壯藥蛇尾草HPLC指紋圖譜及抗氧化活性的譜效關(guān)系

馬雯芳 吳劍麗 張秀麗 藍(lán)昌斌 甘潔雪 周華鋒 王劍

收稿日期：2023-09-25

基金項目：壯瑤藥協(xié)同創(chuàng)新中心項目（桂教科研［2013］20號）；廣西壯瑤藥重點(diǎn)實驗室項目（桂科基字［2014］32號）；廣西重點(diǎn)學(xué)科壯藥學(xué)項目（桂教科研［2013］16號）；廣西協(xié)同創(chuàng)新中心壯瑤藥協(xié)同創(chuàng)新中心科研項目（ZYXT［2015］-13）

作者簡介：馬雯芳（1983-），女，廣西南寧人，教授，博士，主要從事中藥品種鑒定與品質(zhì)評價研究工作，（電話）0771-4953513（電子信箱）

109348793@qq.com；通信作者，王 劍（1981-），講師，碩士，主要從事中醫(yī)藥數(shù)據(jù)挖掘的研究工作，（電話）0771-4953513

（電子信箱） 43582538@qq.com。

馬雯芳，吳劍麗，張秀麗，等. 壯藥蛇尾草HPLC指紋圖譜及抗氧化活性的譜效關(guān)系［J］. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，63（5）：84-90．

摘要：為研究壯藥蛇尾草高效液相（HPLC）指紋圖譜及抗氧化活性間的譜效關(guān)系，建立了蛇尾草藥材高效液相指紋圖譜，采用1， 1-二苯基-2-三硝基苯肼法（DPPH）和鐵離子還原能力法（FRAP）對蛇尾草抗氧化活性進(jìn)行評價，結(jié)合聚類分析、主成分分析和偏最小二乘分析對蛇尾草抗氧化活性進(jìn)行譜效分析。結(jié)果表明，以3號峰（毛蕊花糖苷）為參照峰，確定了11個共有峰，大部分批次蛇尾草的相似度>0.900；通過聚類分析和主成分分析，可將22 批樣品分為兩類；不同產(chǎn)地間蛇尾草毛蕊花糖苷含量在0.38%～4.82%；22批蛇尾草抗氧化活性良好，共有峰1、2、3（毛蕊花糖苷）、6、8、10、11與DPPH自由基清除率呈正相關(guān)，1、2、3（毛蕊花糖苷）、6、10號峰與鐵離子還原能力呈正相關(guān)。建立的蛇尾草HPLC指紋圖譜可靠、準(zhǔn)確，可為蛇尾草抗氧化活性物質(zhì)的篩選及質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞：蛇尾草；指紋圖譜；聚類分析；主成分分析；抗氧化活性；譜效關(guān)系；偏最小二乘回歸分析

中圖分類號：S567.21；R285.5???????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）05-0084-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.05.015??????????? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

HPLC fingerprint and its spectral effect relationship with antioxidant activity of Zhuang medicine Pogonostemon auricularius （L.） Hassk.

MA Wen-fang， WU Jian-li， ZHANG Xiu-li， LAN Chang-bin， GAN Jie-xue， ZHOU Hua-feng， WANG Jian

（Faculty of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning? 530001， China）

Abstract： Aiming to study the relationship between high performance liquid ehromatography （HPLC） fingerprint and antioxidant activity， the HPLC fingerprint of Pogonostemon auricularius （L.） Hassk. was established. Combing with Cluster Analysis， Principal Component Analysis， and Partial Least Squares Regression Analysis， the antioxidant activity of Pogonostemon auricularius （L.） Hassk.was evaluated by 1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine （DPPH） and ferric reducing ability of plasma （FRAP） methods. The results showed that eleven common peaks were identified with peak No. 3 （verbascoside） as the reference peak， and the similarity of most batches of Pogonostemon auricularius （L.） Hassk. was greater 0.900. Through cluster analysis and principal component analysis， twenty-two batches of samples could be divided into two categories. The content of verbascoside in Pogonostemon auricularius （L.） Hassk. from different producing areas ranged from 0.38% to 4.82%. The antioxidant activity of twenty-two lots of Pogonostemon auricularius （L.） Hassk. was good. Peaks 1， 2， 3（verbascoside）， 6， 8， 10， and 11 were positively correlated with DPPH free radical scavenging rate， peaks 1， 2， 3（verbascoside）， 6， and 10 were positively correlated with iron ion reducing ability. The established HPLC fingerprint was reliable and accurate， which could provide reference for the screening and quality control of antioxidant active substances of Pogonostemon auricularius （L.） Hassk.

Key words： Pogonostemon auricularius （L.） Hassk.； fingerprint； cluster analysis； principal component analysis； antioxidant activity； spectrum effect relationship； Partial Least Squares Regression Analysis

蛇尾草又名毛水珍珠草、水珍珠菜、水毛射，為唇形科刺蕊草屬植物水珍珠菜［Pogostemon auricularius （L.） Hassk.］的全草， 其味淡，性涼，有散風(fēng)清熱、消炎止痛、祛濕、拔毒生肌的功效；用于感冒發(fā)熱、皮膚潰瘍、咽喉腫痛、風(fēng)濕痛、驚風(fēng)、毒蛇咬傷［1-4］，生于廣西、廣東、福建、臺灣及云南疏林下濕潤處或溪邊近水潮濕處，蛇尾草為壯族常用民間草藥［5-7］。壯醫(yī)認(rèn)為蛇尾草能調(diào)氣機(jī)、止疼痛、通龍路、消腫痛；用于額哈（毒蛇咬傷）、壩農(nóng)（癰疽）、能唅能累（濕疹）、林得叮相（跌打損傷）［8］。

目前已從基源、性狀、顯微、薄層色譜鑒別等方面對蛇尾草進(jìn)行了研究，初步建立了蛇尾草的質(zhì)量評價方法［9］，但鮮見對其指紋圖譜的研究。指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別已廣泛用于民族藥、中藥的質(zhì)量控制，可從整體上更客觀地反映民族藥、中藥的質(zhì)量，是評價藥材質(zhì)量的重要手段［10-18］。炎癥和多種疾病與人體的自由基有關(guān)，體內(nèi)過多的自由基會導(dǎo)致細(xì)胞損傷、慢性炎癥，加速機(jī)體衰老，誘發(fā)各種疾?。?9-22］，因此研究抗氧化成分及評價抗氧化活性的方法，對開發(fā)更多抗氧化劑具有重要意義。常用的體外抗氧化活性評價方法有DPPH自由基清除法、FRAP總抗氧化能力測定法、ABTS總抗氧化測定法、抗脂質(zhì)過氧化能力測定法等，體外抗氧化活性評價方法簡便、高效、快捷，但單一評價方法均不能直接反映總抗氧化活性，不同的抗氧化活性測定方法反應(yīng)機(jī)理不同故而結(jié)果有差異，因此需采用多種測定方法綜合評價抗氧化活性［22-24］。為此，本研究對22批蛇尾草建立HPLC指紋圖譜，采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼法和鐵離子還原能力法對蛇尾草抗氧化活性進(jìn)行評價，結(jié)合聚類分析、主成分分析進(jìn)行共有峰分析，采用偏最小二乘法分析蛇尾草抗氧化活性譜效關(guān)系，以期為蛇尾草抗氧化活性物質(zhì)的篩選及質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 SOP型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AgiLent 1260型高效液相色譜儀（美國AgiLent公司）；SYNERGYH1型酶標(biāo)儀（美國伯騰公司）；DP5系列超純水儀（美國密理博公司）。

1.1.2 試劑 毛蕊花糖苷對照品（上海阿拉丁生化科技股份有限公司；批號V101318，純度≥98%）；乙腈（賽默飛世爾科技有限公司；批號204127；色譜純）、甲醇（賽默飛世爾科技有限公司；批號207899；色譜純）、2，4，6-三吡啶基三嗪（分析純，Solarbio公司）、硫酸亞鐵（分析純，天津博迪化工股份有限公司）、1， 1-二苯基-2-三硝基苯肼（日本東京化成工業(yè)株式會社，批號6KCYN-LT）、鹽酸（分析純，廉江市愛廉化學(xué)試劑有限公司）、95%乙醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、超純水。

1.1.3 藥材 22批蛇尾草藥材采自廣西、廣東各地，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室蔡毅教授鑒定為唇形科刺蕊草屬植物水珍珠菜的干燥全草，藥材信息見表 1。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Inertsil ODS-3色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相為乙腈-0.2%磷酸，洗脫程序為0～12 min，20%（乙腈）；12～20 min，20%～25%（乙腈）；20～30 min，25%（乙腈）；30～45 min，25%～35%（乙腈）；45～70 min，35%（乙腈）；進(jìn)樣體積為10 μL；柱溫設(shè)置為30 ℃；檢測波長310 nm；流速1.0 mL/min。

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取毛蕊花糖苷對照品5.12 mg，用甲醇定容至10 mL，即得濃度為0.512 mg/mL的對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取蛇尾草藥材粉末（過四號篩）0.3 g，加入25 mL的70%乙醇超聲30 min，經(jīng)離心后取上層清液濾過，即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度試驗 取同一蛇尾草供試品溶液（S6），按“1.2.3”條件制備供試品溶液，按照“1.2.1”色譜條件測定 6 次，記錄保留時間和峰面積。以3號峰（毛蕊花糖苷）的保留時間和峰面積作為參照，計算11個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果11個色譜峰相對保留時間的 RSD為 0.34%～0.55%，相對峰面積的 RSD為0.68%～1.95%，表明該儀器的精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗 取同一蛇尾草供試品溶液（S6），分別于制備后0、3、6、12、24、48 h，按照 “1.2.1”色譜條件測定，記錄峰面積和保留時間。以3號峰（毛蕊花糖苷）為參照峰，結(jié)果測得11個共有色譜峰相對保留時間的RSD為0.13%～1.81%，相對峰面積的RSD為0.49%～2.07%，說明蛇尾草供試品溶液放置室溫下在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.3 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批蛇尾草粉末（S6）0.3 g，稱定 6 份，按“1.2.1”色譜條件測定。以3號峰（毛蕊花糖苷）為參照，結(jié)果測得11個共有色譜峰相對保留時間的RSD為0.07%～0.56%，相對峰面積的RSD為0.76%～2.24%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2 蛇尾草的指紋圖譜與化學(xué)模式識別研究

2.2.1 HPLC指紋圖譜建立 取22批蛇尾草樣品制備供試品溶液，按照“1.2.1”色譜條件測定，將22批蛇尾草的色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A版）”，參照圖譜為S6，時間窗為0.2 s，得到22批蛇尾草HPLC指紋圖譜疊加圖，見圖1。經(jīng)查閱文獻(xiàn)并通過對照品比對［9］，指認(rèn)3號峰為毛蕊花糖苷，結(jié)果見圖2。蛇尾草藥材對照指紋圖譜以中位數(shù)法生成，見圖3。由于3號毛蕊花糖苷色譜峰的峰面積高且分離度較好，因此作為參照峰，計算各共有峰相對保留時間的RSD為0.12%～0.60%，相對峰面積的RSD為38.57%～118.92%，表明不同批次蛇尾草各成分種類基本相同，但是含量差異較大。

2.2.2 相似度評價 將22批蛇尾草樣品的色譜圖導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A版）”進(jìn)行相似度評價，結(jié)果見表2。各批次蛇尾草相似度均大于或等于0.834，除S15和S21外，其余批次蛇尾草的相似度均>0.900，各批次蛇尾草藥材的整體化學(xué)成分差異性較小。

2.2.3 聚類分析 將22批蛇尾草供試品共有峰峰面積的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入IBM SPSS Statistic 23.0軟件，選擇組間聯(lián)接的方法，以余弦作為測量度，根據(jù)各色譜峰的峰面積對其進(jìn)行系統(tǒng)聚類，輸出聚類結(jié)果見圖4。從聚類分析樹狀圖中可以看出，當(dāng)距離為24時，22批供試品分為兩大類，S3、S21、S4為一類，S9、S10、S2、S8、S12、S16、S1、S7、S6、S18、S20、S5、S11、S14、S19、S13、S22、S17、S15為一類，表明不同批次的蛇尾草樣品存在一定差異。

2.2.4 主成分分析 對22批藥材共有峰的峰面積數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，導(dǎo)入IBM SPSS Statistic 23.0軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表3。取主成分對應(yīng)的特征值大于1 的前2個主成分［25-27］，主成分特征值分別為19.260、1.493，方差貢獻(xiàn)率分別為87.545%、6.785%；前2個主成分的累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)94.330%，表明提取前2個主成分可表示蛇尾草藥材中的大部分化學(xué)信息。以前2個主成分為變量，利用IBM SPSS Statistics 23.0軟件繪制主成分得分，見圖5，可以直觀地顯示樣品之間的差異。由圖5可知，S3、S4、S21批次與其他批次距離較遠(yuǎn)，主成分分析的結(jié)果與聚類分析的結(jié)果一致。

2.3 不同產(chǎn)地蛇尾草中毛蕊花糖苷含量的測定

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取毛蕊花糖苷對照品溶液（0.512 mg/mL）0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0 mL于2 mL的容量瓶中，配制成系列對照品溶液，按照“1.2.1”項色譜條件測定，將對照品質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)（X），以峰面積作為縱坐標(biāo)（Y），回歸方程為Y=?? 13 200.742X+4.502 511 8（r=0. 999 95），結(jié)果表明，在0.025 6～0.512 0 mg/mL范圍內(nèi)毛蕊花糖苷的質(zhì)量濃度和峰面積的線性關(guān)系良好。

2.3.2 精密度試驗 取同一毛蕊花糖苷（0.204 8 mg/mL）對照品溶液，在“1.2.1”項色譜條件下測定 6 次，記錄毛蕊花糖苷的峰面積，結(jié)果RSD為0.20%，顯示該儀器的精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一蛇尾草供試品溶液（S6），分別于供試品制備后0、3、6、12、24、48 h，按照“1.2.1”項下的色譜條件進(jìn)樣測定。記錄毛蕊花糖苷的峰面積，結(jié)果RSD為0.75%，說明蛇尾草供試品溶液中毛蕊花糖苷含量在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗 稱取同一份蛇尾草粉末（S6）0.3 g，稱定6份，制備蛇尾草供試品溶液，在“1.2.1”項條件下測定6次，記錄毛蕊花糖苷的峰面積，結(jié)果RSD為2.60%，說明重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取蛇尾草粉末（S6）0.15 g，稱定6份，制備蛇尾草供試品溶液，精密加入適量的對照品溶液，在“1.2.1”項色譜條件下測定，結(jié)果毛蕊花糖苷加樣回收率為96.42%～99.16%，平均加樣回收率為98.15%，RSD為1.08%。

2.3.6 含量測定 精密稱取各批次蛇尾草粉末0.3 g，制備蛇尾草供試品溶液，在“1.2.1”項條件下測定，記錄各批次毛蕊花糖苷峰面積，測得各批次蛇尾草藥材中毛蕊花糖苷含量在0.38%～4.82%，結(jié)果見表4。

2.4 藥效學(xué)研究

2.4.1 DPPH自由基清除率測定 取蛇尾草供試品溶液80 μL與60 μL 0.4 mmol/L的DPPH溶液，避光反應(yīng)30 min，即得樣品組溶液；供試品溶液80 μL與95%乙醇60 μL混勻，避光反應(yīng)30 min，即得樣品空白溶液；95%乙醇80 μL與60 μL 0.4 mmol/L的DPPH溶液混勻，避光反應(yīng)30 min，即得對照溶液；試驗平行3份。在517 nm測得A0、A1、A2。根據(jù)公式DPPH自由基清除率=［1-（A1-A2）/A0］×100%計算，得到自由基清除率為91.78%～95.67%，其中S9抗氧化能力最強(qiáng)，S4抗氧化能力最弱，結(jié)果見表5。

2.4.2 FRAP鐵離子還原能力測定 在酸性環(huán)境下，抗氧化物質(zhì)可以還原Fe3+-三吡啶三吖嗪（Fe3+-TPTZ）生成藍(lán)色的Fe2+-TPTZ［20］。取蛇尾草供試品溶液80 μL加入4 mL FRAP工作液中，避光靜置40 min，于596 nm處測定吸光度。以FeSO4當(dāng)量評價蛇尾草總抗氧化能力，不同批次蛇尾草FeSO4當(dāng)量為101.34～264.73 mg/g，其中S8抗氧化能力最強(qiáng)，S12抗氧化能力最弱，結(jié)果見表6。

2.5 偏最小二乘回歸分析

以11個共有峰的峰面積經(jīng)Z-score標(biāo)準(zhǔn)化處理后為自變量，不同批次蛇尾草供試品抗氧化能力數(shù)據(jù)經(jīng)Z-score標(biāo)準(zhǔn)化處理后為因變量，通過SIMCA 14.1軟件偏最小二乘回歸分析［28，29］，見圖6、圖7。結(jié)果表明，蛇尾草指紋圖譜中峰1、2、3（毛蕊花糖苷）、6、8、10、11與DPPH自由基清除率呈正相關(guān)，峰4、5、7、9則與DPPH自由基清除率呈負(fù)相關(guān)；1、2、3（毛蕊花糖苷）、6、10號峰與鐵離子還原能力呈正相關(guān)，而4、5、7、8、9、11號峰與鐵離子還原能力呈負(fù)相關(guān)。與兩個藥效均呈正相關(guān)的是1、2、3（毛蕊花糖苷）、6、10號峰。VIP是變量重要性值，可評價自變量對因變量解釋的重要程度。對DPPH自由基清除率貢獻(xiàn)較大的峰從大到小依次是9、2、3（毛蕊花糖苷）、4、10，對鐵離子還原能力貢獻(xiàn)較大的峰從大到小依次是2、9、1、3（毛蕊花糖苷）、6。結(jié)果表明蛇尾草各成分發(fā)揮抗氧化作用的途徑各不相同，抗氧化作用是多種化學(xué)成分共同發(fā)揮作用的結(jié)果。

3 小結(jié)與討論

試驗前期分別采用不同濃度甲醇、乙醇和純水作提取溶劑，對浸漬、回流、超聲等方法的提取效果進(jìn)行了比較，也對30、60、90 min不同提取時間進(jìn)行考察，結(jié)果以70%乙醇25 mL超聲提取30 min提取效率較高，峰信息較豐富，峰響應(yīng)值較高。對乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.1 %磷酸、乙腈-0.1 %磷酸、甲醇-0.2%磷酸不同流動相系統(tǒng)進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動相為乙腈- 0.2%磷酸進(jìn)行梯度洗脫時各色譜峰有較好的峰形和分離度。試驗對蛇尾草指紋圖譜進(jìn)行全波長掃描，對310、320、330 nm不同檢測波長進(jìn)行考察，在310 nm 波長下色譜峰較多，響應(yīng)值較高。通過對色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了色譜峰較豐富、分離度好的蛇尾草HPLC指紋圖譜。

試驗采用HPLC法建立了22批蛇尾草的指紋圖譜，其中3號峰為共有峰中最高峰，且保留時間適宜，故以3號峰毛蕊花糖苷為參照峰（S），共確定了11個共有峰，對22批蛇尾草藥材樣品的指紋圖譜分析可知，其共有峰的相對保留時間之間存在的差異比較小，表明本研究建立的蛇尾草藥材指紋圖譜測定方法重復(fù)性良好，但不同批次蛇尾草藥材相對峰面積差異較大，藥材質(zhì)量可能受地域環(huán)境、采收季節(jié)等影響較大。22批蛇尾草指紋圖譜的相似度均大于或等于0.834，表明各批次蛇尾草藥材的整體質(zhì)量相對穩(wěn)定，相似度較好。通過聚類分析和主成分分析，可知22 批蛇尾草樣品分為2類，S3、S4、S21為一類，其余19批為一類，其可能與各成分含量比例差異有關(guān)。毛蕊花糖苷是蛇尾草藥材中的主要成分，峰響應(yīng)值最大，且是發(fā)揮抗氧化作用的活性成分，為了更好地評價蛇尾草藥材的質(zhì)量，在指紋圖譜建立的基礎(chǔ)上，對22批蛇尾草的毛蕊花糖苷進(jìn)行了含量測定，結(jié)果顯示22批蛇尾草中毛蕊花糖苷含量為0.38%～4.82%，平均值為2.50%，受不同產(chǎn)地、采收時間影響［30-34］，不同批次的蛇尾草中毛蕊花糖苷含量有較大差異。分別采用了DPPH法和 FRAP法對蛇尾草抗氧化活性進(jìn)行評價，不同測定方法的反應(yīng)機(jī)理不同而結(jié)果有差異，且不同批次蛇尾草各成分含量存在差異，因此需結(jié)合指紋圖譜綜合評價蛇尾草的質(zhì)量。

本研究采用偏最小二乘回歸分析探討蛇尾草指紋圖譜共有峰與抗氧化活性間的關(guān)聯(lián)，建立譜效間的聯(lián)系，篩選藥效相關(guān)峰，初步確定蛇尾草發(fā)揮抗氧化活性的成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛇尾草指紋圖譜中峰1、2、3（毛蕊花糖苷）、6、8、10、11與DPPH自由基清除率呈正相關(guān)，1、2、3（毛蕊花糖苷）、6、10號峰與鐵離子還原能力呈正相關(guān)，表明蛇尾草各活性成分發(fā)揮抗氧化作用的途徑各不相同，抗氧化作用是多種化學(xué)成分共同發(fā)揮作用的結(jié)果。但因蛇尾草基礎(chǔ)研究較薄弱，蛇尾草抗氧化藥效相關(guān)峰僅指認(rèn)了毛蕊花糖苷，其余藥效相關(guān)峰的鑒別有待進(jìn)一步的研究。

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