紅光LED照射對自然老化SKH-1小鼠皮膚的影響

[摘要]目的：探討紅光LED照射對自然老化SKH-1小鼠皮膚的影響。方法：選取20只12月齡SKH-1小鼠，隨機分為四組，使用紅光LED儀對各組小鼠以0 J/cm2、14.4 J/cm2、32.4 J/cm2和50.4 J/cm2的能量密度連續(xù)照射60 d。在第0天、第10天、第30天和第60天，通過拍攝大體照片和皮膚鏡照片記錄皮膚外觀變化，從皮膚粗糙、皮膚皺紋和皮膚緊致三個方面進行皮膚老化等級評分，檢測角質層含水量（Water content of the stratum corneum，WCSC）、經皮失水率（Transepidermal water loss，TEWL）評估皮膚屏障功能，行光學相干斷層掃描成像技術（Optical coherence tomography，OCT）檢測真皮層信號強度，通過HE染色與Masson染色比較四組小鼠的皮膚組織結構變化。結果：與0 J/cm2組相比，肉眼和皮膚鏡下均觀察到紅光照射組小鼠的皮膚更光滑緊致，且皮膚老化等級評分表明在紅光照射后小鼠皮膚粗糙、皮膚皺紋和皮膚緊致程度明顯改善。紅光照射不僅改善皮膚外觀，而且能顯著改善WCSC和TEWL。OCT結果表明紅光照射增加了真皮層厚度和真皮信號強度。皮膚組織HE染色結果表明紅光照射增加表皮厚度，維持表皮層細胞形態(tài)正常且排列緊密。Masson染色結果顯示紅光照射的小鼠真皮膠原含量顯著增多，膠原纖維排列整齊緊密。紅光LED照射組的以上指標的改善作用隨能量密度的增大而增強，尤其是50.4 J/cm2組的作用最為顯著，且改善作用持續(xù)至照光第60天。結論：紅光LED可顯著改善自然老化SKH-1小鼠皮膚外觀和皮膚屏障功能，增加表皮的厚度和真皮膠原含量，維持膠原纖維的緊密排列，為LED光源在皮膚老化的臨床應用提供了實驗依據(jù)。

[關鍵詞]LED；自然老化；SKH-1小鼠；嫩膚；皮膚屏障；膠原

[中圖分類號]R751.05 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2024）10-0001-06

Effect of Red Light-emitting LED on Skin of Intrinsically Aged SKH-1 Mice

KANG Ziwei， CHEN Qi， SHEN Shuzhan， WANG Xiuli， WANG Peiru

（ Institute of Photomedicine， Shanghai Skin Disease Hospital， Tongji University School of Medicine， Shanghai 200443， China ）

Abstract： Objective To investigate the effect of red light-emitting LED on the skin of intrinsically aged SKH-1 mice. Methods Twenty 12-month-old SKH-1 mice were selected and randomly divided into four groups， and each group was irradiated with light doses of 0 J/cm2， 14.4 J/cm2， 32.4 J/cm2 and 50.4 J/cm2 for 60 consecutive days using a red light LED instrument. On days 0， 10， 30 and 60， changes in skin appearance were recorded by taking gross photographs and dermoscopic photographs， and a skin aging rating scale was scored in terms of skin roughness， skin lines and skin firmness. Skin barrier function was measured by the water content of the stratum corneum （WCSC） and the transepidermal water loss （TEWL）. Optical coherence tomography （OCT） was performed to detect the signal intensity in the dermis， and the structural changes in the skin of the four groups of mice were compared by HE staining and Masson staining. Results Compared to the 0 J/cm2 group， smoother and firmer skin was observed both visually and dermoscopically in the red light-treated mice， and and skin aging rating scale showed a significant improvement in skin roughness， skin wrinkles and skin firmness after red light irradiation. Red light irradiation not only improved skin appearance， but also significantly improved WCSC and TEWL. OCT results showed that red light irradiation increased the dermal thickness and dermal signal intensity. HE staining of skin tissues showed that red light irradiation increased epidermal thickness and maintained normal and tightly arranged cells in the epidermal layer. The Masson staining results showed that the dermal collagen content was significantly increased and collagen fibers were neatly arranged in the dermis of mice treated with red light. The improvement of the above indicators in the red LED irradiation group was enhanced with the increase of energy density， especially the effect of 50.4 J /cm2 group was the most significant， and the improvement lasted until the 60th day of illumination. Conclusion Red LED can significantly improve the skin appearance and skin barrier function of naturally aged SKH-1 mice， increase epidermal thickness and dermal collagen content， and maintain the tight arrangement of collagen fibers， providing a new experimental basis for the clinical application of LED light source in skin aging.

Key words： LED; intrinsic aging; SKH-1 mice; skin rejuvenation; skin barrier; collagen

自然老化又稱為皮膚內源性老化，是由年齡增加引起的皮膚衰老現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為皮膚彈性降低、皺紋出現(xiàn)、皮膚松弛、干燥粗糙、色素沉著[1-2]。自然老化引起的皮膚組織結構改變表現(xiàn)為表皮細胞形態(tài)改變，真皮膠原纖維排列紊亂卷曲，細胞外基質降解繼而真皮層萎縮[3-4]。皮膚老化不僅影響組織結構，還會引起皮膚屏障功能受損，包括滲透性內穩(wěn)態(tài)受損、角質層水合作用減少等功能失衡[5-6]。

自然老化的發(fā)生非常普遍，它不僅影響皮膚外觀，還會促發(fā)多種老年性皮膚病。故干預、延緩皮膚老化對預防皮膚疾病、促進患者身心健康、提升生活質量有重要意義。目前皮膚老化的治療方法繁多，但遮光劑僅起預防作用[7]，而藥物治療周期長[8]。脂肪干細胞[9-10]、富血小板血漿[11]等新興生物治療技術也為抗皮膚老化帶來了新的發(fā)展機遇，但其安全性還需高質量的臨床研究進行檢驗。激光、強脈沖光不僅光源結構復雜、價格昂貴，且存在色素沉著、感染等風險，因此常應用于醫(yī)療機構，而在非專業(yè)環(huán)境下無法大規(guī)模推廣使用[12-13]。

發(fā)光二極管（Light-emitting diode，LED）是以非相干的方式發(fā)射窄光譜的一種光源，具有造價低、體積小和安全性高的特點[14]。紅色LED光源通過濾光片處理得到波長為600～700 nm的紅色可見光波段，可以對細胞產生溫和的光生物調節(jié)作用[15]。LED光源通常能量輸出較低，不易對皮膚組織造成損傷，具有較高的安全性，故LED是一種可以應用于家庭的光療設備[16-17]。研究表明紅色LED光照射可促進成纖維細胞增殖和遷移[18]，促進真皮中破碎的彈性纖維和變形的膠原蛋白降解，從而促進新膠原蛋白的合成[19]，使得真皮膠原纖維排列整齊緊密、密度顯著增加[20]，可改善皮膚皺紋、緊致度等皮膚外觀[21]，呈現(xiàn)出延緩皮膚衰老的保護作用。本研究通過使用紅光LED儀連續(xù)照射自然老化SKH-1無毛小鼠60 d，從小鼠皮膚的外觀改善程度、皮膚老化等級評分、皮膚屏障功能、皮膚組織結構、真皮膠原纖維的含量與排列情況等方面，探究了紅光對自然老化SKH-1小鼠皮膚的影響，為紅光LED儀在皮膚老化的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器：HE染色試劑盒（上海威奧生物科技有限公司）、馬松染色試劑（LEAGENE，DC0033）、中性樹膠（上海威奧生物科技有限公司）、無水乙醇（上海凌峰化學試劑有限公司）、二甲苯[生工生物工程（上海）股份有限公司]、奧普家用紅光儀（奧普家居股份有限公司）、異氟醚氣體麻醉裝置（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，R540）、佳能照相機（日本Canon公司，G16）、角質層含水量檢測儀（芬蘭Delfin Technologies Ltd）、經皮水丟失檢測儀（芬蘭Delfin Technologies Ltd）、皮膚鏡（國藥醫(yī)工0000000123736）、光學相干層析成像系統(tǒng)（美國新澤西州紐頓市Thorlabs公司，Ganymede-II-HR）、石蠟切片機（LEICA RM2235）、光學顯微鏡（OLMPUS CX21型）、顯微鏡照相系統(tǒng)（Nikon E200，日本）。

1.1.2 實驗動物：選用皮膚自然老化的SKH-1同齡雌性無毛小鼠20只，體重20～25 g，12月齡，購自上海市公共衛(wèi)生中心，小鼠飼養(yǎng)于清潔動物飼養(yǎng)中心，標準滅菌飼料和飲用水喂養(yǎng)。

1.2 LED光療及分組：本研究中所使用的LED光源主要由630 nm紅光燈管構成，含590 nm黃光燈管調和，光源距離SKH-1小鼠背部皮膚30～35 cm。該LED光源分為3檔調節(jié)，低、中、高三檔的功率密度分別是8 mW/cm2，18 mW/cm2，28 mW/cm2。LED紅光的照射時間多為15～60 min，治療周期為10～60 d[22-24]，在本研究中為觀察有效且安全的光照劑量以及合適的治療周期，故設定照光時間為30 min，每天1次，治療周期為60 d。小鼠隨機分為四組：0 J/cm2組（0 mW/cm2，30 min）、14.4 J/cm2組（8 mW/cm2，30 min）、32.4 J/cm2組（18 mW/cm2，30 min）、50.4 J/cm2組（28 mW/cm2，30 min）。

1.3 紅光LED儀改善SKH-1小鼠皮膚自然老化的觀察指標：分別于治療第0、10、30、60天對各組SKH-1小鼠進行以下評估。

1.3.1 鼠背皮膚外觀改善評估：SKH-1小鼠放置于麻醉臺，異氟烷氣體吸入誘導麻醉，待SKH-1小鼠進入麻醉狀態(tài)開始拍攝背部大體照片及皮膚鏡照片，觀察并記錄SKH-1小鼠背部皮膚老化程度，對粗糙度、皮膚紋路及皮膚緊致度的評分標準參照Kong SZ等[25]和Alam M等[26]進行制定，見表1。

1.3.2 皮膚屏障功能相關指標檢測：對小鼠背部皮膚進行皮膚屏障功能相關指標檢測，使用皮膚角質層含水量檢測儀、經皮水丟失檢測儀，分別于小鼠背部左右對稱處測量三組WCSC和TEWL數(shù)據(jù)，每次測量區(qū)域互不重合。

1.3.3 光學相干層析成像：對小鼠背部治療部位的皮膚進行光學相干層析成像（Optical coherence tomography，OCT）檢測，OCT成像完成后使用Image J軟件進行信號強度測量，從真皮層中隨機選擇3個大約0.05 mm×0.05 mm的目標區(qū)域分析其平均灰度水平，對比各組之間的真皮信號強度變化。

1.3.4 鼠背皮膚組織學觀察：取小鼠背部治療部位的皮膚組織，每塊皮膚組織面積約為1 cm2，放入10%福爾馬林中固定，進行石蠟包埋切片。常規(guī)HE染色：切片厚度約4μm，切片晾干后于55度烘烤2 h，常規(guī)脫蠟、水化，蘇木素染細胞核、伊紅染細胞質，脫水、透明、封片后鏡下觀察及拍照。改良Masson三色染色：石蠟切片膠原纖維被苯胺藍染成藍色，而肌纖維呈紅色，觀察各組真皮結構及膠原排列情況，每張切片隨機取3個大小相等的視野，計算每個視野的膠原容積百分比，比較各組間的膠原含量差異，并對膠原排列紊亂度進行評估[27]，評分標準見表2。

1.4 統(tǒng)計學分析：實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理，計量資料以（xˉ±s）表示，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較使用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠皮膚外觀變化：肉眼觀察四組小鼠皮膚外觀發(fā)現(xiàn)，隨著時間的推移，0 J/cm2組小鼠的老化程度不斷加重，表現(xiàn)出典型的皮膚老化表型，如粗糙脫屑、皮膚松弛、色素沉著、皺紋深且多為橫向；而紅光治療組小鼠的皮膚狀況有明顯改善，變得光滑細膩（見圖1A）。皮膚鏡檢查結果顯示，視野下對照組小鼠出現(xiàn)縱橫交錯的皺紋、皮膚干燥、黃色丘疹，而在紅光治療組小鼠僅見少量淺表皺紋（見圖1B）。以上皮膚外觀的改善在32.4 J/cm2組和50.4 J/cm2組尤為顯著，并持續(xù)至照光第60天。

2.2 皮膚老化等級評分：治療前，各組的皮膚老化等級評分比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。相較于0 J/cm2組，32.4 J/cm2組和50.4 J/cm2組小鼠的皮膚粗糙程度從照光第30天開始明顯改善，改善持續(xù)至照光第60天（見圖2A）；32.4 J/cm2組和50.4 J/cm2組小鼠的皮膚皺紋從照光第10天開始明顯改善，隨后第30天開始14.4 J/cm2組小鼠的皮膚皺紋也得到了改善，改善持續(xù)至照光第60天（見圖2B）；32.4 J/cm2組和50.4 J/cm2組小鼠的皮膚緊致度從照光第30天開始有明顯的改善效果，隨后第60天14.4 J/cm2組小鼠也觀察到皮膚緊致度的改善，改善持續(xù)至照光結束（見圖2C）。綜上，紅光治療以時間-劑量依賴性方式改善皮膚老化產生的粗糙、皺紋及松弛等表現(xiàn)。

2.3 皮膚屏障功能相關指標測定：治療前，各組皮膚屏障功能的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與0 J/cm2組相比，32.4 J/cm2組和50.4 J/cm2組小鼠的WCSC從第30天開始明顯增高并持續(xù)至照光第60天，14.4 J/cm2組小鼠的WCSC在第60天明顯升高（見圖3A）；50.4 J/cm2組小鼠的TEWL從第30天開始明顯降低并持續(xù)至照光第60天，32.4 J/cm2組小鼠的TEWL在第60天明顯降低（見圖3B），表明紅光治療可以改善皮膚屏障功能。

2.4 OCT檢測：OCT是一種可以活體監(jiān)測皮膚結構變化的新興無創(chuàng)技術，通過寬帶光源檢測組織不同深度層面的后向散射信號[28]。OCT圖像可清晰地觀察到各組小鼠皮膚的角質層、表皮層與真皮層，與0 J/cm2組小鼠相比，32.4 J/cm2和50.4 J/cm2組小鼠的真皮層明顯增厚（見圖4A）。真皮層信號強度與真皮膠原纖維含量相關，與0 J/cm2組小鼠相比，50.4 J/cm2組小鼠的真皮信號強度從照光第10天開始明顯升高并持續(xù)至照光第60天，32.4 J/cm2組小鼠的真皮信號強度從照光第30天開始明顯升高，也持續(xù)至照光第60天（見圖4B）。OCT檢測表明光照劑量為32.4 J/cm2和50.4 J/cm2的紅光治療作用于真皮層，增強真皮層膠原纖維含量。

2.5 皮膚組織學結果：小鼠皮膚組織HE染色結果顯示，對照組小鼠皮膚逐漸萎縮，表皮和真皮逐漸變薄，而中、高劑量組紅光治療的小鼠表皮層結構完整，表皮細胞排列緊密，真皮組織呈波浪狀，真皮層細胞形態(tài)正常，表明紅光治療可以改善小鼠的真表皮組織結構，見圖5。Masson染色組織學觀察結果顯示，真皮層大量束狀排列的膠原纖維被染成藍色，而肌纖維則呈紅色（見圖6A）。與0 J/cm2組相比，32.4 J/cm2組和50.4 J/cm2組的膠原容積分數(shù)（Collagen volume fraction，CVF）從照光第10天開始顯著增加并持續(xù)至照光第60天（見圖6B），表明紅光治療后真皮組織中膠原纖維含量明顯增高；32.4 J/cm2組和50.4 J/cm2組小鼠的膠原排列紊亂度從照光第30天開始顯著改善，持續(xù)至第60天，表明紅光治療后膠原蛋白排列更加緊密規(guī)則，蜷曲成團膠原纖維顯著減少（見圖6C）。

3 討論

紅光LED是一種將電能轉化為非相干光的儀器，近年來發(fā)現(xiàn)紅光具有光生物調節(jié)作用，在皮膚創(chuàng)傷愈合[29]、清除炎癥[22]、減少色素[30]等方面具有促進作用。研究發(fā)現(xiàn)紅光波長較長（625～760 nm），可以穿透皮膚表層，作用于真皮成纖維細胞，促進膠原纖維增生，有抗皮膚老化作用[31]。紅光照射是一種簡單易行且安全性高的治療手段，近年來家用紅光照射儀的出現(xiàn)讓紅光嫩膚的臨床應用更加廣泛，故對紅光LED儀治療皮膚老化的探究是非常必要的。

在本研究中，采用波長為635 nm的紅光照射SKH-1小鼠，為探索合適的紅光治療參數(shù)，設置了四個組，分別為0 J/cm2、14.4 J/cm2、32.4 J/cm2和50.4 J/cm2的光照劑量。肉眼觀察到32.4 J/cm2和50.4 J/cm2組SKH-1小鼠的皮膚老化表現(xiàn)呈現(xiàn)明顯的改善，在皮膚鏡下可以觀察到皮膚更加光滑緊致，通過皮膚老化等級評分說明小鼠的皮膚皺紋、粗糙度和緊致度均得到了不同程度的改善。皮膚屏障由皮膚“磚墻”結構構成，與皮膚健康息息相關，TEWL和WCSC是評估皮膚屏障的兩個重要指標[6]。32.4 J/cm2和50.4 J/cm2組小鼠的TEWL較紅光治療前降低，且WCSC較治療前升高，說明紅光照射治療對皮膚屏障功能有改善作用。以上實驗結果說明32.4 J/cm2和50.4 J/cm2的能量密度，60 d的治療周期對自然老化的改善是安全有效，并且不會影響皮膚屏障功能。

皮膚鏡檢測與OCT檢測作為新興的無創(chuàng)診斷技術，對于及早發(fā)現(xiàn)皮膚老化具有重要意義[32]。皮膚鏡下結果顯示，0 J/cm2組小鼠皮膚表現(xiàn)為明顯的橫向皺紋、粗糙干燥，而50.4 J/cm2組小鼠皮膚在第60天照射時僅見少量淺表皺紋。通過OCT檢測對紅光治療前后的老化皮膚進行跟蹤觀察，結果顯示對照組小鼠真皮層厚度不斷變薄，而32.4 J/cm2和50.4 J/cm2紅光治療組小鼠的真皮層厚度增加，且真皮信號強度顯著增強。通過以上兩種無創(chuàng)在體技術證實了紅光LED對皮膚老化的改善作用是十分顯著的。

皮膚老化在組織結構上主要表現(xiàn)為表皮變薄、真皮萎縮，真皮細胞數(shù)量減少、膠原纖維含量減少和排列紊亂[29，33]。各組小鼠的皮膚組織HE染色結果可知對照組小鼠的真表皮厚度減薄，角質層脫落、表皮細胞排列疏松、形態(tài)改變，而光照劑量為32.4 J/cm2和50.4 J/cm2的紅光治療可維持表皮厚度，表皮細胞排列緊密，真皮組織呈波浪狀，真皮層細胞形態(tài)正常。真皮膠原纖維起到重要的支撐作用及營養(yǎng)功能，膠原纖維的含量和排列是觀察皮膚老化的重要指標。在本研究中行Masson染色觀察膠原纖維的變化，可以觀察到對照組小鼠膠原纖維含量逐漸減少，且排列紊亂卷曲；而32.4 J/cm2組和50.4 J/cm2組小鼠，膠原纖維含量顯著增加，排列規(guī)整緊密，真皮膠原纖維空隙減小。可知紅光可以通過促進真皮膠原纖維排列整齊緊密和增加膠原纖維密度，達到改善皮膚老化的作用。

綜上，紅光LED照射可顯著改善自然老化SKH-1小鼠皮膚外觀和皮膚屏障功能，增加表皮的厚度和真皮膠原含量，維持膠原纖維的緊密排列。本研究證實了紅光LED對自然老化有顯著的改善作用，為LED光源在皮膚老化的臨床應用提供了新的實驗依據(jù)。紅光LED調控自然老化的機制還有待于進一步的深入研究。

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[收稿日期]2023-06-05

本文引用格式：康紫薇，陳琦，申抒展，等.紅光LED照射對自然老化SKH-1小鼠皮膚的影響[J].中國美容醫(yī)學，2024，33（10）：1-6.