本篇報(bào)道圍繞2022年度上海市自然科學(xué)獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)項(xiàng)目“非人靈長(zhǎng)類模式動(dòng)物構(gòu)建”展開(kāi)。

該研究由中國(guó)科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心研究員孫強(qiáng)領(lǐng)銜完成。

“拔一根毫毛，吹出猴萬(wàn)個(gè)！”《西游記》小說(shuō)中的這一情節(jié)生動(dòng)地展示了什么是“克隆”。

克隆，可以通俗地被理解成“拷貝”，“像是復(fù)印出來(lái)”一個(gè)或一個(gè)個(gè)完全相同的個(gè)體、單元。

而這與“龍生九子”截然不同：克隆，跳過(guò)了兩性生殖過(guò)程，也跳過(guò)了前者可能發(fā)生的遺傳物質(zhì)的組合或

變異。

生命的繁衍，還掌握在上帝，或是神靈手中嗎？

2017年，一個(gè)世界級(jí)成果——全球首例體細(xì)胞克隆猴在中國(guó)誕生。相關(guān)論文于2018年1月25日在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊《細(xì)胞》（Cell）上在線發(fā)表。這一消息當(dāng)時(shí)就激起了整個(gè)學(xué)術(shù)圈和科研界。

此前，全球科學(xué)家經(jīng)過(guò)數(shù)十年的努力，一直未能攻克非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物體細(xì)胞克隆的難題。直到兩只體細(xì)胞克隆猴“中中”“華華”誕生。

對(duì)這一技術(shù)的攻克，意味著人類可以借助克隆猴技術(shù)，揭開(kāi)更多生命科學(xué)的奧秘，比如靈長(zhǎng)類的發(fā)育、大腦以及多種疾病相關(guān)難題。但即便到了今天，體細(xì)胞克隆猴技術(shù)依然存在瓶頸，成功率依然不高。

“我們做克隆的目標(biāo)是為了更好地構(gòu)建非人靈長(zhǎng)類模式動(dòng)物?！睂O強(qiáng)說(shuō)。

為什么需要克隆猴？

在克隆猴誕生前，猴子也被用于轉(zhuǎn)基因或藥物測(cè)試等研究。這些猴子都是由受精卵發(fā)育來(lái)的。

“但它有一個(gè)問(wèn)題，就是做出來(lái)基因型是不同的，每只猴子之間的遺傳背景也不同?！睂O強(qiáng)表示，“再舉個(gè)例子，比如說(shuō)用考試去篩選一群學(xué)生，我們要給這些學(xué)生同樣的考卷，對(duì)不對(duì)？我們篩藥也是一樣的，你這個(gè)待‘考試’的藥物好不好，你得用同樣的試卷，這樣才能減少樣本間的誤差。否則100個(gè)人參加考試，有100張不同的考卷，你怎么評(píng)價(jià)誰(shuí)的水平高，誰(shuí)的水平低？考卷就是這些‘猴子’，做考卷的就是這些藥。這些猴模型，比如說(shuō)基因編輯和轉(zhuǎn)基因的，它們的基因型不同，致病基因可能表達(dá)水平就有差異，遺傳背景也會(huì)產(chǎn)生影響，那么就把要研究的問(wèn)題復(fù)雜化了?？寺〖夹g(shù)正好可以解決這一難題，讓它們遺傳背景一致，基因型一致。這樣就能夠讓它真正變成模式動(dòng)物。所謂模式？就是用一個(gè)模子刻出來(lái)的?！?/p>

克隆猴提供了幾乎完美的模型。猴是靈長(zhǎng)類，是生命演化中最接近人的動(dòng)物。

“比如，如果我有一批A基因突變的猴子，其他所有背景都一樣，只是A基因有差異，如果跟對(duì)照相比，一個(gè)藥物能夠緩解A基因突變導(dǎo)致的癥狀，那么就可以確認(rèn)這個(gè)藥是對(duì)的?！睂O強(qiáng)說(shuō)。

除了測(cè)試藥物，威力更強(qiáng)大的是，基于這一幾乎完美的動(dòng)物模型，人們可以進(jìn)行新藥物的研發(fā)，以及探索生命科學(xué)的未知疆域。

其實(shí)，“克隆”無(wú)處不在。植物的無(wú)性繁殖，比如插條、嫁接、落葉生根等，都是“克隆”。人類也在很早就開(kāi)始嘗試克隆各種動(dòng)物。但非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，比如猴子的克隆，始終是個(gè)難題。

早在20世紀(jì)初，德國(guó)動(dòng)物學(xué)家、實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)先驅(qū)漢斯 · 斯佩曼（Hans Spemann）已經(jīng)使用胚胎分裂技術(shù)克隆出了蠑螈。

胚胎分裂技術(shù)作為早期探索階段的技術(shù)，當(dāng)然是不完美的，它的效率很低，因而沒(méi)有成為動(dòng)物克隆領(lǐng)域研究的主要方向。孫強(qiáng)表示：“你可能在二細(xì)胞期或四細(xì)胞期分離，你最多也就分離出4個(gè)細(xì)胞。假如全部都變成個(gè)體，最多也就變成4個(gè)個(gè)體。但實(shí)際上，四細(xì)胞期有時(shí)候也就出生存活一個(gè)或者兩個(gè)，所以說(shuō)目前胚胎級(jí)克隆的克隆數(shù)有限。而體細(xì)胞克隆，理論上是無(wú)限的?！?/p>

所以現(xiàn)代的動(dòng)物克隆技術(shù)的主流是“核移植”——給卵母細(xì)胞（卵細(xì)胞）換一個(gè)細(xì)胞核。同樣因?yàn)榕咛ゼ?xì)胞在數(shù)量上的局限性，其中翹楚還是體細(xì)胞的核移植。一個(gè)細(xì)胞核，對(duì)應(yīng)著克隆后代的一個(gè)小生命。

1928年，斯佩曼嘗試將蠑螈胚胎細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到卵細(xì)胞中，雖然最終沒(méi)有克隆成功，卻是“移核”的首次實(shí)踐。

1962年，英國(guó)牛津大學(xué)的科學(xué)家約翰 · 戈登（John Gurdon）將非洲爪蟾腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞核移植到蛙卵細(xì)胞里，并培養(yǎng)出蝌蚪。其實(shí)驗(yàn)成功率只有2%。

1996年，克隆羊多利誕生。277次核移植，只產(chǎn)生29個(gè)胚胎，最后有且只有多利幸運(yùn)地出生了，這個(gè)成功率比非洲爪蟾的2%還低。但多利的誕生，打破了“體細(xì)胞無(wú)法分化”的成見(jiàn)。

隨后，豬、牛、狗等動(dòng)物的體細(xì)胞核移植克隆都被實(shí)現(xiàn)。但克隆猴一直“胎死腹中”。

克隆猴不僅僅是為了克隆猴?？寺『镎Q生之初，研究團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)人蒲慕明院士和孫強(qiáng)研究員說(shuō)，制備克隆猴不是為了獵奇，更不是為了克隆人，而是為了建立非人靈長(zhǎng)類疾病動(dòng)物模型，為研究人類疾病機(jī)制和藥物研發(fā)帶來(lái)希望。

愚公“移核”與克隆猴的瓶頸

在體外人工構(gòu)建一個(gè)生命體，何其難？生命的繁衍過(guò)程太復(fù)雜了。

“挑戰(zhàn)太多了！”孫強(qiáng)說(shuō)，“不用說(shuō)培養(yǎng)一只猴子，就是從胚胎，不依賴任何母體，直接培養(yǎng)出一只老鼠，那都是非常震撼的事情，意味著（哺乳動(dòng)物）生命可以在體外培育了，那是真正的試管了?！?/p>

他表示，目前，早期胚胎的所有發(fā)育還沒(méi)完全搞清楚，子宮是怎么保證胎兒營(yíng)養(yǎng)的，器官在子宮內(nèi)是怎么分化的，什么誘導(dǎo)了器官的對(duì)稱發(fā)育……沒(méi)有回答的問(wèn)題太多了?！半x開(kāi)子宮還做不到，你怎么模擬一個(gè)子宮的環(huán)境？早產(chǎn)兒，畢竟在母體里待到250天或者更長(zhǎng)時(shí)間，接近出生，各個(gè)器官都發(fā)育完成了，但是要真正變成從一個(gè)受精卵一個(gè)細(xì)胞開(kāi)始完全培養(yǎng)、發(fā)育長(zhǎng)出來(lái)很難。如果那個(gè)能做出來(lái)，遠(yuǎn)比克隆要震撼得多！”

所以，現(xiàn)在要克隆猴，還是要“借腹”：依靠卵母細(xì)胞，以及其他沒(méi)有提供卵母細(xì)胞的雌猴“代孕”。

構(gòu)建一個(gè)重組細(xì)胞，激活，移植到代孕雌猴子宮內(nèi)，然后待產(chǎn)。

孫強(qiáng)介紹，2003年，美國(guó)匹茲堡大學(xué)的杰瑞 · 沙騰（Gerald Schatten）教授依靠美國(guó)俄勒岡靈長(zhǎng)類中心，曾經(jīng)一次性做了700多枚卵，然后移植到30多只猴子體內(nèi)，最后都沒(méi)成功，他當(dāng)時(shí)很失望。俄勒岡靈長(zhǎng)類中心的另一位教授——舒克拉特 · 米塔利波夫（Shoukhrat Mitalipov）覺(jué)得這可能是技術(shù)問(wèn)題。2007年，他接受一個(gè)雜志的采訪，說(shuō)他已經(jīng)用了1.5萬(wàn)枚卵來(lái)做這只猴子。到2010年的時(shí)候，他發(fā)了一篇論文，就是把克隆胚胎移到10只猴子體內(nèi)，但是只有1只懷孕，而且懷孕到81天，這只猴子就流產(chǎn)了。

“我們總共用了接近5年時(shí)間去解決這些問(wèn)題，前邊都是失敗，最大的失敗出現(xiàn)在2017年的8月?！薄?月的時(shí)候，我們就得到了兩只克隆猴，一只在140多天的時(shí)候生出來(lái)，活了3個(gè)小時(shí)，沒(méi)有肺呼吸，死掉了；另一只活了30個(gè)小時(shí)也死掉了。那個(gè)時(shí)候我們的失望達(dá)到了極點(diǎn)，就像買彩票，彩票中獎(jiǎng)號(hào)碼是10個(gè)，第1個(gè)號(hào)碼到第9個(gè)號(hào)碼都是對(duì)的，然后到第10個(gè)號(hào)碼突然錯(cuò)了?！?/p>

從失敗中走出來(lái)，2017年年底，他們終于成功做出了克隆猴。

孫強(qiáng)介紹：“實(shí)際上，體細(xì)胞很小。猴子的卵母細(xì)胞直徑110微米，很大，體細(xì)胞直徑大概就十幾個(gè)微米。我們沒(méi)有取核，它帶的細(xì)胞器和線粒體也很少。我們是直接把整個(gè)體細(xì)胞融合進(jìn)去了。我們檢測(cè)過(guò)，華華細(xì)胞中來(lái)自供體體細(xì)胞的線粒體接近20%，中中的大約不到3%?！?/p>

“現(xiàn)在的問(wèn)題是，克隆的效率還是很低的。猴子體細(xì)胞的表觀重建的機(jī)制，以及早期胚胎的表觀遺傳學(xué)變化還不清楚。我覺(jué)得，最主要的，也是首先要做的，是把猴子的表觀遺傳學(xué)機(jī)制解析清楚，在此基礎(chǔ)上，真正提升體細(xì)胞克隆的效率——希望能把現(xiàn)在大概3%左右的水平，提升到10%或以上。”

孫強(qiáng)說(shuō)：“在2024年年初，我們發(fā)了一篇文章，在克隆恒河猴時(shí)，我們解決了胎盤的發(fā)育問(wèn)題，通過(guò)滋養(yǎng)層細(xì)胞置換，把重構(gòu)效率從2%提升到9%左右，提升了4倍多?！?/p>

孫強(qiáng)表示，克隆不是一個(gè)自然發(fā)育的過(guò)程，要打破很多障礙。通過(guò)這個(gè)克隆過(guò)程，人們可以了解胚胎早期發(fā)育，尤其表觀遺傳學(xué)層面的生物學(xué)機(jī)制，這也是對(duì)生命的認(rèn)識(shí)。

目前，孫強(qiáng)團(tuán)隊(duì)正在用多組學(xué)和測(cè)序的方法來(lái)分析細(xì)胞基礎(chǔ)表觀的變化是什么樣的、克隆時(shí)什么樣，來(lái)觀察各種調(diào)控過(guò)程的振蕩。

科研三階段：試管猴、轉(zhuǎn)基因猴、克隆猴……

“有人跟我聯(lián)系，說(shuō)他養(yǎng)的寵物狗不行了，能不能把它克隆出來(lái)。這太簡(jiǎn)單了，國(guó)內(nèi)有公司在做。我做的是克隆猴?！睂O強(qiáng)說(shuō)。

在一次演講中，孫強(qiáng)提到他研究歷程中的三個(gè)階段：試管猴、轉(zhuǎn)基因猴、克隆猴……

他說(shuō)，在云南省的西雙版納州瀾滄江畔的一座山上，他工作了4年，一直待到2008年。

那是一個(gè)973國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目，他接手的時(shí)候，項(xiàng)目已經(jīng)執(zhí)行了一半。因?yàn)?001年轉(zhuǎn)基因猴技術(shù)體系已經(jīng)建立了，所以項(xiàng)目的目標(biāo)是希望做出轉(zhuǎn)基因猴。他是半途去的，目標(biāo)是至少要做出試管猴，如果能做出轉(zhuǎn)基因猴更好。

他記得非常清楚，2007年立春的2月4日當(dāng)天，他們就做出了中國(guó)第一只試管猴，之后又做了十幾只猴子，但是很遺憾，沒(méi)有一只是轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性的。項(xiàng)目結(jié)束以后，由于沒(méi)有資金的支持，他從山上撤回來(lái)了。

回來(lái)以后，在上海待了半年多。很幸運(yùn)，一個(gè)機(jī)會(huì)出現(xiàn)了。中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所（簡(jiǎn)稱神經(jīng)所）的蒲慕明先生找到他，讓他繼續(xù)研究猴子。

這次是蘇州太湖的西山島，上面有一個(gè)很大的猴場(chǎng)，1萬(wàn)多只猴子，他就到島上去陪猴子了。

在孫強(qiáng)的講述里，工作人員要做的一件事情是要看猴子的月經(jīng)。島上實(shí)驗(yàn)室大概有1000多只猴子，每年看猴子的月經(jīng)累計(jì)要看5萬(wàn)多次。每次猴子“超排卵”都要打針，從月經(jīng)來(lái)的第一天開(kāi)始，一般要打12天，一天打2針。

孫強(qiáng)介紹，小白鼠連續(xù)20代近交，得到近交系，即遺傳背景是一致的。小鼠的繁殖周期大概是半年，連續(xù)20代也就頂多10年時(shí)間，這件事在20世紀(jì)初就做完了。但猴子的繁殖周期、性成熟時(shí)間、傳代時(shí)間要5年，做20代就要100年，“沒(méi)人能做得成”。這就是人們?yōu)槭裁葱枰寺『铩炔黄疬@

100年。

在世界首個(gè)體細(xì)胞克隆猴成果新聞發(fā)布會(huì)的報(bào)告中，孫強(qiáng)表示，體細(xì)胞克隆總結(jié)下來(lái)有4個(gè)節(jié)點(diǎn)：構(gòu)建胚胎、激活胚胎、啟動(dòng)核基因組、著床后發(fā)育。除了最后一個(gè)節(jié)點(diǎn)無(wú)法控制，前3個(gè)節(jié)點(diǎn)都可以干預(yù)。只不過(guò)，每一個(gè)節(jié)點(diǎn)都是一座“大山”。

起初，團(tuán)隊(duì)里其他成員都是獸醫(yī)，包括取卵在內(nèi)的大部分精密實(shí)驗(yàn)操作都由孫強(qiáng)一人承擔(dān)，即使在2010年國(guó)慶假期，孫強(qiáng)在雨夜騎車出車禍、鎖骨骨折，他也忍著劇痛花十天做完原定的取卵實(shí)驗(yàn)才住院手術(shù)。絕大多數(shù)時(shí)候，大多數(shù)目標(biāo)都不值得以健康為代價(jià)的投入，但在該項(xiàng)卓絕的研究面前，孫強(qiáng)認(rèn)為他必須這么做。幸運(yùn)的是，研究生劉真在同一年加入孫強(qiáng)帶領(lǐng)的靈長(zhǎng)類研究平臺(tái)，次年（2011年）開(kāi)始島上的生活，很快成為團(tuán)隊(duì)的骨干，分擔(dān)了壓力。

劉真花了兩年練習(xí)并優(yōu)化構(gòu)建胚胎的流程，“剛開(kāi)始是在小鼠卵母細(xì)胞上練習(xí)，差不多連續(xù)三四個(gè)月每天練習(xí)8到10個(gè)小時(shí)”。后來(lái)轉(zhuǎn)到了更難的猴細(xì)胞上精進(jìn)磨練，眼睛看著顯微鏡，兩只手操作，腳也要同時(shí)操縱任務(wù)?！吧锊煌谖锢砗蛿?shù)學(xué)，既要?jiǎng)幽X，也要?jiǎng)邮?。”說(shuō)起當(dāng)時(shí)選擇生物技術(shù)作為大學(xué)專業(yè)的原因，劉真這么回答。但他當(dāng)時(shí)應(yīng)該沒(méi)想過(guò)，在未來(lái)還要?jiǎng)幽_。手腳并用地練到了2014年底，劉真的實(shí)驗(yàn)操作爐火純青，去一個(gè)核平均只要10秒，而注入核同樣用時(shí)甚短。

孫強(qiáng)主任說(shuō)：“我們的團(tuán)隊(duì)成員可以做到15秒內(nèi)實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞注入操作，只有精湛的技術(shù)才可以保證對(duì)卵母細(xì)胞損傷最小；另外體外時(shí)間越短，損傷也越小?！眲⒄娌┦坎皇菆F(tuán)隊(duì)唯一一個(gè)如此付出、如此熟練的人，后來(lái)神經(jīng)所有一支能熟練操作細(xì)胞核移植的隊(duì)伍。

體細(xì)胞克隆的研究就是這樣，大部分時(shí)間都在漫長(zhǎng)的等待和重復(fù)的實(shí)驗(yàn)中度過(guò)。重復(fù)的實(shí)驗(yàn)不僅是一種體力活。劉真說(shuō)：“其實(shí)并不是大家理解的，你每天坐在那兒苦練就行，更重要的是，要在這過(guò)程中不斷調(diào)試和尋找更好的技術(shù)方法和流程?！倍黄频膶?shí)現(xiàn)，靠的就是在每一個(gè)環(huán)節(jié)試錯(cuò)，在每個(gè)動(dòng)作細(xì)節(jié)中摳出百分之幾的改進(jìn)空間，累積而成。

為了提高激活胚胎的成功率，團(tuán)隊(duì)嘗試了多種激活條件，一開(kāi)始使用只有13%囊胚率的離子霉素+6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）。后來(lái)使用組蛋白乙?；敢种苿┨幚恚遗呗侍岣叩?6%。效仿2014年一篇文章的條件，用組蛋白3賴氨酸9三甲基化（H3K9me3）去甲基化酶（Kdm4）處理后，囊胚率升到45%。

團(tuán)隊(duì)還嘗試了不同的體細(xì)胞，因?yàn)椴煌瑏?lái)源的細(xì)胞成功率不同。最后他們發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞是最好的選擇，也正是用成纖維細(xì)胞核，克隆出了中中和華華。

孫強(qiáng)表示，他覺(jué)得克隆猴“中中”“華華”只是個(gè)新起點(diǎn)，他希望在這個(gè)基礎(chǔ)上能做更好的模式動(dòng)物?！白非笳胬?，保持好奇心。我還要感謝一下我的家人，因?yàn)檫@些年跟猴子在一起的時(shí)間，比跟他們?cè)谝黄鸬臅r(shí)間都多?！?/p>