甘藍型油菜BnWSD家族基因鑒定及其在干旱脅迫下的表達特征

摘要：干旱脅迫能誘導作物蠟酯合成酶/二酰甘油酰基轉移酶基因WSD（wax synthase/diacylglycerol acyltransferase）的表達。為明確甘藍型油菜BnWSD家族基因的理化性質及其對干旱脅迫的響應特征，本研究基于甘藍型油菜轉錄組數據庫，利用生物信息學方法從甘藍型油菜基因組中篩選BnWSD家族基因并對其結構、染色體定位、系統(tǒng)進化樹及其編碼蛋白質的理化性質、結構、保守基序、順式作用元件等進行分析，并以隴油10號為試驗材料，通過干旱脅迫處理明確BnWSD家族基因成員的表達特性。結果表明，甘藍型油菜基因組中共鑒定到36個BnWSD家族基因，可分為3個亞家族，其編碼蛋白質的氨基酸數量為105～538個，等電點為6.32～9.63；36個BnWSD家族基因共有8個保守基序，每個基因含有2～8個保守基序，motif 2是該家族共有的功能基序，在進化上較為保守；甘藍型油菜BnWSD基因啟動子區(qū)域存在11個與光響應、激素應答、干旱脅迫應答等相關的順式作用元件。甘藍型油菜不同器官中BnWSD基因的相對表達量存在差異，葉和莖中相對表達量較高，而根和花中的相對表達量較低或不表達。隨著干旱程度加深，甘藍型油菜葉片中BnWSD1-1、BnWSD2、BnWSD8、BnWSD9、BnWSD12、BnWSD18-1、BnWSD20-1、BnWSD24-1等基因的相對表達量呈增加趨勢。綜上，BnWSD基因與甘藍型油菜抗旱性能密切相關，本研究結果為進一步解析甘藍型油菜抗旱機制、明確BnWSD基因家族在表皮蠟質累積中的作用及甘藍型油菜抗旱性品種選育提供了依據。

關鍵詞：甘藍型油菜；WSD基因家族；鑒定；干旱脅迫

中圖分類號：S634.301文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2024）07-1170-12Identification of BnWSD family genes in Brassica napus L. and their expression characteristics under drought stressWAN Junbin WANG Wangtian SUN Wancang MA Li WU Junyan LIU Lijun PU Yuanyuan ZHANG Yan LI Zhizhong ZHOU Rong

（1.College of Life Science and Technology of Gansu Agricultural University/Key Laboratory of Arid Habitat Crop Science of Gansu Province， Lanzhou 730070， China;2.Gansu Rape Engineering Technology Research Center， Lanzhou 730070， China）

Abstract：Drought stress can induce the expression of crop wax synthase/diacylglycerol acyltransferase （WSD） gene. In order to clarify the physical and chemical properties of BnWSD family genes in Brassica napus and their response characteristics to drought stress， this study used bioinformatics methods to screen BnWSD family genes from the B. napus genome and analyzed their structure， chromosome location， phylogenetic tree and the physical and chemical properties， structure， conserved motifs and cis-acting elements of their encoding proteins， based on the B. napus transcriptome database. The expression characteristics of BnWSD family genes were determined by drought stress treatment with Longyou 10 as the experimental material. The results showed that a total of 36 BnWSD family genes were identified in the genome of B.napus， of which could be divided into three subfamilies. The number of amino acids of encoded proteins of 36 BnWSD family genes ranged from 105 to 538， and the isoelectric point ranged from 6.32 to 9.63. There were eight conserved motifs in 36 BnWSD family genes， and each gene contained two to eight conserved motifs， and motif 2 was a common functional motif in the BnWSD family genes， which was relatively conserved in evolution. There were 11 cis-acting elements related to light response， hormone response and drought stress response in the promoter region of BnWSD gene in B. napus. The relative expression levels of BnWSD gene in different organs of B.napus were different. The relative expression levels in leaves and stems were relatively higher， while the relative expression levels in roots and flowers were relatively lower or not expressed. With the deepening of drought， the relative expression levels of BnWSD1-1， BnWSD2， BnWSD8， BnWSD9， BnWSD12， BnWSD18-1， BnWSD20-1 and BnWSD24-1 in leaves of B.napus showed an increasing trend. In summary， the BnWSD gene was closely related to the drought resistance of B.napus. The results of this study provide a basis for further analysis of the drought resistance mechanism of B.napus and clarifying the role of the BnWSD gene family in epidermal wax accumulation and the breeding of drought-resistant B.napus varieties.

Key words：Brassica napus;WSD gene family;identification;drought stress

甘藍型油菜（Brassica napus L）是十字花科蕓薹屬一年生或二年生作物。中國的油菜種植面積約6.67×10⁶ hm²，油菜籽年均總產量約1.40×10⁷ t，每年可以提供5.2×10⁶ t的優(yōu)質菜油[1-2]。菜油含有豐富的不飽和脂肪酸，油脂結構穩(wěn)定、不易被氧化，是居民生活常用的健康食用植物油之一[3-6]。由于中國人口基數大，國產食用油無法滿足居民的生活需求，每年需要進口大量食用油，因此提高中國的油料作物產業(yè)發(fā)展水平勢在必行[7]。

油菜生長的土壤適宜相對含水量約為60%[8]。不同時期的干旱脅迫都會影響油菜的生長發(fā)育，導致油菜產量和品質下降。20世紀80年代以來，全球氣候變暖給中高緯度地區(qū)的農業(yè)生產帶來了更為充足的熱量資源，但同時亦增加了中高緯度地區(qū)干旱發(fā)生的頻率和強度，給作物生長帶來了一定的氣候風險[9-10]。中國西北地區(qū)的冬油菜是中國油菜種植的重要組成部分，在氣候變暖的大背景下，該地區(qū)的冬油菜種植面積呈增加趨勢。但西北地區(qū)冬油菜生長常面臨冬寒和冬春旱的交替脅迫，因此培育抗旱性油菜新品種已成為西北地區(qū)油菜產業(yè)健康發(fā)展的重要支撐。干旱脅迫下，作物會調控特定基因表達，改變植株形態(tài)和相關生理代謝以減少水分損失[11]。表皮蠟質是覆蓋在植物表層的第一層防失水屏障，在植物適應干旱環(huán)境、減少失水方面起重要作用[12]。植物表層蠟質的積累與C16或C18脂肪酸合成、長鏈脂肪酸合成、蠟質物質形成等3個代謝過程相關。首先是乙酰輔酶A在植物表皮細胞質體中，在脂肪酸合成酶復合體（FAS）催化下，以2C的形式循環(huán)延伸形成C16或C18脂肪酸[13-14]；其次在內質網中，C16或C18脂肪酸輔酶A在脂肪酸延長酶（FAE）合成、還原、脫水等作用下，以丙二酰輔酶A為原料，以2C的形式繼續(xù)循環(huán)延伸生成蠟質合成的基礎物質長鏈脂肪酸（VLCFA）[15-18]；最后，長鏈脂肪酸經過?；€原途徑生成烷基酯，經脫羰途徑生成醛類、烷烴類、二級醇和酮類等物質，烷基脂和酮類物質形成蠟質混合物，經ABC轉運蛋白運輸，穿過質膜與細胞壁形成角質層[19-22]。在上述?；€原途徑中，初級醇經蠟質合成酶（WSD1）催化調控形成烷基酯[23]。

WSD1基因在酵母細胞中過量表達會造成擬南芥莖稈蠟酯的積累，若將WSD1基因沉默后蠟酯的含量會顯著減少[24]，這說明蠟酯的積累受到WSD1基因調控。蠟酯是表皮蠟質合成過程中最重要的成分。Jetter等[13]研究發(fā)現，擬南芥WSD基因編碼蠟酯合成酶，主要作用于?；€原途徑。鑒于目前油菜中WSD基因的功能尚未見報道，本研究以甘藍型油菜轉錄組數據庫為基礎，利用生物信息學方法篩選與鑒定甘藍型油菜BnWSD家族基因，并分析該基因家族在干旱脅迫下的表達特征，旨在揭示BnWSD家族基因的生物學功能，為油菜抗旱性育種提供新思路。

1材料與方法

1.1植物材料與處理

試驗材料為甘藍型油菜品種隴油10號，油菜種子經0.3%硝酸鉀溶液催芽處理3 h后播種于花盆中直至萌發(fā)，幼苗在溫室培養(yǎng)，室溫24 ℃，土壤相對含水量60%左右，光照時間12 h/d。待甘藍型油菜成長到盛花期使用不同含量（0%、5%、10%、15%、20%）的聚乙二醇（PEG）進行灌根處理，灌根3 d后，采集不同PEG含量處理的油菜葉片以及20%PEG處理的油菜根、莖、葉、花、葉柄等組織各0.5 g，共3個生物學重復，用液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存待用。

1.2甘藍型油菜BnWSD基因檢索及鑒定

首先在擬南芥數據庫（https：//www.arabidopsis.org）中檢索蠟質合成酶基因（WSD），基于隱馬爾科夫模型和甘藍型油菜轉錄組數據庫（https：//yanglab.hzau.edu.cn/bntir），利用BLAST軟件比對獲得甘藍型油菜WSD家族候選基因，刪除重復與冗余的序列，獲得甘藍型油菜WSD基因家族成員。

1.3甘藍型油菜BnWSD基因編碼蛋白質的理化性質及結構分析利用在線軟件ExPASy（http：//web.expasy.org/）及WOLF PSORT（http//www.genscript.com/wolf-psort.html）預測BnWSD家族基因編碼蛋白質的理化性質，包括氨基酸長度、等電點、脂肪系數、親水性與亞細胞定位。為了解BnWSD家族基因編碼蛋白質的結構及功能，使用在線軟件SOPMA（http：//www.prabi.fr/）預測蛋白質二結構，利用在線軟件SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）預測蛋白質的三級結構。

1.4甘藍型油菜BnWSD基因結構及保守基序分析

整理甘藍型油菜的基因組文件，從中單獨提取出BnWSD基因家族的序列信息，利用在線軟件MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）預測其保守結構域，然后利用TBtools軟件分析基因結構及保守基序。

1.5甘藍型油菜BnWSD基因染色體定位分析

根據甘藍型油菜轉錄組數據庫（BnTIR）中的ZS11.V2基因組文件（gff格式）中的注釋信息，利用TBtools軟件提取甘藍型油菜WSD家族基因在染色體上的位置信息，并對其進行可視化分析。

1.6甘藍型油菜BnWSD基因家族蛋白質系統(tǒng)發(fā)育樹構建在美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫中選擇模式生物擬南芥、白菜型油菜、番茄、冬瓜及本研究鑒定得到的甘藍型油菜WSD家族基因，利用MEGA7.0軟件，采用最大似然法，重復次數1 000次，構建進化樹。

1.7甘藍型油菜BnWSD家族基因啟動子順式作用元件分析利用TBtools軟件提取BnWSD家族基因編碼序列（CDS）上游2 000 bp的序列，利用Plant CARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線網站進行啟動子順式作用元件分析，利用TBtools軟件對結果進行可視化。

1.8不同干旱處理下WSD家族基因的表達分析

利用植物組織RNA快速提取試劑盒提取不同處理樣品的總RNA，利用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMIX逆轉錄試劑盒進行cDNA合成。研究中選取分布于不同染色體上的8個代表性基因進行干旱脅迫的表達量變化分析，基因特異性擴增引物（表1）采用NCBI-Primer軟件設計。以肌動蛋白編碼基因（Actin）作為內參基因，采用FasyReal qPCR PreMIX（SYBR Green）試劑盒和美國Applied Biosystems公司的Abi-vivia 7實時PCR系統(tǒng)進行實時熒光定量PCR擴增，檢測各基因循環(huán)閾值（Ct值），使用2-△△Ct方法計算基因的相對表達量，各測定3個重復。本研究中所有試劑均購自天根生化科技（北京）有限公司。

2結果與分析

2.1甘藍型油菜BnWSD家族基因的鑒定及其編碼蛋白質的理化性質及結構通過同源比對，在甘藍型油菜中共鑒定到36個WSD家族基因，按照其在染色體上的位置依次命名為BnWSD1-1～BnWSD25-2。36個WSD家族基因編碼蛋白質的理化性質如表2所示。從表2可以看出，甘藍型油菜36個WSD家族基因編碼蛋白質的氨基酸數量為105～538個，理論等電點為6.32～9.63，說明該家族基因編碼蛋白質中既有堿性蛋白質，又有酸性蛋白質，不穩(wěn)定指數為29.02～52.71，其中，19個編碼蛋白質的不穩(wěn)定指數大于40.00，屬于不穩(wěn)定蛋白質，其余為穩(wěn)定性蛋白質；脂肪系數為88.52～109.71，親水性系數為-0.311～0.429，均為兩性蛋白（親水性系數為-0.500～0.500）；亞細胞定位預測發(fā)現該家族基因大部分位于質膜和細胞質中，部分位于葉綠體和細胞核內。甘藍型油菜36個BnWSD家族基因編碼蛋白質的二級結構以α-螺旋與無規(guī)則卷曲為主，占比分別為35.11%～46.40%和29.52%～45.20%；延伸鏈與β-轉角占比相對較低，分別為15.00%～26.67%和2.06%～6.55%（表3）。36個BnWSD家族基因編碼蛋白質的三級結構（圖1）以α-螺旋與無規(guī)則卷曲為主，與二級結構預測結果一致。

2.2甘藍型油菜BnWSD家族基因染色體定位

36個甘藍型油菜BnWSD基因分布在13條染色體上，A03號染色體上分布得最多，有8個BnWSD基因，A06號、A07號、A08號、A09號、C01號染色體上均各有1個BnWSD基因，A01號、A10號、C06號、C09號染色體上各有2個BnWSD基因，A02號、C02號和C03號染色體上分別有4個、5個和6個BnWSD基因（圖2）。

2.3甘藍型油菜BnWSD家族基因結構及保守基序

甘藍型油菜BnWSD家族基因共有8個保守基序，每個基序編碼的氨基酸長度均不相同，具體如表4所示。甘藍型油菜BnWSD基因家族共分為3個亞族，每個亞族所含的主要保守基序均不相同（圖3A）。亞族Ⅰ有17個成員，其中BnWSD25-1只有Motif 2和Motif 4，BnWSD22沒有Motif 2，但有2個Motif 3，BnWSD14只有6個Motif，其他成員均含有8個Motif；亞族Ⅱ有7個成員，BnWSD5-3與BnWSD20-2只有3個Motif，而BnWSD5-2和BnWSD2分別缺失Motif 7和Motif 3，其他3個成員均含8個Motif；亞族Ⅲ有12個成員，其中，BnWSD1-2有5個Motif，BnWSD24-1有7個motif，BnWSD25-2有6個Motif，其他成員均含8個Motif。除BnWSD22基因外，其他成員均具有Motif 2，推測Motif 2是該家族共有的功能基序。甘藍型油菜BnWSD家族基因均含有外顯子結構，且外顯子數目為3～8個，80%的家族成員含有6～7個外顯子。亞族Ⅰ中BnWSD25-1、亞族Ⅱ中BnWSD5-3與BnWSD20-2，亞族Ⅲ中BnWSD1-2基因外顯子較少，其他基因均含6～7個外顯子，說明該家族基因在進化過程中較為保守（圖3B）。

2.4甘藍型油菜BnWSD家族基因系統(tǒng)發(fā)育樹

對甘藍型油菜、白菜型油菜、擬南芥、番茄和冬瓜5個物種99個WSD蛋白進行多重比對后，構建的發(fā)育進化樹如圖4所示。99個WSD蛋白可分為11個分支（Ⅰ～Ⅺ），分別含有2個、5個、3個、5個、17個、4個、7個、18個、4個、16個和18個WSD蛋白。甘藍型油菜BnWSD蛋白散亂分布于分支Ⅲ～Ⅺ。Ⅰ和Ⅱ兩個分支以冬瓜WSD蛋白為主，所以冬瓜與甘藍型油菜親緣關系較遠；在分支Ⅷ與Ⅺ中BnWSD蛋白較多，分別有6個和7個，這2個分支以白菜型油菜與番茄WSD蛋白為主，因此甘藍型油菜親緣關系上與同屬的白菜型油菜最為接近，其次為番茄。

2.5甘藍型油菜BnWSD家族基因順式作用元件

甘藍型油菜BnWSD家族基因轉錄起始位點上游的順式作用元件大致分可為3類，第1類是光響應元件，如AE-box、G-box、GT1-motif等；第2類是激素應答元件，如ABRE、CGTCA-motif、TCA-element、TGA-element、GARE-motif等；第3類是逆境應答性元件，如ARE、MBS、MRE等（圖5）。ARE、TCA-element、CGTCA-motif等元件在大部分基因上都有分布，ABRE和P-box元件在所有基因上均有分布，且在部分基因上存在多個同等元件，這些元件均與植物抗旱性相關，因此，可以認為該家族基因與植物抗旱有關。

2.6甘藍型油菜BnWSD家族基因表達分析

隨著PEG含量的升高，油菜葉片中BnWSD1-1、BnWSD2、BnWSD8、BnWSD9、BnWSD12、BnWSD18-1、BnWSD20-1、BnWSD24-1 8個代表性基因的相對表達量均呈增加的趨勢，其中，BnWSD12相對表達量增加得最為明顯（圖6a），這說明BnWSD家族基因與抗旱相關。20% PEG處理下，葉片中8個BnWSD代表性基因的相對表達量最高，莖中相對表達量其次，根和花中相對表達量較低，或者不表達。BnWSD12、BnWSD18-1、BnWSD24-1 3個基因在根中沒有表達，花中8個BnWSD代表性基因的相對表達量均不超過0.50（圖6b）。上述結果說明，BnWSD基因家族主要在葉片和莖中表達，而這些器官是作物失水的主要部位，這進一步證實該家族基因與植物失水調控有關。

3討論

干旱是當前全球最具危害性的的自然災害之一。干旱不僅抑制作物生長發(fā)育，還能降低作物抵御病蟲害的能力，導致作物的產量和品質下降[25-31]。為了適應干旱環(huán)境，作物感受到干旱信號時，會調控相關基因的表達而改變植株形態(tài)結構和相關生理過程來減少水分損失，如關閉氣孔以減少蒸騰作用，分泌表皮蠟質防止非氣孔性失水等[12]。WSD基因能調控蠟酯合酶/二酰甘油?；D移酶的合成。本研究通過生物信息學分析發(fā)現，甘藍型油菜BnWSD基因家族共36個成員，而擬南芥中僅有12個WSD基因，造成這種結果的原因是蕓薹屬植物在進化過程中進行了全基因組的三倍化，所以甘藍型油菜WSD家族基因的數量是擬南芥的3倍[26]。36個BnWSD基因分布在13條不同的染色體上，并且各染色體上WSD基因的分布并不均勻，存在較多的串聯基因，這些串聯基因在基因的復制和重組中具有重要作用[27]。亞細胞定位顯示大部分基因定位于細胞質和質膜上。編碼的36個蛋白質均為兩性蛋白，二級結構以α-螺旋與無規(guī)則卷曲為主。BnWSD家族基因的外顯子數量大多數保持一致，僅有極少數發(fā)生較大差異，這可能是該家族基因在進化過程中受到壓力，基因結構發(fā)生缺失或增加導致的。除BnWSD22基因外，其他BnWSD基因均具有Motif2，推測該基序是BnWSD家族基因保守的motif。系統(tǒng)進化樹顯示甘藍型油菜與白菜型油菜WSD基因家族成員同時分布在相同的分支上，說明2者WSD家族基因具有同源性，親緣關系較近。分析順式作用元件發(fā)現BnWSD家族基因中大部分成員都具有與抗旱性相關的元件；隨著干旱脅迫程度的增加，8個BnWSD代表性基因的相對表達量呈增加趨勢，說明該基因家族在油菜干旱脅迫調控中起重要作用。8個BnWSD代表性基因的表達量在油菜植株器官間存在較大差異，葉片和莖中相對表達量較高，根和花中相對表達量較低或無表達。BnWSD基因這種器官表達特異性在擬南芥[24]和矮牽牛[28]中亦有發(fā)現。

周彬[29]研究證實，蘋果的MdWSD蛋白具有WES-acyltranf結構域和DUF1298未知結構域。本研究中發(fā)現甘藍型油菜BnWSD編碼蛋白質亦有類似的結構域，Tomiyama等[30]研究證實該結構域所形成的空間是該類酶進行催化反應的區(qū)域。WSD是DGAT基因家族的新成員，Kalscheuer等[31]在醋酸鈣不動桿菌中克隆了WSD基因，發(fā)現該基因能催化蠟酯、合成TCA。WSD家族基因能調控蠟質合成酶和甘油二?；D移酶，在植物抗逆研究中尤為重要，值得深入分析[32]。與表皮蠟質合成過程相關的酶形成和調控一般較為復雜，Zhang等[33]分析了高粱β-酮脂酰輔酶A合成酶（KCS）的功能，但WSD基因家族的特性和功能研究相對較少，有待更廣泛的分析。

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