一測多評法同時測定感冒退燒片中4種異黃酮成分

2024-10-31 00:00:00王影超廖敏陳鳳舒柯*

中國民族民間醫(yī)藥·下半月 2024年9期

【摘要】目的：建立一測多評法（QAMS）同時測定感冒退燒片中葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元的含量。方法：采用高效液相色譜法，以AgilentZorbaxSB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm）為色譜柱，柱溫30℃；流動相乙腈-0.4%磷酸，梯度洗脫，流速為1.0mL/min；檢測波長為250nm。以葛根素為內(nèi)標，計算其他3種異黃酮成分的相對校正因子，計算其含量。結(jié)果：4種異黃酮成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，各相對校正因子重復(fù)性良好，一測多評法所得結(jié)果與外標法接近，相對平均偏差＜5.0%。結(jié)論：QAMS法方法新穎，簡捷準確，節(jié)約成本，可用于感冒退燒片的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】一測多評法；感冒退燒片；葛根素；含量測定；相對校正因子

【中圖分類號】R284.2

【文獻標志碼】A【文章編號】1007-8517（2024）18-0000-00

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.18.zgmzmjyyzz202418000

Abstract：ObjectiveToestablishaquantitativeanalysisofmulti-componentsbysingle-marker（QAMS）methodforthesimultaneousdeterminationofpuerarin，3′-MethoxyPuerarin，Daidzin，DaidzeininGanmaoTuishaoTablets.MethodsHPLCwasperformedonAgilentZorbaxSB-C18column（250mm×4.6mm，5μm）at30℃；themobilephaseconsistedofacetonitrile-0.4%phosphoricacidwithgradientelutionataflowrateof1.0mL/min.thedetectionwavelengthwas250nm.Usingpuerarinastheinternalstandard，calculatetherelativecorrectionfactorsoftheotherthreeisoflavonesandcalculatetheircontent.ResultsThelinearrelationshipofthefourcomponentswasgoodintheirrespectiveranges，andtherepeatabilityoftherelativecorrectionfactorswasgood.Theresultsofmulti-componentsbysinglemarkermethodshowedgoodagreementwiththoseofexternalstandardmethod，therelativemeandeviation（RAD）waslessthan5.0%.ConclusionQAMSmethodisnovel，simpleandaccurate，andcanbeusedforthequalitycontrolofGanmaoTuishaoTablets.

Keywords：QuantitativeAnalysisofMulti-componentsbySingle-marker（QAMS）;GanmaoTuishaoTablets;Puerarin;ContentAssay;RelativeCorrectionFactor

感冒退燒片收載于衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第二冊，由板藍根、荊芥穗、拳參、葛根、柴胡等5味中藥組成，具有清熱散風(fēng)、解表的功效，用于內(nèi)熱外感風(fēng)寒引起的四肢酸懶，發(fā)燒怕冷，鼻流清涕，咳嗽咽癢的治療［1］。方中葛根［2］具有解肌退熱，生津止渴的功效，是重要藥味。據(jù)研究［3-4］，葛根藥材中含有多種化學(xué)成分，主要為多酚、黃酮、異黃酮、氨基酸、微量元素、多糖等。其中葛根素、大豆苷、大豆苷元等異黃酮類成分為其主要活性成分。在感冒退燒片有效成分研究方面，報道有采用氣相色譜法同時測定薄荷酮和胡薄荷酮的含量［5］，采用高效液相色譜法測定葛根素［6-7］、腺苷［8］的含量等。由于中藥成分復(fù)雜，僅以1～2種活性成分或指標進行質(zhì)量評價已不能滿足中藥質(zhì)量控制的要求，因此多指標質(zhì)控方法已成為評價中藥材及其制劑質(zhì)量的有效手段。在多成分同時測定的質(zhì)量控制模式中，有效成分對照品是其定量檢測的基礎(chǔ)和關(guān)鍵所在。但某些對照品存在制備難度大、性質(zhì)不穩(wěn)定、價格高昂等問題，使得多指標成分分析受到一定的限制。2006年，王智民等［7］首次提出一測多評法（quantitativeanalysisofmulti-componentsbysingle-markerQAMS），一測多評法是運用一種中藥對照品來實現(xiàn)對多個待測組分進行分析的方法，目前，已廣泛地用于中藥的質(zhì)量控制，解決了由于對照品缺乏而限制多指標質(zhì)控技術(shù)推廣的問題［9］。

本實驗采用一測多評法（QAMS），以葛根素為內(nèi)標，建立3’-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元的相對校正因子，實現(xiàn)一測多評，為測定和評價感冒退燒片的質(zhì)量提供依據(jù)。

1儀器與材料

ThermoU3000型、Agilent1260型、Waters2695型高效液相色譜儀；電子分析天平（METTLERTOLEDO，十萬分之一和百萬分之一）；KQ-500DB型數(shù)控超聲波提取儀（昆山市超聲儀器有限公司）；C18色譜柱（Agilent、Thermo、Waters）。

對照品：葛根素（中國食品藥品檢定研究院，110752-201514，含量95.5%），3’-甲氧基葛根素（青島捷士康生物科技有限公司，151217），大豆苷（青島捷士康生物科技有限公司，150515），大豆苷元（中國食品藥品檢定研究院，111502-200402）。

樣品：感冒退燒片來源于4家生產(chǎn)企業(yè)共計99批次，實驗研究期間，樣品均在有效期內(nèi)。

試劑：乙腈（TediaCompany，lnc）為色譜純；磷酸（天津市光復(fù)化工研究所）、甲醇、乙醇（天津市富宇精細化工有限公司）均為分析純，超純水。

2方法與結(jié)果

2.1溶液制備

2.1.1對照品溶液取葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元對照品適量，精密稱定，加30%乙醇制成濃度分別為0.384、0.320、0.063、0.062mg/mL的儲備液，分別精密吸取葛根素對照品儲備液3mL，3’-甲氧基葛根素對照品儲備液1mL，大豆苷對照品儲備液3mL，大豆苷元對照品儲備液1mL，置同一25mL量瓶中，用30%乙醇溶解并稀釋至刻度，制成葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元濃度分別為46.08、12.80、7.56、2.48μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2供試品溶液取感冒退燒片10片，糖衣片除去包衣，精密稱定，研細，混勻，取約0.1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇溶液25mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率500W，頻率40kHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3陰性對照溶液按感冒退燒片質(zhì)量標準規(guī)定的處方和工藝，制備缺葛根的陰性對照，再按“2.1.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.2色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗ThermoU3000型高效液相色譜儀，AgilentZorbaxSB-C18柱（250mm×4.6mm，5μm），柱溫30℃；以乙腈為流動相A，0.4%磷酸為流動相B，按表1中的規(guī)定進行梯度洗脫；流速為1.0mL/min；檢測波長為250nm；進樣量10μL。分別精密吸取各溶液適量，進樣測定，色譜圖可見4種待測成分與相鄰色譜峰均能達到有效分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按所測目標成分計均不低于10000，陰性無干擾。色譜圖見圖1。

2.3方法學(xué)考察

2.3.1線性關(guān)系分別精密吸取上述4種成分對照品儲備液各1mL、3mL、5mL、15mL、20mL，分別置100mL量瓶中，用30%乙醇稀釋至刻度，制成20倍質(zhì)量濃度差的6個對照品溶液，濃度見表2。按“2.2”項下色譜條件進樣分析。以峰面積為縱坐標（Y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，結(jié)果見表3，可見各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性

精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液適量，連續(xù)進樣6次，記錄葛根素、3-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元峰面積，RSD分別為0.16%、0.10%、0.14%、0.88%，表明儀器精密度良好。

取同一批次感冒退燒片樣品適量，按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣分析，計算葛根素、3-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元含量，RSD分別為1.6%、1.6%、1.3%、2.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

取同一份供試品溶液，于0h、6h、10h、12h、18h、24h測定，記錄葛根素、3-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元峰面積，RSD分別為0.06%、0.12%、0.31%、2.19%，表明溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3加樣回收率取已知指標成分含量的同一批感冒退燒片樣品適量（葛根素10.5570mg/g；3-甲氧基葛根素2.4395mg/g；大豆苷1.9413mg/g；大豆苷元0.4428mg/g），研細，混勻，精密稱取6份，每份50mg，置于具塞錐形瓶中，精密加入混合對照品溶液（葛根素、3-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元濃度分別為0.0263、0.00556、0.00356、0.00140mg/mL）25mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，測定，計算回收率。結(jié)果見表4。

2.4相對校正因子測定取“2.3.1”項下對照品溶液適量，測定，以葛根素為內(nèi)標，測定其他3種成分相對校正因子fsi，fsi=fs/fi=（As/Cs）/（Ai/Ci）=（As·Ci）/（Ai·Cs），式中As為內(nèi)標峰面積，Ai為其他組分峰面積，Cs內(nèi)標濃度，Ci為其他組分濃度。結(jié)果見表5?？疾觳煌V柱、儀器、流速等對相對校正因子的影響，結(jié)果均無明顯影響（RSD＜5.0%）。結(jié)果見表6。

2.5相對保留時間測定本實驗以葛根素為內(nèi)標，采用相對保留值法（待測成分與內(nèi)標保留時間之比）對其他成分色譜峰進行定位。結(jié)果見表7。

2.6一測多評法與外標法含量測定結(jié)果比較取15批感冒退燒片樣品，以擬定方法對樣品進行測定，以葛根素為S峰，其余3個成分的實際保留時間均在以S峰與相對保留時間所計算的時間范圍內(nèi)，故可通過校正因子計算出3’-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元的含量，得到結(jié)果與外標法測定結(jié)果比較，測定結(jié)果見表8。由此可知，2種方法所得結(jié)果接近，相對平均偏差＜5%，表明一測多評法可用于本實驗含量測定。

2.7樣品含量測定采用一測多評法測定4個廠家共99批次樣品，葛根4個成分全部檢出，含量測定結(jié)果以葛根素（C21H20O9）、3’-甲氧基葛根素（C22H22O10）、大豆苷（C21H20O9）、大豆苷元（C15H10O4）的總量計，結(jié)果見表9，可見各生產(chǎn)企業(yè)檢測指標質(zhì)量水平相差較大。采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件對不同企業(yè)間含量測定結(jié)果進行分析，繪制各企業(yè)含量測定值箱式圖（如圖2），可見不同生產(chǎn)企業(yè)中位數(shù)相差較大，數(shù)據(jù)離散。A企業(yè)含量測定的均值最高，且該企業(yè)批間差異較小，說明該企業(yè)不同批次的原料和生產(chǎn)工藝都較穩(wěn)定；B企業(yè)數(shù)據(jù)出現(xiàn)離散，最大值和最小值相差較大；C企業(yè)葛根含量測定的均值最低，且數(shù)據(jù)出現(xiàn)離散，出現(xiàn)最小值。D企業(yè)批間差異最大，最大值為最小值的2.4倍。

3討論

3.1內(nèi)標物及指標成分的選擇關(guān)于葛根化學(xué)成分研究概況［10-12］，葛根中主要有效成分是異黃酮類化合物以及少量的黃酮類物質(zhì)，包括葛根素、大豆苷、大豆苷元、3′-甲氧基葛根素、3′-羥基葛根素等30余種，除了主要成分異黃酮外，還有三萜類及甾體類化合物，香豆素類及葛酚苷類化合物，在葛根的有效成分中，葛根素、大豆苷、大豆苷元等成分具有防治頭痛、抗氧化、抗癌、抗炎、解熱等作用，本實驗選擇葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元4種成分為指標成分。

3.2供試品提取溶劑和提取方法的選擇本實驗考察了以甲醇、80%甲醇、60%甲醇、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇為溶劑進行供試品的制備，結(jié)果30%乙醇為提取溶劑時，4個成分的含量總量較高，故選取30%乙醇為提取溶劑。考察了采用回流和超聲方式進行提取，結(jié)果回流與超聲提取含量值相差較小，故選取便捷、易操作的超聲作為供試品的提取方法。

本研究以葛根素為內(nèi)標物，采用QAMS同時測定感冒退燒片中葛根素、3’-甲氧基葛根素、大豆苷、大豆苷元的含量，同時比較QAMS與外標法計算15批感冒退燒片中待測成分的含量，相對平均偏差均小于5%，表明該方法可用于感冒退燒片中4中異黃酮成分含量測定，可為提升感冒退燒片的質(zhì)量標準，確保該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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