馮魯信 劉濤 徐慶玲 萬浩然 孫志雨 郭俊杰

［摘要］ 目的

探討硫酸吲哚酚（IS）對心肌梗死（myocardial infarction， MI）模型小鼠心肌重構(gòu)的影響。

方法 C57BL/6J成年雄性小鼠50只，隨機分為假手術(shù)組（Sham組）10只，硫酸吲哚酚組（Sham+IS組）10只，心肌梗死組（MI組）15只，心肌梗死+硫酸吲哚酚組（MI+IS組）15只。采用左前降支冠狀動脈結(jié)扎術(shù)構(gòu)建小鼠MI模型，術(shù)后第24小時，Sham+IS組和MI+IS組小鼠每天腹腔注射IS 100 mg/kg，Sham組和MI組每天腹腔注射等體積PBS，連續(xù)28 d，期間記錄各組小鼠存活情況。實驗第30天，心臟超聲檢查評估各組小鼠心臟功能，超高效液相色譜法檢測各組小鼠血清中IS濃度，Masson染色評估各組小鼠梗死區(qū)心肌纖維化程度，RT-qPCR技術(shù)檢測心肌組織α-sma、CollagenⅠ基因的表達水平，Western blot技術(shù)檢測心肌組織TGF-β信號通路標記蛋白TGF-β、p-Smad2、p-Smad3的表達水平。

結(jié)果 實驗第30天時，與MI組相比，MI+IS組小鼠存活率顯著下降（χ2=5.02，P<0.05）。與Sham組相比，Sham+IS組小鼠血清中IS濃度顯著升高（t=54.87，P<0.05），與MI組相比，MI+IS組小鼠血清中IS濃度顯著升高（t=38.55，P<0.05）。心臟超聲檢查示，Sham組和Sham+IS組的小鼠左心室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、左心室射血分數(shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）無顯著差異（P>0.05）；與MI組相比，MI+IS組小鼠LVIDd、LVIDs顯著增大（t=3.96、4.31，P<0.05），LVEF、LVFS顯著降低（t=5.68、4.07，P<0.05）。Masson染色示，MI+IS組與MI組比較小鼠心肌間質(zhì)膠原纖維沉積明顯增多。RT-qPCR技術(shù)檢測顯示，MI+IS組與MI組相比，小鼠心肌組織α-sma、CollagenⅠ基因的表達水平顯著升高（t=8.74、4.78，P<0.05）。Western blot方法檢測顯示，MI+IS組與MI組相比小鼠心肌組織中TGF-β、p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達水平均顯著升高（t=4.04～5.64，P<0.05）。

結(jié)論 IS可加重小鼠MI后病理性心肌重構(gòu)，其機制可能與TGF-β信號通路激活相關(guān)。

［關(guān)鍵詞］ 靛甙；心肌梗死；疾病模型，動物；心室重構(gòu)；轉(zhuǎn)化生長因子β；信號傳導(dǎo)

［中圖分類號］ R542.22??? ［文獻標志碼］ A

在全球范圍內(nèi)，心肌梗死（MI）仍是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一，盡管再灌注治療策略在一定程度上降低了患者的病死率，但MI后心力衰竭的發(fā)生，仍對患者的預(yù)后構(gòu)成嚴重威脅[1]。以心肌肥大、心肌纖維化等為特征的病理性心肌重構(gòu)是MI后心力衰竭發(fā)生的重要機制之一[2]。硫酸吲哚酚（IS）是一種小分子蛋白結(jié)合型尿毒癥毒素[3]，與心力衰竭、心律失常等心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[4-7]，但目前IS對MI后病理性心肌重構(gòu)的影響尚不明確。本研究通過檢測IS對MI模型小鼠存活率、心功能等的影響，探討IS對MI后心肌重構(gòu)的影響及其作用機制，旨在為MI后病理性心肌重構(gòu)的干預(yù)治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與材料

成年雄性C57BL/6J小鼠50只，8～10周齡，體質(zhì)量20～22 g，購買于北京華阜康生物科技公司。IS、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑購買于美國MedChemExpress公司。TRIzol購自美國Invitrogen公司。RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。Masson染色液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 動物分組及MI模型的構(gòu)建

將小鼠隨機分為四組，即假手術(shù)組（Sham組）10只，硫酸吲哚酚組（Sham+IS組）10只，心肌梗死組（MI組）15只，心肌梗死+硫酸吲哚酚組（MI+IS組）15只。所有小鼠予以2%異氟烷吸入麻醉后，在動物呼吸機支持下開胸并暴露心臟，MI組和MI+IS組小鼠采用左前降支冠狀動脈結(jié)扎術(shù)構(gòu)建MI模型，用6-0絲線在左心耳下緣2～3 mm處結(jié)扎，結(jié)扎點以下至心尖部心肌泛白，提示造模成功；Sham組和Sham+IS組小鼠將6-0絲線在左心耳下緣2～3 mm處穿過，不進行結(jié)扎。術(shù)后24 h，Sham+IS組以及MI+IS組小鼠每天腹腔注射IS 100 mg/kg，Sham組及MI組小鼠每天腹腔注射等體積PBS，均連用28 d。期間記錄各組小鼠生存情況，計算各組小鼠的存活率。

1.3 心臟超聲檢查評估小鼠心臟功能

在實驗第30天時，各組小鼠以2%異氟烷吸入麻醉，使用VINNO 6 LAB型動物超聲成像系統(tǒng)（蘇州飛依諾科技有限公司），在小鼠乳頭肌水平的胸骨旁長軸視圖中記錄二維引導(dǎo)的M型圖像。通過設(shè)定的標準公式計算左心室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、左心室短軸縮短率（LVFS）、左心室射血分數(shù)（LVEF）。

1.4 超高效液相色譜（UPLC）法檢測小鼠血清中IS濃度

心臟超聲檢查結(jié)束后，眼球取血法收集各組小鼠血液樣本，置于不含抗凝劑試管中，4 ℃靜置過夜后，以3 000 r/min室溫離心10 min，上清液即為血清，將血清置于1.5 mL的EP管中。參考既往研究方法[8]，用UPLC法檢測各組小鼠血清IS濃度。

1.5 Masson染色評估小鼠心肌組織纖維化水平

各組小鼠眼球取血后，頸椎脫臼法處死，剝離心臟，每組隨機選取3只小鼠心臟組織，生理鹽水沖洗后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，梯度乙醇脫水后，將心臟組織包埋在石蠟中。使用Masson染色液對心臟組織石蠟切片（厚度3～5 μm）進行染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠心肌間質(zhì)膠原纖維沉積情況。

1.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測小鼠心肌組織α-sma、Collagen Ⅰ基因的表達水平

將各組小鼠剩余所有心肌組織漂洗后剪碎，分別隨機稱取30 mg置于1.5 mL離心管，每管加入1 mL TRIzol后在組織研磨儀中充分研磨，按照試劑盒說明書的操作要求完成總RNA提取，－80 ℃保存?zhèn)溆?。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，繼而以此為模板進行RT-qPCR。實驗所用引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計合成，引物序列：α-sma F：5′-TGGAGCCTCATGTACCTGGTAACC-3′，α-sma R：5′-CTGCCGATCFCTGCCAATCACTG-3′；CollagenⅠ F：5′-ACAGGCGAACAAGGTGACAGAG-3′，CollagenⅠ R：5′-AGGAGAACCAGGAGAACCAGGAG-3′；GAPDH F：5′-AACTTTGGCATTGTGGAAGGGCTC-3′，GAPDH R：5′-TGGAAG-

AGTGGGAGTTGCTGTTGA-3′。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-△△CT方法計算目的基因的相對表達量。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.7 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測小鼠心肌組織TGF-β信號通路相關(guān)標記蛋白表達水平

隨機取每組小鼠心肌組織碎塊各20～30 mg置于1.5 mL EP管中，按照RIPA裂解液∶蛋白酶抑制劑∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶1的比例，每管中加入300 μL的總裂解液，充分研磨后冰上靜置30 min，提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后加入SDS-PAGE上樣緩沖液蛋白loading buffer，98 ℃煮沸10 min變性，待冷卻后－80 ℃儲存?zhèn)溆?。蛋白樣品?0～30 μg）以10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)膜1 h，使用快速封閉液（QuickBlockTM Blocking Buffer）封閉15 min以后，依次加入兔抗鼠TGF-β多克隆抗體（1∶500）、兔抗鼠Smad2/3單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗鼠p-Smad2單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗鼠p-Smad3單克隆抗體（1∶1 000）、兔抗鼠GAPDH多克隆抗體（1∶10 000）后，于4 ℃孵育過夜，以TBST溶液清洗后，加入山羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育1.5 h，使用超敏ECL發(fā)光液顯影。使用Image J軟件分析相關(guān)蛋白的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參照，目的蛋白的相對表達水平以目的蛋白灰度值/內(nèi)參照蛋白灰度值表示。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 9.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以[AKx-D]±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。繪制Kaplan-Meier生存曲線，采用log-rank檢驗比較四組間生存率有無統(tǒng)計學(xué)差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 IS對各組小鼠存活率的影響

實驗第30天時，Sham組與Sham+IS組小鼠全部存活，MI組小鼠存活13只，MI+IS組小鼠存活7只，Kaplan-Meier生存分析顯示，各組小鼠存活率比較差異有顯著性（χ2=16.95，P<0.05），其中MI+IS組與MI組、Sham組、Sham+IS組相比，小鼠存活率顯著降低（χ2=5.02～7.20，P<0.05），Sham組與Sham+IS組、Sham組與MI組、MI組與Sham+IS組相比，小鼠存活率差異無顯著意義（P>0.05）。見圖1。

2.2 IS對各組小鼠心臟功能的影響

實驗第30天時，心臟超聲檢查結(jié)果顯示，四組小鼠的心臟功能各項指標比較差異均具有顯著性（F=48.41～140.60，P<0.05）；其中MI+IS組與MI組、MI組與Sham組、MI組與Sham+IS組各項指標比較差異均有顯著性（t=3.96～14.54，P<0.05），Sham+IS組與Sham組各項指標比較差異無顯著性（P>0.05）。見表1。

2.3 各組小鼠血清中IS濃度比較

實驗第30天時，Sham組、Sham+IS組、MI組及MI+IS組小鼠血清IS濃度分別為（0.09±0.01）、（3.09±0.17）、（0.13±0.03）、（3.27±0.22）mg/L，各組小鼠血清中IS濃度比較差異具有顯著意義（F=1 449.00，P<0.05）；Sham+IS組與Sham組、MI+IS組與MI組、Sham+IS組和MI組比較，血清中IS的濃度顯著升高（t=38.55～54.87，P<0.05），Sham組和MI組比較血清中IS濃度差異無顯著性（P>0.05）。

2.4 IS對各組小鼠心肌纖維化的影響

各組小鼠心肌組織的Masson染色結(jié)果顯示，Sham組和Sham+IS組未見異常膠原纖維沉積，MI組和Sham組相比，可見明顯的膠原纖維沉積，MI+IS組和MI組比較，心肌間質(zhì)膠原纖維沉積明顯增多（圖2），圖中藍色染色部分為沉積的心肌間質(zhì)膠原纖維。各組小鼠α-sma、CollagenⅠ基因表達水平比較差異有顯著性（F=101.30、64.90，P<0.05）；MI+IS組與MI組、MI組與Sham組比較，α-sma、CollagenⅠ表達水平差異具有顯著意義（t=4.22～8.80，P<0.05），但Sham和Sham+IS組間比較差異無顯著性（P>0.05）。見表2。

2.5 IS對心肌組織中TGF-β信號通路相關(guān)標記蛋白表達的影響

Western blot方法檢測結(jié)果顯示，各組間心肌組織中TGF-β、p-Smad2、p-Smad3蛋白表達水平比較差異具有顯著性（F=88.48～200.30，P<0.05）；MI+IS組和MI組、MI組和Sham組比較，TGF-β、p-Smad2、p-Smad3蛋白表達水平均性增高，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.04～18.91，P<0.05），但Sham+IS組和Sham組比較差異無顯著性（P>0.05）。見表3。

3 討? 論

得益于再灌注治療策略的開展，MI患者的病死率近幾年顯著下降，但梗死后心力衰竭的發(fā)生仍然是影響患者長期預(yù)后的重要因素之一[2]，而病理性心肌重構(gòu)則是梗死后心力衰竭發(fā)生的關(guān)鍵原因，其病理過程涉及心肌肥厚、心肌纖維化、炎癥過度激活、細胞代謝失衡以及血管再生抑制等[2，8]。研究表明，與腎功能正常MI患者相比，慢性腎臟疾?。–KD）患者MI病死率顯著升高[10-11]，其中，尿毒癥毒素作為CKD相關(guān)危險因素在MI后心肌病理性改變過程中發(fā)揮重要作用[12]。IS因其蛋白結(jié)合特性，常規(guī)透析治療對其清除效果差[13]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，IS可加重穩(wěn)定型心絞痛或經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)后患者的左心室舒張功能不全[14]。此外，當透析患者血液中IS水平超過32.35 mg/L時，其首次心力衰竭事件的發(fā)生率顯著升高[15]。

本研究中發(fā)現(xiàn)，與MI組相比，MI+IS組小鼠生存率顯著降低。為評估IS對MI后心臟功能的影響，對各組小鼠進行心臟超聲檢查，結(jié)果顯示，與MI組相比，MI+IS組小鼠心臟收縮功能顯著降低，但Sham組和Sham+IS組間無顯著差異，提示IS可能通過促進MI后的病理性心肌重構(gòu)，加重MI后的心功能障礙，導(dǎo)致小鼠MI后生存率顯著下降。與本研究發(fā)現(xiàn)一致，在達爾鹽敏感型高血壓大鼠模型中，IS通過激活心肌組織中AhR/NF-κb信號通路促進NLRP3炎癥小體表達升高，導(dǎo)致大鼠心功能障礙加重[16]。心肌纖維化是病理性心肌重構(gòu)的基本病理改變之一，本研究中，Masson染色結(jié)果顯示，與MI組相比較，MI+IS組小鼠心肌間質(zhì)膠原纖維沉積顯著增多；RT-qPCR結(jié)果顯示，與MI組相比較，MI+IS組小鼠心肌組織纖維化相關(guān)基因α-sma、CollagenⅠ表達水平顯著增高，Sham+IS組和Sham組相比差異無顯著性，提示IS可能通過加重小鼠心肌纖維化，加速MI后病理性心肌重構(gòu)的進展。

心肌纖維化是指細胞外基質(zhì)（ECM）蛋白，例如Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ，在心肌間質(zhì)的過度沉積。MI發(fā)生后，過度和持續(xù)的刺激（如尿毒癥毒素）可誘導(dǎo)心肌成纖維細胞分化、增殖活動增強，導(dǎo)致膠原纖維大量分泌、ECM成分（如TGF-β因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等）過度激活[17]。其中，TGF-β信號通路在組織纖維化過程中發(fā)揮著重要作用[18]，活化狀態(tài)下TGF-β通過誘導(dǎo)其下游Smad2、Smad3磷酸化，來促進肌成纖維細胞的活化和增殖，以及ECM的生成[19-20]。磷酸化的Smad3可以直接調(diào)節(jié)α-sma及ECM蛋白如膠原纖維的表達[19]。為明確IS是否通過調(diào)控TGF-β信號通路參與MI后心肌纖維化過程，本研究對各組小鼠心肌組織行Western blot檢測，結(jié)果顯示，與MI組相比，MI+IS組小鼠心肌組織中TGF-β、p-Smad2、p-Smad3表達水平均顯著升高，但Sham組和Sham+IS組間無顯著性差異，表明IS促進MI后心肌TGF-β信號通路的持續(xù)激活。SUN等[21]和CAI等[22]的研究也表明，在近端腎小管細胞中，IS可誘導(dǎo)TGF-β信號通路的激活，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，IS可通過激活MI后小鼠心肌組織TGF-β信號通路，促進MI后小鼠心肌纖維化進程，加速小鼠的病理性心肌重構(gòu)。本研究為降低CKD患者MI后的高病死率提供了新思路，為提高CKD患者的長期生存率提供了實驗數(shù)據(jù)支持。

倫理批準和動物權(quán)利聲明：本研究涉及的動物實驗均已通過青島大學(xué)實驗動物福利倫理委員會審核批準（文件號20230330C57562023-0730006）。所有實驗均遵照《實驗動物管理條例》規(guī)定進行。

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