徐佳睿　王逸茹　趙紹賡　李坤　鄭軍

摘要：青貯玉米是一種優(yōu)良的飼料作物，是畜牧業(yè)的優(yōu)質(zhì)粗飼料來源。咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（caffeoyl-CoA-O-methyltransferase， CCoAOMT）是木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵甲基轉(zhuǎn)移酶。從玉米自交系B73的EMS突變體庫獲得了ZmCCoAOMT1 基因的單堿基突變體，通過表型分析、生理生化分析、基因表達(dá)分析驗證了ZmCCoAOMT1 的功能。研究發(fā)現(xiàn)，ZmCCoAOMT1 突變造成莖稈木質(zhì)化程度降低、木質(zhì)素含量顯著減少、G型木質(zhì)素（guaiacyl lignin）和S型木質(zhì)素（syringa lignin）含量下降、體外干物質(zhì)消化率提高。此外，突變體莖稈中ZmCCoAOMT1 的表達(dá)量也顯著低于野生型。轉(zhuǎn)錄組分析表明，ZmCCoAOMT1 基因的突變可能調(diào)控苯丙烷代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而引起木質(zhì)素含量和單體組成發(fā)生變化。因此，ZmCCoAOMT1 基因是培育高消化率優(yōu)質(zhì)青貯玉米品種的重要基因資源，研究結(jié)果為木質(zhì)素合成代謝途徑遺傳機理研究提供了重要理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：青貯玉米；木質(zhì)素；轉(zhuǎn)錄組分析；ZmCCoAOMT1

doi：10.13304/j.nykjdb.2024.0186

中圖分類號：S513，Q78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：10080864（2024）05003014

玉米（Zea mays L.）是我國主要糧食作物之一，也是重要的飼料來源。近年來，由于國內(nèi)畜牧業(yè)的迅速擴張，導(dǎo)致人畜之間的糧食競爭愈加激烈[1]，因此，培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的玉米品種至關(guān)重要。青貯玉米是指在籽粒乳熟末期至蠟熟前期收獲的地上全部綠色植株（包括果穗）經(jīng)過青貯發(fā)酵后制作而成的青貯飼料，具有青綠多汁、產(chǎn)量高、適口性好、耐貯存等特點[2]。20世紀(jì)80年代之前，我國尚未培育出專用的青貯玉米品種，為了滿足青貯飼料的需求，許多地區(qū)采用籽粒玉米品種替代[3]。青貯玉米中木質(zhì)素含量過高可能導(dǎo)致牲畜對飼料的消化利用效率下降，嚴(yán)重影響家畜的生產(chǎn)性能。

木質(zhì)素是由苯丙烷基為基本結(jié)構(gòu)單元組成的高分子材料，在植物體內(nèi)占比約為15%～36%，具有緊湊的分子結(jié)構(gòu)[4]。植物苯丙烷代謝途徑（phenylpropanoid metabolic pathway）主要分為3部分：首先是莽草酸途徑，通過糖的代謝過程將葡萄糖轉(zhuǎn)化為莽草酸，再轉(zhuǎn)化為色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸；其次是公共苯丙烷途徑，這個過程從苯丙氨酸出發(fā)，經(jīng)多級酶聯(lián)反應(yīng)，最終生成相應(yīng)的輔酶A；最后是特異木質(zhì)素合成途徑，將催化生成的中間產(chǎn)物輔酶A轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的木質(zhì)素單體：對香豆醇（對羥苯基木質(zhì)素，P-hydroxyphenyl lignin，H型木質(zhì)素）、松柏醇（愈創(chuàng)木基木質(zhì)素，guaiacyllignin，G型木質(zhì)素）和芥子醇（紫丁香基木質(zhì)素，syringa lignin，S 型木質(zhì)素），進(jìn)而參與木質(zhì)素合成[5]。

CCoAOMT 屬于S- 腺苷-L- 甲硫氨酸（Sadenosylmethionine，SAM）甲基轉(zhuǎn)移酶，在苯丙烷代謝通路中存在于公共苯丙烷途徑，主要負(fù)責(zé)將咖啡酰輔酶A轉(zhuǎn)化為阿魏酰輔酶A，在木質(zhì)素合成中起重要作用[6]。其最早在歐芹[7]中發(fā)現(xiàn)，之后在百日草[8] 中首次被證實參與木質(zhì)素合成。CCoAOMT具備催化諸如黃酮類、生物堿等化合物生成甲基化酚類代謝產(chǎn)物的能力[9]，其以咖啡酰輔酶A為底物，將S-腺苷甲硫氨酸中的甲基基團(tuán)傳遞至木質(zhì)素單體，從而促進(jìn)G 型木質(zhì)素的合成[10]。Chen 等[11]揭示了CCoAOMT 基因可以甲基化咖啡酰輔酶A的C3位，進(jìn)一步催化生成木質(zhì)素單體的前體阿魏酰輔酶A。在擬南芥中有2種類型的CCoAOMT：Ⅰ類包含CCoAOMT1，Ⅱ類則包含CCoAOMT2-7[12]，CCoAOMT1 在CCoAOMT 家族基因中是最早被確認(rèn)參與木質(zhì)素合成的[13]。

目前，已從擬南芥、苜蓿、小麥、毛白楊等植物中克隆獲得CCoAOMT 基因。例如，在煙草中抑制CCoAOMT 基因的表達(dá)，導(dǎo)致植株明顯矮化，木質(zhì)素含量下降22.3%，S型和G型木質(zhì)素單體的比例（S/G）增加[14]。在苜蓿中，抑制CCoAOMT1 基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株的G型木質(zhì)素含量下降50%左右，而S型木質(zhì)素的含量保持不變，因此S/G顯著上升，細(xì)胞壁的消化率顯著增加[15]。同時，CCoAOMT對生物和非生物脅迫有重要調(diào)控作用，例如在擬南芥中過量表達(dá)CCoAOMT1 可以提高其對丁香假單胞菌DC3000 的抗性[16]；Chun 等[17]發(fā)現(xiàn)，AtCCoAOMT1 還可以通過ROS和ABA信號通路提高擬南芥的抗旱性，且在同等環(huán)境下擬南芥轉(zhuǎn)基因植株吸收鎘的能力是野生型的2倍，證明了CCoAOMT1 基因能夠降低重金屬對植株的影響，提高植物的修復(fù)能力[18]。

迄今，在玉米基因組中共發(fā)現(xiàn)4個CCoAOMT基因，分別是ZmCCoAOMT1、ZmCCoAOMT2、ZmCCoAOMT3、ZmCCoAOMT4。Fornalé 等[19] 對ZmCOMT2 和ZmCCoAOMT1 的突變體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ZmCCoAOMT1下調(diào)表達(dá)時，莖稈中H型單體的含量有所上升，S型單體略有減少，木質(zhì)素含量減少6.7%。Brenner 等[20] 通過分析40 份青貯玉米自交系發(fā)現(xiàn)，ZmCCoAOMT1 和ZmCCoAOMT2 均與秸稈細(xì)胞壁消化率高度關(guān)聯(lián)；Yang 等[21] 對ZmCCoAOMT2 的突變體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，ZmCCoAOMT2 對小斑病和灰斑病具有顯著抗性。上述研究表明，ZmCCoAOMT 在控制木質(zhì)素含量和不同單體組成以及植物抗逆性方面發(fā)揮重要作用。目前ZmCCoAOMT 基因在玉米中的研究仍然較少。本研究利用ZmCCoAOMT1 基因的單堿基突變體，結(jié)合表型分析、生理生化分析、基因表達(dá)分析和轉(zhuǎn)錄組分析來探究ZmCCoAOMT1 的遺傳機制，對于理解木質(zhì)素合成及代謝途徑具有極其重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料和田間試驗

供試材料ZmCCoAOMT1（Zm00001d036293）基因EMS單堿基突變體（ems-0869cd，ccoaomt1）和同一世代分離的野生型（WT）來自B73玉米突變體庫（www.elabcaas.cn/memd/）。田間試驗在北京市中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所順義基地完成，2022年夏季播種，行長4 m，行距0.6 m，株距0.25 m，每行20穴，每小區(qū)3行。收獲時每個小區(qū)隨機選取15株測定株高（plant height，PH）、穗位高（ear height，EH）等農(nóng)藝性狀[22]。

1.2 基因組DNA、RNA 的提取以及cDNA 的制備

取2 葉1 心期的玉米幼苗第2 片葉，用植物DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取DNA；分別在玉米拔節(jié)期（V9）和吐絲期取地上部第3 節(jié)莖部，RNA prep pure 植物總 RNA 提取試劑盒（Vazyme，南京）提取RNA并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme，南京）制備cDNA。

1.3 EMS 材料篩選與鑒定

利用玉米基因組數(shù)據(jù)庫MaizeGDB（https：//maizegdb.org）檢索ZmCCoAOMT1 基因（登錄號：Zm00001d036293）序列，設(shè)計引物ZmCCoAOMT1-EMS-F1/R1（表1）進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系50 μL：Phanta Uc Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL、正反向引物各2 μL、dNTP Mix 1 μL、5 × Uc Bufferfor Library Amplification 10 μL、DNA 2 μL、ddH2O32 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 60 s，30 個循環(huán)；72 ℃終延伸 5 min。將擴增產(chǎn)物送生工生物工程股份有限公司測序。

1.4 木質(zhì)素染色

取成熟期的突變體和野生型地上部第3莖節(jié)節(jié)間，浸泡在FAA 固定液（70% 乙醇90 mL、38%甲醛5 mL、冰醋酸5 mL、甘油5 mL）中固定2 h后取出，用3% 瓊脂糖包埋，進(jìn)而用震蕩切片機（LeicaVT1000s，德國）切片，厚度為45 μm。將切片平整展于載玻片上，加Wiesner試劑染色2 min[23]，用體式顯微鏡（Leica M205 FA，德國）觀察拍照。

1.5 木質(zhì)素相關(guān)性狀測定

在玉米授粉后30～40 d，選取8株長勢一致的植株，截取地上部倒數(shù)第3～4莖節(jié)，立即在105 ℃下殺青30 min，65 ℃烘干至恒重，用粉碎機粉碎，過40目網(wǎng)篩，再次烘干，粉末用于木質(zhì)素總量、消化品質(zhì)和單體組成測量。每次實驗進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。

1.5.1 木質(zhì)素含量測定

取研磨好的玉米莖稈粉末2 mg，使用木質(zhì)素含量測定試劑盒（科銘生物有限公司）進(jìn)行處理，將木質(zhì)素中的酚羥基乙?；笊梢阴Ｄ举|(zhì)素，使用Multiskan SkyHigh酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司，美國）測定280 nm波長處的特征吸收峰，通過吸光值的變化定量木質(zhì)素的含量。

1.5.2 木質(zhì)素消化品質(zhì)測定

將研磨好的玉米莖稈粉末裝滿于10 mL西林瓶中，放置在MPA近紅外光譜儀（布魯克科技有限公司，德國）的樣品旋轉(zhuǎn)池中，每個樣品重復(fù)3次，分別測定酸性洗滌木質(zhì)素（acid detergent lignin，ADL）、酸性洗滌纖維（acid detergent fiber，ADF）、中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）和體外干物質(zhì)消化率（in vitro dry matter digestibility，IVDMD）[24]。

1.5.3 木質(zhì)素單體測定

取研磨好的玉米莖稈粉末1 g，采用硫代酸解法對玉米莖稈粉末進(jìn)行處理使木質(zhì)素分子鏈上的β-O-４醚鍵斷裂，生成木質(zhì)素單體，利用GCMS-TQ 8050 NX液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（SHIMADZU，日本）測定對羥基苯甲醛（H型）、丁香醛（S型）、香草醛（G型）3種木質(zhì)素單體含量[25]。

1.6 基因表達(dá)量分析

qRT-PCR 用熒光定量試劑盒ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，南京）檢測ZmCCoAOMT 基因在玉米不同生長時期的表達(dá)量，所用引物為ZmCCoAOMT1-Q-F1/R1、ZmCCoAOMT2-Q-F1/R1、ZmCCoAOMT3-Q-F1/R1、ZmCCoAOMT4-Q-F1/R1，內(nèi)參基因選擇玉米三磷酸甘油醛脫氫酶基因GAPDH（表1）。反應(yīng)體系20 μL：2 × AceQ qPCR SYBR Green Master Mix10 μL、正反向引物各0.4 μL、cDNA 2 μL、ddH2O7.2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)。用2-ΔΔCT 法[26]計算基因的相對表達(dá)水平。

1.7 轉(zhuǎn)錄組分析

分別在突玉米拔節(jié)期（V9）和吐絲期取變體和野生型的的莖稈提取RNA，送安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司（北京）構(gòu)建cDNA測序文庫。樣品分成Ⅰ（V9-WT）、Ⅱ（V9-ccoaomt1）、Ⅲ（吐絲-WT）和Ⅳ（吐絲-ccoaomt1）4個組，3次重復(fù)。對其文庫質(zhì)量進(jìn)行檢測，質(zhì)量合格的cDNA文庫用Illumina 高通量測序平臺進(jìn)行測序。用RSEM軟件對樣本中的基因豐度進(jìn)行定量分析，用FPKM方法對各個樣本中的基因表達(dá)量進(jìn)行計算，比較不同樣本間的數(shù)據(jù)篩選出差異表達(dá)基因，用 DESeq 進(jìn)行差異基因分析，以FDR<0.05且|log2 FC|>1（FC為變異倍數(shù)，fold change）為標(biāo)準(zhǔn)篩差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）。

對差異表達(dá)基因（DEGs）進(jìn)行GO[27]（geneontology，http：//www.geneontologyorg/）功能富集分析；以及利用KEGG[28]（kyoto encyclopedia ofgenes and genomes，http：//www.genome.jp/kegg/）進(jìn)行通路（pathway）富集分析，以 KEGG 數(shù)據(jù)庫中通路為單位，以參考基因組背景為對照，將差異基因顯示于KEGG通路圖上。閾值設(shè)置為顯著性P<0.05，使用R 軟件中clusterProfiler 語言包對差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析和可視化[29]，并利用ggplot2語言包作圖。

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）的準(zhǔn)確性，隨機挑選了15個在2個時期苯丙氨酸途徑的差異基因進(jìn)行qRT-PCR驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmCCoAOMT1 突變體的鑒定

為了探究ZmCCoAOMT1 基因的功能，從B73玉米突變體庫獲得了ZmCCoAOMT1 單堿基突變體ccoaomt1，突變類型為翻譯提前終止，CDS序列第558 位堿基由C 突變成T（圖1A～C），野生型為同一世代分離出的顯性純合體。對突變體和野生型進(jìn)行qRT-PCR，結(jié)果表明，突變體中ZmCCoAOMT1 基因的表達(dá)量與野生型相比顯著降低（圖1D），說明該單堿基突變對ZmCCoAOMT1基因表達(dá)有顯著影響。

2.2 ZmCCoAOMT1 的進(jìn)化樹分析

ZmCCoAOMT1 的開放閱讀框長度為792 bp，編碼258個氨基酸，通過Protein BLAST數(shù)據(jù)庫篩選出與ZmCCoAOMT家族編碼的同源性較高的物種，包括擬南芥（Arabidopsis thaliana）、小麥（Triticum aestivum）、稷（Panicum miliaceum）等。CCoAOMT氨基酸序列分為5類（圖2）：Ⅰ類包括ZmCCoAOMT1和ZmCCoAOMT2和絕大部分高粱CCoAOMT 氨基酸序列，Ⅱ類包括ZmCCoAOMT3和大部分煙草CCoAOMT氨基酸序列，Ⅲ和Ⅳ為擬南芥CCoAOMT 的氨基酸序列，Ⅴ 類僅有ZmCCoAOMT4。結(jié)果表明，ZmCCoAOMT1 和ZmCCoAOMT2親緣關(guān)系最近，與ZmCCoAOMT3和ZmCCoAOMT4親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 ZmCCoAOMT1 突變對株型的影響

對突變體和野生型農(nóng)藝性狀進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，ccoaomt1 突變體的株高和穗位高與野生型相比略有增高，但不顯著，分別增加了1.4% 和6.9%（圖3A和B），說明ZmCCoAOMT1 單堿基突變未對玉米株高等株型性狀產(chǎn)生顯著正向作用。

2.4 ZmCCoAOMT1 突變對木質(zhì)素合成代謝的影響

2.4.1 ZmCCoAOMT1 突變對木質(zhì)素染色的影響

為了初步探究ZmCCoAOMT1 突變對木質(zhì)素的影響，對野生型和突變體莖稈進(jìn)行木質(zhì)素染色，與野生型相比，突變體莖稈的染色變淺，木質(zhì)化程度明顯降低，細(xì)胞中的維管束和厚壁組織有所減少，表明ZmCCoAOMT1 基因的單堿基突變影響植株的木質(zhì)素含量（圖4）。

2.4.2 ZmCCoAOMT1 突變對木質(zhì)素含量、組成及消化品質(zhì)的影響

為了進(jìn)一步探究ZmCCoAOMT1突變對木質(zhì)素組分的影響，對突變體和野生型的ADL、ADF、NDF、IVDMD和木質(zhì)素單體等關(guān)鍵成分進(jìn)行比較，結(jié)果如圖5和表2所示。與野生型相比，突變體莖稈中木質(zhì)素含量顯著降低，ADF和NDF略微下降，消化率提高了6.8%。木質(zhì)素單體中G型含量下降4.9%，S型含量下降18.8%，H型因峰圖出現(xiàn)干擾而造成數(shù)據(jù)波動較大。上述結(jié)果表明，ZmCCoAOMT1 基因的突變會降低木質(zhì)素含量并提高消化率，G型和S型木質(zhì)素顯著下降。

2.5ZmCCoAOMT 基因表達(dá)量分析

為了探究ZmCCoAOMT1 基因突變是否會對該家族其他基因表達(dá)造成影響，在V9期和吐絲期利用qRT-PCR 檢測ZmCCoAOMT1、ZmCCoAOMT2、ZmCCoAOMT3、ZmCCoAOMT4 基因在莖中的表達(dá)量。結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)，在V9 期ccoaomt1 突變體中，ZmCCoAOMT1 表達(dá)量呈顯著下降，ZmCCoAOMT2 略微上升，ZmCCoAOMT3 略微下降，ZmCCoAOMT4 略微上升；在吐絲時期ccoaomt1突變體中，ZmCCoAOMT1 基因表達(dá)量呈極顯著下降，ZmCCoAOMT2 呈極顯著上升，ZmCCoAOMT3略微上升，ZmCCoAOMT4略微下降。上述結(jié)果說明ZmCCoAOMT2對ZmCCoAOMT1基因可能存在補償效應(yīng)。

2.6 野生型和ccoaomt1 突變體在V9 時期和吐絲期的轉(zhuǎn)錄組分析

2.6.1 差異表達(dá)基因的qRT-PCR 驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組分析中RNA-seq 結(jié)果的準(zhǔn)確性，利用qRT-PCR對隨機挑選15個差異表達(dá)基因進(jìn)行表達(dá)量分析驗證。結(jié)果表明，qRT-PCR的表達(dá)量結(jié)果與RNA-Seq的結(jié)果一致（圖7A），兩種方法檢測的結(jié)果之間相關(guān)系數(shù)（r）為0.934 9（圖7B），驗證了RNA-Seq分析結(jié)果的可靠性。

2.6.2 差異表達(dá)基因分析

對V9期和吐絲期的野生型和ccoaomt1 突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，經(jīng)過測序數(shù)據(jù)質(zhì)控和數(shù)據(jù)比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在V9時期一共篩選出3 976 個DEGs，其中有1 637 個基因上調(diào)，2 339 個基因下調(diào)；在吐絲時期一共篩選出2 542個DEGs，其中有904個基因上調(diào)，1 638個基因下調(diào)。V9時期和吐絲時期共同表達(dá)的基因為682個，突變體中同時上調(diào)的基因為258個，同時下調(diào)的基因為424個（圖8）。

2.6.3 差異表達(dá)基因的GO富集分析和KEGG分析

對顯著的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析，結(jié)果如圖9所示。在V9期，GO富集分析DEGs共106個條目，主要富集到脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)錄（DNAtemplatedtranscription） 、細(xì)胞質(zhì)膜（plasmamembrane）、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（DNAbindingtranscription factor activity）等類別（ 圖9A）。在吐絲期，GO富集分析DEGs共29個條目，主要富集到防御反應(yīng)（defense response）、細(xì)胞質(zhì)膜（plasma membrane）、DNA 結(jié)合（DNA binding）等類別（圖9B）。

2.6.4 差異表達(dá)基因的GO富集分析和KEGG分析

為了進(jìn)一步分析DEGs的功能，對鑒定到的DEGs進(jìn)行KEGG富集分析。結(jié)果（圖10）顯示，在V9 期主要被富集到苯丙烷生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）、植物-病原體相互作用（plant?pathogen interaction）、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（plant hormone signal transduction）等相關(guān)的通路（圖10A）；在吐絲期主要被富集到谷胱甘肽代謝（glutathione metabolism）、脫氧核糖核酸復(fù)制（DNA replication）等相關(guān)的通路（圖10B）。

2.6.5 木質(zhì)素苯丙烷合成通路相關(guān)基因表達(dá)分析

根據(jù)KEGG分析結(jié)果，V9期差異表達(dá)基因主要富集到與木質(zhì)素合成代謝通路相關(guān)的苯丙烷生物合成途徑。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，25個與木質(zhì)素合成代謝有關(guān)的基因差異表達(dá)，其中4個基因表達(dá)量上調(diào)，均為編碼過氧化物酶（peroxidase，POD）基因；21個表達(dá)量下調(diào)基因，其中編碼過氧化物酶基因13個，以及CCR、HCT、CSE 等控制木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶基因8個（表3）。

3 討論

3.1 ZmCCoAOMT1 基因突變影響玉米木質(zhì)素合成和消化率

咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）、咖啡醜輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（CCoAOMT）和阿魏酸5-羥基化酶（F5H）是參與調(diào)節(jié)植物木質(zhì)素特異生物合成的3 類主要酶類。Fornalé 等[19]發(fā)現(xiàn)，ZmCCoAOMT1的突變會引起突變體的株高略微下降，但沒有引起顯著性差異，葉中脈未出現(xiàn)褐色顯色變化。本研究發(fā)現(xiàn)，和野生型相比，ccoaomt1 突變體株高和穗位高略微增加但并沒有發(fā)生顯著改變，葉中脈無褐色顯色反應(yīng)，與上述結(jié)論一致。木質(zhì)素是制約動物消化的關(guān)鍵因素，利用酸性間苯三酚（wiesner試劑）染色觀察莖部的木質(zhì)化部位，莖部維管束染色略有降低，且靠近維管束內(nèi)部紅色較深，維管束鞘顏色較淺，說明ZmCCoAOMT1基因的突變會造成莖稈中次生細(xì)胞壁的木質(zhì)化程度降低。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，突變體中木質(zhì)素總含量極顯著降低，G型和S型木質(zhì)素單體含量都有下降趨勢，但未達(dá)到極顯著水平，且體外干物質(zhì)消化率略有提高。木質(zhì)素合成通路中，CCoAOMT 基因編碼的酶是主要控制向G型木質(zhì)素單體轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵甲基轉(zhuǎn)移酶，而本研究中G、S型木質(zhì)素單體含量變化差異未達(dá)到極顯著水平，在Fornalé 等[19] 的研究中發(fā)現(xiàn)，ZmCCoAOMT1 基因的敲除對木質(zhì)素總量和單體含量均未造成明顯改變，推測可能是由于ZmCCoAOMT 蛋白家族的其他成員在ZmCCoAOMT1 基因突變后維持了部分甲基轉(zhuǎn)移酶的豐度。

3.2 ZmCCoAOMT2 對ZmCCoAOMT1 基因表達(dá)存在補償效應(yīng)

利用qRT-PCR 對突變體和野生型ZmCCoAOMT 家族4 個基因在V9 和吐絲期的表達(dá)量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)V9 期和吐絲期突變體中ZmCCoAOMT1 表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢，ZmCCoAOMT2 的表達(dá)量增加，ZmCCoAOMT3 和ZmCCoAOMT4 在2個時期之間變化趨勢不同，且均未達(dá)到顯著水平。RNA-seq 結(jié)果顯示，ZmCCoAOMT2 在V9 期和吐絲期的表達(dá)量增高，盡管表達(dá)量差異未達(dá)到顯著但趨勢與qRT-PCR結(jié)果相同。通過進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，在玉米ZmCCoAOMT 基因家族中ZmCCoAOMT1 與ZmCCoAOMT2 之間親緣關(guān)系更近，而ZmCCoAOMT3、ZmCCoAOMT4 與ZmCCoAOMT1之間關(guān)系較遠(yuǎn)。從表達(dá)模式上可以推測ZmCCoAOMT2 對ZmCCoAOMT1 基因可能存在補償效應(yīng)。

3.3 ZmCCoAOMT1 對木質(zhì)素合成通路的影響

對突變體和野生型植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，在V9和吐絲2個時期共同差異表達(dá)的基因共682 個，經(jīng)過GO 富集分析顯示，在V9 期，ZmCCoAOMT1 表達(dá)量變化主要參與調(diào)節(jié)植物的轉(zhuǎn)錄、對環(huán)境脅迫的響應(yīng)以及細(xì)胞膜類的組成等方面；在吐絲期，ZmCCoAOMT1 突變對生物過程（biological process，BP）影響減少，對細(xì)胞組分（cell composition， CC）影響增加。說明該基因在發(fā)育前期可能主要參與調(diào)控植物的轉(zhuǎn)錄激活及對外環(huán)境脅迫的響應(yīng)，在后期主要通過調(diào)節(jié)植物的細(xì)胞組分（CC）來調(diào)控植物生長發(fā)育。

苯丙烷是包括類黃酮、木質(zhì)素在內(nèi)的一大類植物次級代謝產(chǎn)物的總稱，木質(zhì)素合成途徑屬于苯丙烷代謝途徑的分支[30]，KEGG分析顯示，在生育前期差異表達(dá)基因主要富集在苯丙烷代謝通路中， ZmCCoAOMT1 基因的突變可能導(dǎo)致了苯丙烷代謝途徑中若干基因表達(dá)量的變化進(jìn)而引起木質(zhì)素含量甚至單體組成發(fā)生了改變。對比V9期野生型和突變體，富集在苯丙烷代謝途徑中的差異表達(dá)基因中絕大多數(shù)都為下調(diào)表達(dá)，與突變體中ZmCCoAOMT1 基因的表達(dá)量變化一致，符合預(yù)期。在苯丙烷代謝途徑中差異表達(dá)基因主要包括若干過氧化物酶基因，其編碼木質(zhì)素生物合成最后一步反應(yīng)的酶，將木質(zhì)素單體催化脫氫后聚合產(chǎn)生大分子木質(zhì)素[31]。由于植物細(xì)胞壁中過氧化物酶存在多種同工酶，其在木質(zhì)素合成過程中具有的多樣化作用對木質(zhì)素合成調(diào)控作用也因單體不同而造成差異[32]。本研究中過氧化物酶基因的下調(diào)表達(dá)可能對突變體中木質(zhì)素總含量和單體含量下降發(fā)揮了作用。除此之外，突變體中位于CCoAOMT 基因上下游的HCT、CSE、CCR 等基因的表達(dá)量也顯著降低，是由于ZmCCoAoMT1 基因的下調(diào)表達(dá)引起產(chǎn)物阿魏酸輔酶A減少后對上下游酶產(chǎn)生的反饋調(diào)節(jié)[33]。這些結(jié)果為進(jìn)一步理解木質(zhì)素合成與代謝提供參考，但還需要進(jìn)一步分子生物學(xué)論證。

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（責(zé)任編輯：溫小杰）

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2023YFD1200500）。