姚涵雅 盤涌 高慧 白燕遠 李耀燕 閆國躍 謝陽姣

收稿日期：2022-11-14

基金項目：廣西創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展專項資金項目（桂科AA18118049-7）；廣西自然科學(xué)基金重點項目（2020GXNSFDA297029）； 2020年廣西中藥藥效研究重點實驗室運行補助項目（20-065-38）

作者簡介：姚涵雅（1996-），女，河南駐馬店人，在讀碩士研究生，研究方向為民族藥鑒定與資源開發(fā)研究，（電話）15688193875（電子信箱）3537802062@qq.com；通信作者，謝陽姣（1975-），女，湖南郴州人，研究員，博士，主要從事中藥、民族藥資源開發(fā)與利用研究，（電話）18172384560（電子信箱）xieyangjiao@163.com。

姚涵雅，盤 涌，高 慧，等. 防城金花茶葉片的生藥學(xué)及UPLC指紋圖譜［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，63（5）：91-97，181．

摘要：采用性狀鑒別和顯微鑒別方法，觀察防城金花茶（Camellia nitidissima var. phaeopubisperma）的原植物形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、粉末特征；采用超高效液相色譜（UPLC）并運用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)建立防城金花茶液相指紋圖譜，運用SIMCA-P14.1軟件對其化學(xué)成分進行主成分分析和正交偏最小二乘法-判別分析。性狀鑒別結(jié)果顯示，防城金花茶葉展開后呈橢圓形、長橢圓形、矩圓形或卵圓形，薄革質(zhì)、兩面均無毛，葉脈網(wǎng)狀，邊緣有細鋸齒或鋸齒。葉肉組織散有大型分枝狀不規(guī)則石細胞和草酸鈣簇晶；導(dǎo)管有環(huán)紋導(dǎo)管及螺紋導(dǎo)管，氣孔不定式。超高液相指紋圖譜顯示，供試防城金花茶樣本化學(xué)成分譜存在差異；基于化學(xué)成分差異，采用主成分分析和正交偏最小二乘法-判別分析可將防城金花茶樣本分成2大類，維生素B6、去氧腎上腺素、蘆丁、咖啡堿、金絲桃苷是區(qū)分2種指紋類型的主要標(biāo)志性成分。

關(guān)鍵詞：防城金花茶（Camellia nitidissima var. phaeopubisperma）；性狀鑒別；顯微鑒別；超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜；生藥學(xué)

中圖分類號：O657.63；TS272.7???????? 文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）05-0091-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.016??????????? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

The pharmacognosy and UPLC fingerprint of the leaves of Camellia nitidissima var. phaeopubisperma

YAO Han-ya1， PAN Yong1， GAO Hui1， BAI Yan-yuan1，2， LI Yao-yan1，2， YAN Guo-yue1，2， XIE Yang-jiao1，2

（1.School of Yao Medicine， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning? 530200，China；

2.Guangxi Key Laboratory of Efficacy Study on Chinese Materia Medica， Nanning? 530200，China）

Abstract： The plant morphology， tissue structure and powder characteristics of Camellia nitidissima var. phaeopubisperma were observed by means of character identification and microscopic identification. The liquid fingerprint of Camellia nitidissima var. phaeopubisperma was established by ultra high-performance liquid chromatography （UPLC） and similarity evaluation system of traditional Chinese medicine chromatographic fingerprint. Principal component analysis and orthogonal partial least squares discriminant analysis were performed on the chemical composition by SIMCA-P14.1 software. The results of character identification showed that Camellia nitidissima var. phaeopubisperma was elliptical， oblong， rectangular or oval， thin leathery， hairless on both sides， reticulated leaf veins and serrulate or serrate on the margins. In the mesophyll tissue were present large branching irregular stone cells and clusters of calcium oxalate crystals； the vessels were annular and spiral， and the stomata were anomocytic type. The HPLC fingerprints indicated differences in the chemical composition of the tested Camellia nitidissima var. phaeopubisperma samples. Based on these differences， the samples could be divided into two categories using principal component analysis and orthogonal partial least squares-discriminant analysis， with vitamin B6， phenylephrine， rutin， caffeine， and hyperoside being the key signature ingredients that distinguished the two types of fingerprints.

Key words： Camellia nitidissima var. phaeopubisperma； morphological identification； microscopic identification； ultra-high-performance liquid chromatography（UPLC） fingerprint； pharmacognosy

金花茶（Golden Camellia species）是山茶科山茶屬金花茶組植物的統(tǒng)稱，常綠灌木或小喬木，是山茶屬中罕有的花色金黃的品種［1，2］，被譽為“植物界的大熊貓”和“茶族皇后”［3］。金花茶富含豐富的氨基酸、維生素、揮發(fā)油、黃酮、皂苷、多糖類營養(yǎng)成分及礦質(zhì)元素等［4，5］。用于預(yù)防腫瘤、抗氧化、降血糖等［6-8］。金花茶葉全年均可采收，曬干即可入藥，為廣西壯族民間草藥，習(xí)慣代茶飲，已有較長的歷史［9］。明代醫(yī)藥學(xué)家李時珍在《本草綱目》中記載：“山茶嫩葉炸熟水淘可食，亦可蒸曬做飲［10］”。現(xiàn)全世界已發(fā)現(xiàn)的金花茶組植物有42個種5個變種［11］，其中分布和應(yīng)用最為廣泛的為防城金花茶（Camellia nitidissima var. phaeopubisperma），其葉被列為國家新資源食品。金花茶目前尚未被收載入《中華人民共和國藥典》，廣西將其作為壯藥收入《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（第二卷），但收載的具體種并無定論。金花茶組植物含多個種（變種），其形態(tài)和化學(xué)成分等在種間和種內(nèi)均存在較大差異。研究發(fā)現(xiàn)金花茶組植物葉形變異較大，可用于金花茶組植物的簡單鑒別，但因同種不同個體間變異亦十分明顯，無法單獨利用葉形區(qū)分不同種金花茶［12］。已有研究表明，根據(jù)金花茶組植物成熟葉表皮微形態(tài)特征差異可作為金花茶分類的重要依據(jù)［13，14］。梁霄等［15］采用薄層色譜法分別鑒別不同種金花茶葉中的齊墩果酸、蘆丁和人參皂苷Rg1等化學(xué)成分。由于金花茶組植物的復(fù)雜性和多樣性，金花茶植物種間鑒別困難，其形態(tài)特征及化學(xué)成分差異仍需進一步研究［16，17］。

本研究對防城金花茶葉片進行系統(tǒng)的生藥學(xué)研究，并采用超高效液相色譜法對其進行指紋圖譜研究，以期為超高效液相色譜的鑒定和質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料來源于廣西防城港市東興市沖峰金花茶種植基地，基地金花茶均由原南寧市金花茶公園基因庫主管黃連冬高級園林工程師鑒定為正品。選取具有表型性狀差異的防城金花茶原植物，每個表型選5株以上，共掛牌111株。觀察表型性狀并記錄，根據(jù)試驗需要，采集其新鮮葉片，為了便于后期粉末的觀察試驗，將采集到的樣本用硅膠快速干燥后于-4 ℃保存?zhèn)溆?；制作切片的樣本用FAA固定液（10%甲醛5 mL+冰醋酸5 mL+70%乙醇90 mL）固定。

1.2 儀器

奧林巴斯生物顯微鏡（型號CX21FS1C），奧林巴斯中國有限公司；ZF-2二用紫外分析儀，上海安亭電子儀器廠；超高效液相色譜儀，美國Waters公司。

1.3 試劑

乙腈（色譜純），磷酸（色譜純），乙醇（分析純），水（去離子水，自制）。咖啡堿（批號wkq19040910，含量98%）、丁香酸（批號wkq18061204，含量98%）、表兒茶素（批號wkq19010401，含量98%）、牡荊素（批號wkq19031111，含量98%）、金絲桃苷（批號wkq19040913，含量98%）、染料木苷（批號wkq19051702，含量98%）、楊梅素（批號529-44-2，含量98%）、槲皮苷（批號wkq19031304，含量98%），均購自四川省維克奇生物科技有限公司；蘆?。ㄅ?00080-201811，含量91.7%）、槲皮素（批號100081-201610，含量99.1%），均購自于中國食品藥品鑒定研究院；木蘭花堿（批號2141-09-5，含量98%）購自上海源葉生物科技有限公司；秦皮甲素（批號531-75-9，含量98%）、原兒茶醛（批號139-85-5，含量98%）、對香豆酸（批號501-98-4，含量98%）、維生素B6（批號65-23-6，含量99%）、去氧腎上腺素（批號59-42-7，含量98%）、阿魏酸（批號1135-24-6，含量98%）、鞣花酸（批號476-66-4，含量98%），均購自于成都埃法生物科技有限公司。

1.4 原植物形態(tài)

對防城金花茶葉片的植物形態(tài)、葉表面特征等進行觀察。

1.5 顯微鑒別

分別采用組織切片法和粉末制片法進行顯微鑒別。

1.5.1 組織切片法 用流水將新鮮的金花茶洗凈，選取正常完整的葉片，切成2～3 mm長的小段，將小段固定于FAA固定液中24 h，按常規(guī)石蠟制片法制作金花茶葉片組織切片，最后用番紅-固綠進行染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍攝，記錄結(jié)果。

1.5.2 粉末制片法 將防城金花茶葉片的粉末（過五號篩）分別置于載玻片上，滴加水合氯醛試液后在酒精燈上加熱透化，稀甘油試液裝片，置于顯微鏡下觀察、拍照，記錄粉末顯微特征。

1.6 超高效液相色譜法

1.6.1 色譜條件 超高效液相色譜儀（包括Waters FIN樣品管理器，QSM四元溶劑管理器，TUV Detector檢測器，Empower色譜工作站）；色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。

色譜條件：流動相為乙腈和0.1%磷酸水溶液；柱溫35 ℃，樣品溫25 ℃；進樣量0.2 μL；流速0.2 mL/min；雙通道，A通道波長320 nm，B通道波長210 nm，梯度洗脫條件見表1。方法學(xué)考察結(jié)果顯示精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、加樣回收率良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均<0.05。

1.6.2 對照品溶液制備 對照品根據(jù)說明書采用相應(yīng)的溶劑溶解后制成濃度約5 mg/mL的母液。用時將母液稀釋成適當(dāng)?shù)倪M樣濃度，其中維生素B6 0.132 mg/mL、去氧腎上腺素1.3 mg/mL、咖啡堿0.25 mg/mL、秦皮甲素0.019 2 mg/mL、原兒茶醛0.010 3 mg/mL、丁香酸0.329 mg/mL、表兒茶素0.136 mg/mL、木蘭花堿0.055 mg/mL、對香豆酸0.007 6 mg/mL、阿魏酸0.009 6 mg/mL、鞣花酸0.04 mg/mL、牡荊素0.03 mg/mL、蘆丁0.100 mg/mL、金絲桃苷0.100 mg/mL、染料木苷0.21 mg/mL、槲皮苷0.028 mg/mL、楊梅素0.022 mg/mL、槲皮素0.092 mg/mL。

1.6.3 供試品溶液的制備 精密稱定防城金花茶葉粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇溶液10 mL，密塞，超聲30 min，冷卻，過濾。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，后用50%乙醇溶液10 mL溶解，搖勻，進樣前用0.2 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.6.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 對照品均分別設(shè)0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 μL，共7個進樣梯度，測定峰面積，以每個進樣梯度計算出的含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制作線性回歸方程，測得各對照品線性范圍。對照品線性回歸方程r2>0.999，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好（表2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 防城金花茶葉片的植物形態(tài)

防城金花茶為常綠灌木或小喬木，高3～4 m；嫩枝圓柱形，淡紫紅色，老枝黃褐色，無毛。嫩葉藍灰色，無毛；老葉上面深綠色，下面淺綠色，薄革質(zhì)，兩面均無毛；葉完整展平后呈橢圓形（長寬比<2.5，葉基下延）、長橢圓形（長寬比≥2.5，葉基下延）、矩圓形（葉基圓鈍）或卵圓形（基部較寬，向尖端漸變窄）；葉脈網(wǎng)狀，網(wǎng)脈上面明顯，邊緣有細鋸齒或鋸齒；葉柄長0.5～1.0 cm，綠色，無毛?；▎紊谌~腋，花開時呈杯狀、壺狀或碗狀，花蕾黃綠色，花冠頂部有3個棕色小點，花展開時小棕點撕裂；花瓣8～15片，蠟質(zhì)，金黃色，花徑2.0～4.5 cm，無毛，基部托以縮存的萼片和苞片；花萼青色或青褐色，萼片數(shù)5片；蒴果扁球形，棕褐色（圖1）。

2.2 防城金花茶葉的顯微特征

2.2.1 組織切片 葉組織結(jié)構(gòu)：葉橫切面上表皮細胞較大，呈近長方形，下表皮細胞較小，呈橢圓形；葉肉組織分布在上、下表皮之間，柵欄組織和海綿組織分化明顯，柵欄組織在葉片內(nèi)排列成2層，草酸鈣簇晶散在；海綿組織細胞形狀不規(guī)則，排列疏松，細胞間隙較大，散有大型分枝狀石細胞和草酸鈣簇晶；主脈維管束為無限外韌型，呈U形，上下側(cè)被厚壁組織包圍，韌皮部和木質(zhì)部分層明顯，木質(zhì)部細胞排列緊密，導(dǎo)管分布較多（圖2）。

2.2.2 粉末制片 防城金花茶葉粉末為灰綠色，其粉末顯微特征如圖3所示。導(dǎo)管有環(huán)紋導(dǎo)管及螺紋導(dǎo)管（圖3A和圖3B），葉表皮碎片，表皮細胞垂周壁波狀彎曲，氣孔不定式（圖3C），石細胞不規(guī)則，呈分枝狀，細胞壁較厚（圖3D、圖3E和圖3F），纖維成束排列，細胞壁厚（圖3G），棕色物質(zhì)呈塊存在（圖3H），草酸鈣簇晶數(shù)目較多（圖3I和圖3J）。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 取樣品粉末按“1.6.3”的方法制備供試品溶液，按“1.6.1”的色譜條件測定，連續(xù)進樣6次，以維生素B6為參照峰，記錄各峰的保留時間和峰面積，計算各共有峰相對保留時間，其RSD均小于1%，相對峰面積RSD均小于5%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗 按“1.6.3”的方法，對同一批樣品粉末同時制備6份供試品溶液，按“1.6.1”的色譜條件測定，記錄各色譜峰的峰面積，計算各峰面積的RSD。測得所有RSD均小于2.00%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取樣品粉末按“1.6.3”的方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h和24 h進樣測定，記錄各峰的保留時間和峰面積。計算各峰面積的RSD。測得RSD均小于2.00%，表明建立的UPLC方法穩(wěn)定性良好。

2.4 UPLC指紋圖譜特征

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012）”建立防城金花茶UPLC指紋圖譜。各株系進行相似度檢驗，相似度檢驗結(jié)果大于0.9視為同一指紋類型，經(jīng)檢驗，受試111株防城金花茶有3個指紋類型（圖4和圖5，JHCFP1至JHCFP3），其中，JHCFP1號類型包含13株，特征為在13～22 min處出峰較多；JHCFP2號有94株，其特征為在12 min處有一特征峰，27 min處各有一峰面積較高的化學(xué)成分；JHCFP3號僅有1株，特征為在4～9 min處出峰較多，且峰面積較高。FP1-10、FP1-24及FP1-26這3株指紋類型不穩(wěn)定。各指紋類型色譜峰數(shù)量和峰面積均存在一定的差異，表明防城金花茶種內(nèi)存在一定的變異，不能采用單一一種UPLC指紋圖譜進行鑒別。各指紋類型所含株系見表3。

2.5 防城金花茶葉片中的化學(xué)成分

從所試111株樣品中檢測到50多種化學(xué)成分，其中已知化學(xué)成分18種（圖4和圖5），根據(jù)回歸方程計算防城金花茶葉片中已知化學(xué)成分含量，各成分含量信息見表4。JHCFP1號類型中有15種化學(xué)成分含量最小值為0，JHCFP2號類型中有16種化學(xué)成分含量最小值為0，表明并不是所有株系均含有其化學(xué)成分；根據(jù)最大值和平均值可知，防城金花茶含量較高的成分有咖啡堿、表兒茶素、木蘭花堿、楊梅素。JHCFP1號中維生素B6、秦皮甲素、丁香酸和鞣花酸含量較高。JHCFP2號中原兒茶醛和蘆丁含量較高。因JHCFP3號僅有1株，不具有代表性，未做統(tǒng)計。

2.6 防城金花茶葉片化學(xué)模式識別分析

2.6.1 主成分分析 因JHCFP3號僅有1株，不具有代表性，故采用SIMCA-P 14.1軟件對其他107株防城金花茶樣品指紋圖譜中18個共有峰峰面積進行主成分分析（Principle component analysis，PCA），以特征值≥1及累積方差貢獻率為依據(jù)，共得到5個主成分，其累計方差貢獻率為73.4%，提取出的5個主成分能夠概括107株防城金花茶葉片中大部分信息。107株防城金花茶分為2類，JHCFP1號指紋類型集中在第四象限，JHCFP2號指紋類型集中在第一、第三象限（圖6）。

2.6.2 正交偏最小二乘法-判別分析 依據(jù)PCA結(jié)果，對107株防城金花茶樣品進行正交偏最小二乘法-判別分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）。OPLS-DA模型，R2X=0.592，R2Y=0.821，Q2=0.910，均大于0.5，說明模型穩(wěn)定可靠。同時，200次內(nèi)部交叉驗證模型主要參數(shù)Q2=-0.254，R2=0.058 3，說明OPLS-DA模型不存在過擬合現(xiàn)象。2種防城金花茶指紋類型完全被分開，相互之間沒有出現(xiàn)樣品交叉的情況，且全部樣品均位于95%可信區(qū)間之內(nèi)（圖7a、圖7b）。對110株防城金花茶樣品分層凝聚聚類（Hierarchical agglomerative clustering，HAC），2種防城金花茶指紋類型自下而上各聚為一類（圖7c）。采用變量重要性投影值（Variable importance in project，VIP）篩選造成防城金花茶樣品差異性的標(biāo)志物，其中VIP大于1的成分包括5個，分別為維生素B6、去氧腎上腺素、蘆丁、咖啡堿、金絲桃苷，這些成分是造成2種防城金花茶指紋類型差異的主要標(biāo)志性成分，其余峰VIP小于1，對區(qū)分樣品影響較?。▓D7d）。

3 小結(jié)與討論

全世界已發(fā)現(xiàn)的金花茶組植物有42個種5個變種［11］，廣西壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)第二卷對金花茶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行了規(guī)定，其中來源規(guī)定為“山茶科植物金花茶Camellia petelotii （Merrill） Sealy 的干燥葉”，從其生物性狀描述來看，應(yīng)包含金花茶組里的防城金花茶、顯脈金花茶（Camellia euphlebia Merr.et Sealy）等多個種（變種），可見該質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未對具體種進行規(guī)定。

該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定金花茶含量測定指標(biāo)成分為山柰素（C15H10O6），相關(guān)文獻認(rèn)為山柰酚和山柰素分別是兩種黃酮化合物的中文名稱，屬同一類黃酮醇類天然化合物，其中山奈酚為kaempferol（ CASNo. 520-18-3，C15H10O6，MW286.24），山柰素為kaempferide（kaempferol 4′-methyl ether，CAS No.491-54-3，C16H12O6，MW300.26），山柰素是山奈酚的4′-甲醚化物［18］。從《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（第二卷）來看，該標(biāo)準(zhǔn)中的指標(biāo)成分為山柰素（C16H12O6）。本研究對金花茶進行液相指紋圖譜和質(zhì)譜分析也發(fā)現(xiàn)，多數(shù)金花茶種含有山奈酚，但并未發(fā)現(xiàn)山柰素。而本研究對防城金花茶質(zhì)譜分析結(jié)果顯示有山奈酚，但液相指紋中2種成分均未檢測到，推測可能是含量過低，試驗設(shè)置的液相條件無法檢測到該成分。

本研究分別從性狀、顯微鑒別和含量測定三方面對防城金花茶進行研究，發(fā)現(xiàn)防城金花茶葉中草酸鈣簇晶較多，方晶較少，這與《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》第二卷記載的金花茶葉鑒定結(jié)果一致。不同指紋類型的防城金花茶葉中化學(xué)成分組成及含量存在一定差異，這一研究結(jié)果與主成分分析結(jié)果較為相似，從而進一步論證了化學(xué)模式識別技術(shù)可用于鑒別防城金花茶。本研究由于試驗條件有限，未能檢測出防城金花茶葉含有的所有化學(xué)成分。通過優(yōu)化液相色譜條件，檢測到防城金花茶葉中50多種化學(xué)成分，包括多酚類、黃酮類等，其中黃酮類成分較多，與莫潤宏等［19］、李辛雷等［20］的研究結(jié)果一致。

防城金花茶為金花茶組植物里的1個種，其生物性狀與其他金花茶種具有共同之處，也存在顯著差異性狀。采用單一的鑒別方法難以對金花茶組植物進行鑒別，因此，對防城金花茶進行鑒別時，可先通過形態(tài)、性狀、顯微特征進行初步判斷，再進一步結(jié)合超高效液相色譜法結(jié)果進行綜合判定。

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