黃柏堿調(diào)節(jié)MCP-1/CCR2信號(hào)通路對(duì)特應(yīng)性皮炎大鼠炎癥反應(yīng)的影響

[摘要]目的：探討黃柏堿對(duì)特應(yīng)性皮炎（Atopic dermatitis，AD）大鼠炎癥反應(yīng)的影響及其作用機(jī)制。方法：構(gòu)建AD大鼠模型，大鼠分為正常組、模型組、黃柏堿低劑量組、黃柏堿高劑量組、黃柏堿+巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1（Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）組；給藥結(jié)束后，各組大鼠做皮損評(píng)分，記錄搔抓次數(shù)，HE染色觀察皮膚組織病理變化，甲苯胺藍(lán)染色測(cè)定肥大細(xì)胞數(shù)，ELISA試劑盒測(cè)定皮膚組織活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）和血清免疫球蛋白（Immunoglobulins，IgE）、白介素-17（Interleukin，IL-17）、IL-6的含量，Western blot檢測(cè)皮膚組織MCP-1、CC類趨化因子受體2（CC chemokinereceptor 2，CCR2）蛋白表達(dá)。結(jié)果：與正常組相比，模型組大鼠脫毛處皮膚發(fā)生潰瘍、紅斑，表皮和棘層增厚且有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，搔抓次數(shù)、肥大細(xì)胞數(shù)、ROS、IgE、IL-17、IL-6及MCP-1、CCR2蛋白表達(dá)水平增加（P＜0.05）；與模型組相比，黃柏堿低、高劑量組皮膚組織紅斑、潰瘍情況、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，未見(jiàn)脫屑，搔抓次數(shù)、肥大細(xì)胞數(shù)、ROS、IgE、IL-17、IL-6及MCP-1、CCR2蛋白表達(dá)水平依次降低（P＜0.05）；與黃柏堿高劑量組相比，黃柏堿+MCP-1組皮膚紅斑、潰瘍和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)加重，搔抓次數(shù)、肥大細(xì)胞數(shù)、ROS、IgE、IL-17、IL-6及MCP-1、CCR2蛋白表達(dá)水平增加（P＜0.05）。結(jié)論：黃柏堿可能通過(guò)抑制MCP-1/CCR2信號(hào)通路降低AD大鼠炎癥反應(yīng)。

[關(guān)鍵詞]特應(yīng)性皮炎；炎癥反應(yīng)；黃柏堿；MCP-1/CCR2信號(hào)通路；巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1

[中圖分類號(hào)]R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2024）10-0013-05

Effect of Phellodendrine on Inflammatory Response in Rats with Atopic Dermatitis by Regulating MCP-1/CCR2 Signaling Pathway

YU Xianchao1， KOU Wang2， YANG Yang3

（ 1.Department of Beiyuan Outpatient， People's Liberation Army General Hospital， Jingbei Medical District， Beijing 100012， China; 2.Department of Pharmacy， the Sixth Medical Center of the General Hospital， Beijing 100037， China; 3.Department of Dermatology， the Sixth Medical Center of the General Hospital， Beijing 100037， China ）

Abstract： Objective To investigate the effect of Phellodendrine on inflammatory response in rats with atopic dermatitis （AD） and its mechanism. Methods AD rat model was established. The rats were separated into normal group， model group， low-dose Phellodendrine group， high-dose Phellodendrine group， Phellodendrine+macrophage chemoattractant protein-1 （MCP-1） group. After the end of administration， the rats in each group were scored for skin lesions， and the number of scratches was recorded， HE staining was applied to observe pathological changes in skin tissue， Toluidine blue staining was applied to determine the number of Mast cells， ELISA kits were applied to measure the content of reactive oxygen species （ROS） in skin tissue and serum immunoglobulin （IgE）， interleukin-17 （IL-17） and IL-6， and Western blot was applied to detect the expression of MCP-1 and CC Chemokine receptor 2 （CCR2） proteins in skin tissue. Results Compared with the normal group， the depilated skin of the model group developed ulcers， erythema， thickening of the epidermis and spinous layer， and a large number of inflammatory cell infiltration， the scratching times， the number of Mast cells， ROS， IgE， IL-17， IL-6， the protein expression levels of MCP-1 and CCR2 were increased （P＜0.05）. Compared with the model group， the erythema， ulcer and inflammatory cell infiltration of skin tissue in the low and high dose Phellodendrine groups were reduced， and no desquamation was found， the scratching times， the number of Mast cells， ROS， IgE， IL-17， IL-6， the protein expression levels of MCP-1 and CCR2 were decreased in turn （P＜0.05）. Compared with the high dose Phellodendrine group， the skin erythema， ulcer and inflammatory cell infiltration in the Phellodendrine+MCP-1 group were aggravated， the scratching times， the number of Mast cells， ROS， IgE， IL-17， IL-6， the protein expression levels of MCP-1 and CCR2 were increased （P＜0.05）. Conclusion Phellodendrine may reduce the inflammatory response in AD rats by inhibiting MCP-1/CCR2 signaling pathway.

Key words： atopic dermatitis; inflammatory response; phellodendrine; MCP-1/CCR2 signaling pathway; macrophage chemoattractant protein-1

特應(yīng)性皮炎（AD）是一種慢性非傳染性炎癥性皮膚病，特點(diǎn)是持續(xù)的皮膚瘙癢，且長(zhǎng)期復(fù)發(fā)，極大地降低了患者及其家人的生活質(zhì)量。AD的病理生理學(xué)是復(fù)雜的、多因素的，它包括遺傳疾病、表皮屏障缺陷、免疫反應(yīng)改變以及皮膚微生物平衡破壞等[1]。治療AD除了日常清潔外，局部使用皮質(zhì)類固醇是其一線治療方法，也可聯(lián)合吡美莫司和他克莫司使用，中重度AD使用紫外線光療，抗葡萄球菌抗生素是治療繼發(fā)性皮膚感染的有效藥物，但對(duì)炎癥的改善作用不一，且成本過(guò)高[2]。黃柏堿來(lái)源于蕓香科植物黃柏的樹(shù)皮和莖皮，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，黃柏堿具有多靶點(diǎn)和多途徑抑制炎癥的作用，可能是一種潛在的治療炎癥相關(guān)疾病的有效藥物[3]。研究發(fā)現(xiàn)，人巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）及其受體CC類趨化因子受體2（CCR2）在過(guò)敏性皮炎中高表達(dá)，缺乏CCR2的皮膚病小鼠的炎癥因子顯著降低[4]。黃柏堿能否通過(guò)調(diào)節(jié)MCP-1/CCR2信號(hào)改善AD炎癥反應(yīng)尚不清楚。本研究將探索黃柏堿對(duì)AD大鼠及MCP-1/CCR2信號(hào)的影響，為AD的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：8周齡SD雄性大鼠，購(gòu)自上海泰楚生物技術(shù)有限公司[SCXK（滬）-2023-0001]，動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境為清潔安靜、通風(fēng)良好的SPF級(jí)動(dòng)物房。

1.1.2 試劑、儀器：黃柏堿（純度≥98%，DH0031），購(gòu)自德思特生物；二硝基氯苯（DNCB，97-00-7），購(gòu)自西亞試劑；活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒（S0033S），購(gòu)自碧云天生物；免疫球蛋白（IgE，ml003022）、白介素-17（IL-17，ml003003）、IL-6（ml064292）ELISA試劑盒，購(gòu)自上海酶聯(lián)生物；一抗MCP-1（ab7202）、CCR2（ab223366），購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物造模、分組：造模前1 d剪去大鼠背部毛發(fā)，使用脫毛膏在此區(qū)域（2 cm×2 cm）脫毛；造模當(dāng)天，將2% DNCB溶液（丙酮∶橄欖油=1∶4）涂抹于背部皮膚（300μl）進(jìn)行首次致敏；造模第3、5、7、9、11天，于背部脫毛處涂抹DNCB進(jìn)行激發(fā)，每天1次。大鼠皮膚出現(xiàn)紅斑、水腫、出血，表皮脫落、結(jié)痂、鱗屑等癥狀時(shí)，表示AD大鼠模型構(gòu)建成功[5]。

大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、黃柏堿低劑量組、黃柏堿高劑量組、黃柏堿+MCP-1組，每組12只。除正常組外，所有大鼠構(gòu)建AD模型；正常組僅作脫毛處理，使用溶劑（丙酮：橄欖油=1∶4）進(jìn)行涂抹，操作同造模組。確認(rèn)建模成功后，將黃柏堿溶于生理鹽水，黃柏堿低、高劑量組大鼠分別皮下注射2.1 mg/kg/d、10 mg/kg/d黃柏堿-生理鹽水溶液[6]；黃柏堿+MCP-1組大鼠皮下注射10 mg/kg/d黃柏堿-生理鹽水溶液+2μg MCP-1重組蛋白；正常組和模型組皮下注射等量生理鹽水。給藥持續(xù)14 d。

1.2.2 皮損評(píng)分：給藥期結(jié)束后，參照SCORAD評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]，對(duì)各組大鼠皮膚脫屑/干燥、水腫/肥厚/苔蘚樣變、紅斑/出血、抓痕/潰瘍方面做分值評(píng)價(jià)：0分，無(wú)；1分，輕度；2分，中度；3分，重度；4分，極重度。

1.2.3 記錄搔抓次數(shù)：使用DNCB激發(fā)大鼠后，將大鼠單獨(dú)放置于安靜環(huán)境，統(tǒng)計(jì)5 min內(nèi)大鼠搔抓/舔舐身體的次數(shù)。

1.2.4 觀察脫毛處皮膚病理變化：每組取6只大鼠，吸入乙醚麻醉后，腹主動(dòng)脈取血5 ml，離心后取上層血清，分裝儲(chǔ)存待測(cè)；采集背部及右耳脫毛處皮膚，放入4%多聚甲醛中固定，制作石蠟切片；切片經(jīng)二甲苯梯度脫蠟，乙醇梯度脫水，HE染液染色，再次脫水，二甲苯透明，封片。光鏡下觀察皮膚病理形態(tài)變化。

1.2.5 測(cè)定肥大細(xì)胞數(shù)量：將1.2.4石蠟切片脫蠟至水，進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，光鏡下肥大細(xì)胞顆粒為深藍(lán)紫色，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)視野下肥大細(xì)胞的數(shù)目，取平均值。

1.2.6 測(cè)定皮膚組織ROS和血清IgE、IL-17、IL-6的含量：將每組剩余6只大鼠麻醉后處死，采集背部脫毛處皮膚組織，剪碎，加入組織裂解液，勻漿后分裝儲(chǔ)存；取一份皮膚組織勻漿液，離心后取上清，使用試劑盒檢測(cè)上清中ROS的含量；取1.2.4血清樣本，使用ELISA試劑盒按操作要求檢測(cè)IgE、IL-17、IL-6的含量

1.2.7 檢測(cè)MCP-1、CCR2蛋白表達(dá)水平：取1.2.6皮膚組織勻漿液，使用Western blot法檢測(cè)MCP-1、CCR2蛋白表達(dá)水平。定量勻漿液蛋白濃度，在SDS-PAGE凝膠中點(diǎn)樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉PVDF膜，剪切目的蛋白條帶并置于MCP-1、CCR2抗體稀釋液中過(guò)夜，常溫下使用二抗孵育目的條帶1 h，滴加200μl發(fā)光液，分析蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（xˉ±s）表示，使用GraphPad Prism 8.0.2分析，多組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠皮損評(píng)分比較：正常組大鼠皮膚粉嫩，色澤均一；模型組大鼠背部發(fā)生明顯紅斑，抓痕較多，表皮潰瘍、剝脫；黃柏堿低、高劑量組較模型組紅斑、皮膚潰瘍情況減少，未見(jiàn)脫屑；黃柏堿+MCP-1組皮損情況嚴(yán)重，與模型組類似。見(jiàn)圖1。與正常組相比，模型組大鼠皮損評(píng)分升高（P＜0.05）；與模型組相比，黃柏堿低、高劑量組皮損評(píng)分呈劑量依賴性降低（P＜0.05）；與黃柏堿高劑量組相比，黃柏堿+MCP-1組皮損評(píng)分升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠搔抓次數(shù)比較：與正常組相比，模型組大鼠搔抓次數(shù)增加（P＜0.05）；與模型組相比，黃柏堿低、高劑量組搔抓次數(shù)呈劑量依賴性減少（P＜0.05）；與黃柏堿高劑量組相比，黃柏堿+MCP-1組搔抓次數(shù)增加（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠皮膚病理形態(tài)變化：正常組皮膚組織結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯病理異常改變；模型組表皮和棘層增厚、過(guò)度角化，皮膚潰瘍且有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；黃柏堿低、高劑量組較模型組表皮和棘層增厚逐漸減輕，潰瘍和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸減少；黃柏堿+MCP-1組表皮角化，皮膚潰瘍，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖2。

2.4 各組大鼠皮膚組織肥大細(xì)胞數(shù)量比較：與正常組相比，模型組肥大細(xì)胞數(shù)量增加（P＜0.05）；與模型組相比，黃柏堿低、高劑量組肥大細(xì)胞數(shù)量呈劑量依賴性減少（P＜0.05）；與黃柏堿高劑量組相比，黃柏堿+MCP-1組肥大細(xì)胞數(shù)量增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖3、表3。

2.5 各組大鼠皮膚組織ROS和血清IgE、IL-17、IL-6的含量比較：與正常組相比，模型組皮膚組織ROS和血清IgE、IL-17、IL-6的含量升高（P＜0.05）；與模型組相比，黃柏堿低、高劑量組皮膚組織ROS和血清IgE、IL-17、IL-6的含量呈劑量依賴性下降（P＜0.05）；與黃柏堿高劑量組相比，黃柏堿+MCP-1組皮膚組織ROS和血清IgE、IL-17、IL-6的含量升高（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

2.6 各組大鼠皮膚組織MCP-1、CCR2蛋白表達(dá)水平比較：與正常組相比，模型組MCP-1、CCR2蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，黃柏堿低、高劑量組MCP-1、CCR2蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性降低（P＜0.05）；與黃柏堿高劑量組相比，黃柏堿+MCP-1組MCP-1、CCR2蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。

3 討論

AD是常見(jiàn)的慢性炎癥性皮膚病，受損的皮膚屏障可能是AD發(fā)展的第一步，這將導(dǎo)致進(jìn)一步的皮膚炎癥和過(guò)敏敏感性，免疫系統(tǒng)失調(diào)是AD的重要發(fā)病基礎(chǔ)[8]。雖然關(guān)于AD確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但是學(xué)者一致認(rèn)為，改善皮膚屏障功能障礙和免疫失調(diào)是治療AD可行的方法[9]。為了進(jìn)一步了解AD，本研究通過(guò)在脫毛處涂抹DNCB構(gòu)建AD大鼠模型。結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠背部和耳部脫毛處皮膚潰瘍、紅斑、脫屑，且抓痕較多，搔抓次數(shù)增多，HE染色顯示患處表皮和棘層增厚、過(guò)度角化，皮膚潰瘍且有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示該模型較好地還原了AD的病理狀態(tài)，模型建立成功，可以在此基礎(chǔ)上做深一層探索。黃柏堿是一種異喹啉生物堿，以黃柏堿為主要有效成分的中藥制劑已經(jīng)在我國(guó)被廣泛用于治療AD[10]。黃柏堿本身具有抑制炎癥的作用，本研究使用不同劑量的黃柏堿處理AD大鼠，顯著緩解背部和耳部脫毛處皮膚潰瘍、紅斑和脫屑，病理?yè)p傷改善，抓痕和搔抓次數(shù)減少，且治療作用隨劑量升高而增強(qiáng)，說(shuō)明黃柏堿對(duì)AD的進(jìn)展具有抑制作用，研究其作用機(jī)制意義重大。

肥大細(xì)胞為一種粒細(xì)胞，積累在與過(guò)敏、傷口愈合和惡性腫瘤相關(guān)的炎癥部位，通過(guò)誘導(dǎo)血管擴(kuò)張、促進(jìn)血管通透性、吸收炎癥細(xì)胞促進(jìn)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，并調(diào)節(jié)血管的生成和纖維化，是過(guò)敏和其他炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵引發(fā)劑和調(diào)節(jié)劑[11]。包括肥大細(xì)胞在內(nèi)的幾種免疫細(xì)胞以及它們產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子廣泛影響與屏障功能相關(guān)的基因表達(dá)，采用全身抗炎療法可以改善AD中功能失調(diào)的皮膚屏障[12]。IL-17主要存在于活化的CD4+ T細(xì)胞，IL-17的激活直接造成細(xì)胞間脂質(zhì)的異常，這關(guān)系到AD表皮屏障的損害[13]。抑制促炎因子IL-6可顯著緩解AD小鼠耳部組織腫脹及瘙癢感，改善嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)的過(guò)敏性炎癥[14]。過(guò)高的IgE與免疫缺陷疾病有關(guān)，包括AD、復(fù)發(fā)性皮膚和肺部感染等[15]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，AD成年患者往往有嚴(yán)重的皮膚癥狀，并表現(xiàn)出高的IgE水平[16]。本研究也發(fā)現(xiàn)，AD大鼠血清IgE、IL-17、IL-6的含量升高，且皮膚潰瘍，說(shuō)明過(guò)激的免疫炎癥反應(yīng)可能是皮膚屏障受損的直接因素；黃柏堿處理AD大鼠顯著降低IgE、IL-17、IL-6的含量，表現(xiàn)出了明顯的抗炎作用。此外，氧化應(yīng)激與AD的發(fā)展密切相關(guān)，且過(guò)敏性炎癥條件和氧化應(yīng)激參與特應(yīng)性疾病的進(jìn)展[17]。已有研究報(bào)道，肥大細(xì)胞與過(guò)敏原誘導(dǎo)的皮膚炎癥有關(guān)，肥大細(xì)胞缺陷小鼠皮膚炎癥減輕，而抑制ROS的表達(dá)可以阻止過(guò)敏原誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化和炎癥介質(zhì)釋放[18]。本研究亦檢測(cè)到AD大鼠創(chuàng)傷皮膚組織ROS含量升高，這與前述肥大細(xì)胞數(shù)量增加一致；黃柏堿處理AD大鼠顯著降低其ROS含量，但作用機(jī)制有待深究。

MCP-1是由單核吞噬細(xì)胞分泌的趨化因子，也是一種多克隆性炎癥介質(zhì)，能夠吸引或增強(qiáng)炎癥因子/細(xì)胞的表達(dá)，在炎癥部位的遷移和浸潤(rùn)中發(fā)揮重要作用[19]。CCR2是MCP-1的受體，在慢性皮膚病中，單核細(xì)胞及其分泌蛋白MCP-1和CCR2的異常激活，單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，并從血液轉(zhuǎn)移到炎癥部位，這個(gè)過(guò)程會(huì)導(dǎo)致病變的形成[20]。本研究中，AD大鼠病變皮膚組織MCP-1和CCR2蛋白表達(dá)水平升高，說(shuō)明MCP-1/CCR2軸激活；黃柏堿可以降低AD大鼠MCP-1、CCR2蛋白表達(dá)，黃柏堿對(duì)AD大鼠癥狀的緩解作用可能與抑制MCP-1/CCR2信號(hào)通路激活有關(guān)；使用MCP-1與黃柏堿共同處理AD大鼠，對(duì)炎癥反應(yīng)及MCP-1/CCR2軸沒(méi)有影響，提示黃柏堿對(duì)AD大鼠炎癥反應(yīng)的抑制作用與抑制MCP-1/CCR2軸激活有關(guān)。

綜上，黃柏堿可能通過(guò)抑制MCP-1/CCR2信號(hào)通路降低AD大鼠炎癥反應(yīng)。由于AD是典型的皮膚屏障功能異常皮膚疾病，黃柏堿能否在緩解癥狀的同時(shí)，通過(guò)修復(fù)皮膚屏障功能降低炎癥反應(yīng)，也是后續(xù)研究的方向。

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[收稿日期]2023-07-20

本文引用格式：于現(xiàn)朝，寇旺，楊洋.黃柏堿調(diào)節(jié)MCP-1/CCR2信號(hào)通路對(duì)特應(yīng)性皮炎大鼠炎癥反應(yīng)的影響[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2024，33（10）：13-17.