cm-1處為-CH2的伸縮振動峰（圖1a）.1 746 cm-1處為磷脂中C＝O的伸縮振動峰（圖1b），1 630～1" 650 cm-1為酰胺Ⅰ區(qū)，7S-JP在1 637 cm-1處產(chǎn)生1個新峰（酰胺C＝O伸縮振動），證明了復(fù)合物的形成［16］.1 417 cm-1處為C-H的變角振動，800～1 200 cm-1為C—C、C—O伸縮振動以及C—H彎曲振動［17］.結(jié)果表明通過糖基化反應(yīng)制備了7S-JP復(fù)合物.

2.2 反應(yīng)溫度對7S-JP復(fù)合物的影響

圖2為不同反應(yīng)溫度下制備的7S-JP復(fù)合物的AF4-UV-MALS-dRI洗脫圖譜.7S和JP質(zhì)量比為1∶1，反應(yīng)時間為20 min，反應(yīng)溫度分別為60、70、80、90 ℃.圖2a為7S-JP復(fù)合物的AF4-dRI洗脫圖譜.2.3 min和3.7 min處的樣品洗脫峰分別對應(yīng)JP和7S.Rg表征結(jié)果表明JP的粒徑小于7S.根據(jù)場流分離原理，在正常洗脫模式下，粒徑小的樣品先被洗脫出來，與Rg表征結(jié)果一致.由于JP沒有紫外吸收，因此JP在2.3 min處沒有顯著的UV信號（圖2b）.反應(yīng)溫度為60 ℃時，在7.8 min處AF4-dRI和AF4-UV出現(xiàn)1個顯著的洗脫峰，同時3.7 min處的UV信號強度顯著降低.AF4-UV-dRI結(jié)果證明7S和JP形成了復(fù)合物，與FTIR表征結(jié)果一致.當(dāng)反應(yīng)溫度升高至70 ℃時，7S-JP復(fù)合物AF4-UV-dRI洗脫峰的保留時間延長，同時7S的UV信號強度進一步降低，7S-JP復(fù)合物的Rg（圖2a）和M（圖2c）增大.AF4-UV-MALS-dRI結(jié)果表明70 ℃促進了7S和JP的糖基化反應(yīng)，生成了相對分子質(zhì)量更大的復(fù)合物.由圖2c可見7S-JP復(fù)合物的MALS信號強度顯著高于7S和JP，這是由于7S-JP的粒徑顯著大于7S和JP，而MALS是質(zhì)量檢測器，其信號強度受樣品濃度和粒徑影響［18］.當(dāng)反應(yīng)溫度升高至80 ℃或者90 ℃時，7S-JP復(fù)合物的洗脫峰保留時間進一步延長.然而，反應(yīng)溫度為80 ℃和90 ℃時，2.3 min處的 dRI信號強度高于70 ℃時的信號強度.這主要是因為7S的變性溫度為74 ℃，當(dāng)反應(yīng)溫度高于70 ℃時，7S開始變性生成了粒徑較小的熱聚集產(chǎn)物［19］，不利于與JP發(fā)生糖基化反應(yīng).因此選擇70 ℃為糖基化反應(yīng)溫度.

2.3 反應(yīng)時間對7S-JP復(fù)合物的影響

圖3為不同反應(yīng)時間制備的7S-JP復(fù)合物的AF4-UV-MALS-dRI洗脫圖譜.7S和JP質(zhì)量比為1∶1，反應(yīng)溫度為70 ℃，反應(yīng)時間分別為5、20、60、80 min.當(dāng)反應(yīng)時間為5 min時，7S-JP在9.5 min處出現(xiàn)1個顯著的AF4-UV-MALS-dRI洗脫峰，同時3.7 min處的UV信號強度（圖3b）顯著降低.當(dāng)反應(yīng)時間增加到20 min時，7S-JP復(fù)合物的AF4-UV-dRI洗脫峰的保留時間延長，7S的UV信號強度進一步降低，7S-JP復(fù)合物的Rg（圖3a）和M（圖3c）增大.AF4-UV-MALS-dRI結(jié)果表明延長反應(yīng)時間增加了7S和JP的糖基化反應(yīng)程度，生成了相對分子質(zhì)量更大的復(fù)合物，當(dāng)反應(yīng)時間增加到60 min或80 min時，7S-JP復(fù)合物洗脫峰的保留時間和信號強度沒有顯著變化.結(jié)果表明，反應(yīng)時間為20 min時，7S與JP已充分反應(yīng)，因此選擇20 min為糖基化反應(yīng)時間.

2.4 物料比對7S-JP復(fù)合物的影響

圖4為不同物料比制備的7S-JP復(fù)合物的AF4-UV-MALS-dRI洗脫圖譜，反應(yīng)溫度為70 ℃，反應(yīng)時間為20 min，7S和JP質(zhì)量比分別為1∶1、1∶2、1∶3和1∶5.由圖4可見，隨著物料比的增加，7S-JP復(fù)合物的AF4-UV-MALS-dRI洗脫峰強度和保留時間逐漸增加，說明更多的JP與7S形成了7S-JP復(fù)合物.圖5是根據(jù)圖4中7S-JP復(fù)合物的Rg和M的對數(shù)曲線，根據(jù)其斜率可以得到不同物料比反應(yīng)生成的7S-JP復(fù)合物的構(gòu)象信息.研究報道斜率0.3為實心球結(jié)構(gòu)，斜率0.5～0.6為無規(guī)線團結(jié)構(gòu)，斜率Ⅰ為棒狀結(jié)構(gòu)［20］.糖基化反應(yīng)可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)由無規(guī)線團向α螺旋的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，改變分子的構(gòu)象［21］.如圖5所示，隨著log M增大，對數(shù)曲線的斜率分為2部分，第二部分（Ⅱ）斜率與第一部分（Ⅰ）斜率相比均降低，表明相對分子質(zhì)量較大的7S-JP復(fù)合物構(gòu)象由無規(guī)線團結(jié)構(gòu)向?qū)嵭那蚪Y(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變.隨著投入反應(yīng)的JP含量增加，生成的7S-JP復(fù)合物的斜率Ⅱ呈先下降后上升的趨勢：當(dāng)質(zhì)量比為1∶3時斜率最?。?.323 1），此時7S-JP復(fù)合物的結(jié)構(gòu)最為緊密；當(dāng)質(zhì)量比為1∶5時，7S-JP復(fù)合物為無規(guī)線團結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)變得松散.這可能是由于JP含量增加導(dǎo)致空間位阻增大，阻礙其轉(zhuǎn)變?yōu)閷嵭那蚪Y(jié)構(gòu).

2.5 7S-JP復(fù)合物的抗原性

采用間接競爭ELISA法考察了不同物料比制備的7S-JP復(fù)合物對7S抗原性的影響（表1）.JP的抗原抑制率為（95.7±0.60）%，結(jié)果表明JP沒有7S抗原性，并且JP中未除去的蛋白質(zhì)不影響7S抗原性的測定.此外，不同物料比制備的7S-JP復(fù)合物的抗原抑制率之間具有顯著性差異：當(dāng)7S與JP的質(zhì)量比為1∶1時，抗原抑制率為（34.7±1.92）%，表明7S-JP復(fù)合物抑制了7S抗原性；當(dāng)7S與JP的質(zhì)量比為1∶3時，7S-JP抗原抑制率最高（69.1±0.99）%，這可能是由于隨著JP的增加，更多的7S的線性抗原表位被掩蓋，同時破壞了7S空間抗原表位；當(dāng)7S與JP的質(zhì)量比為1∶5時，抗原抑制率降低到（55.2±1.61）%，這可能是由于7S-JP復(fù)合物由緊密結(jié)構(gòu)變成了松散結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其抗原抑制率降低［22］.

3 結(jié)論

AF4-UV-MALS-dRI和FTIR表征結(jié)果證明形成了7S-JP復(fù)合物：當(dāng)反應(yīng)溫度70 ℃、反應(yīng)時間為20 min時，糖基化反應(yīng)效果最佳.當(dāng)反應(yīng)溫度高于70 ℃，7S開始變性形成了粒徑較小

的熱聚集產(chǎn)物，不利于糖基化反應(yīng)進行.當(dāng)7S和JP的質(zhì)量比為1∶3時，形成的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)緊密，有利于降低7S的抗原性，抗原抑制率為（69.1±0.99）%.研究結(jié)果證明，AF4-UV-MALS-dRI是一種有力的分離表征7S-JP復(fù)合物的方法，7S通過糖基化反應(yīng)與JP形成復(fù)合物可以有效降低其抗原性，為大豆蛋白功能食品的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持.

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（責(zé)任編輯：梁俊紅）

收稿日期：2024-01-24;修回日期：2024-03-12

基金項目：

河北省重點研發(fā)項目（22372505D）;河北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（S202310075055）;河北大學(xué)實驗室開放項目（sy202245）

第一作者：張晨婧（2000—），女，河北大學(xué)在讀碩士研究生，主要從事場流分離研究.

E-mail： zhangccc10@163.com

通信作者：竇海洋（1983—），男，河北大學(xué)副教授，博士，主要從事場流分離研究.

E-mail： douhaiyang-1984@163.com

韓丹丹（1981—），女，河北大學(xué)教授，博士，主要從事衛(wèi)生檢驗研究. E-mail： hdd@hbu.edu.cn