文章編號：1005-5630（2024）05-0017-07 DOI：10.3969/j.issn.1005-5630.202310180118

摘要：近年來胰腺癌的高發(fā)病率與高致死率引起了人們的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)有的檢測手段成本高昂且操作復(fù)雜，難以推廣應(yīng)用至社區(qū)家庭中。而成本較低的傳統(tǒng)的免疫層析試紙條難以有效檢測血液樣本中的標(biāo)志物。為此，研究設(shè)計了一種針對腫瘤標(biāo)志物CA199的微流控?免疫層析試紙條復(fù)合結(jié)構(gòu)，借助光學(xué)顯微鏡，通過芯片實驗觀察到微流控微陣列濾紅結(jié)構(gòu)可以有效分離血液樣本中的紅細(xì)胞，并不會破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。利用透射電子顯微鏡與多功能酶標(biāo)儀分析了量子點熒光納米微球的物理特性，表明其具有良好的穩(wěn)定性與分散性。與未經(jīng)濾紅樣本的對照實驗顯示了濾紅結(jié)構(gòu)對于血液樣本中CA199熒光信號的增強作用，系統(tǒng)檢測限為4.2 U/mL。微流控?免疫層析試紙條成本低廉，操作簡單且安全穩(wěn)定，為胰腺癌的家庭化篩查提供了一種新的思路。

關(guān)鍵詞：微流控芯片；免疫層析技術(shù)；腫瘤標(biāo)志物；胰腺癌

中圖分類號：TB 39文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Home-based pancreatic adenocarcinoma test chip based on microfluidic chip and immunofluorescence chromatography

CHEN Jingwei，ZHENG Lulu

（School of Optical-Electrical and Computer Engineering，University of Shanghai for Science andTechnology，Shanghai 200093，China）

Abstract：The high incidence and mortality of pancreatic adenocarcinoma have attracted widespread attention in recent years.However，the existing detection methods are costly and complex to operate，which makes it difficult to extend their use to households in the community.On the other hand，the lower-cost traditional immunochromatographic test strips are difficult to detect the markers in blood samples effectively.A microfluidic-immunochromatographic test strip for tumor marker CA199 was designed.With the aid of the optical microscope，the microarray structure could effectively separate red blood cells in sample solution without destroying the cellular structure.The physical properties of the quantum dot fluorescent microspheres were analyzed by a transmission electron microscope and a multifunctional enzyme marker.The studyshows that the quantum dot fluorescent microspheres have good stability and dispersity.By comparison with unfiltered samples，the enhancement of microfluidic structures for CA199 fluorescent signals in samples was demonstrated.The detection limit of the system is 4.2 U/mL.The microfluidic-immunochromatographic test strips are low-cost，simple-to-operate，safe and stable.It provides a new strategy for home-based screening for pancreatic adenocarcinoma.

Keywords：microfluidicchip;immunochromatography;tumor marker;pancreatic adenocarcinoma

引言

胰腺癌作為21世紀(jì)消化道中最為常見的惡性腫瘤之一，是癌癥相關(guān)死亡的三大原因之一[1]。在中國，胰腺癌發(fā)病率位居惡性腫瘤前十。根據(jù)《柳葉刀》雜志相關(guān)報道，胰腺癌確診后五年內(nèi)的生存率約為十分之一[2]。為此，開展大面積的人口篩查與防治工作便尤為重要。

迄今為止，常見的胰腺癌檢測方法如超聲、電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）與磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）在臨床診斷上表現(xiàn)出良好的準(zhǔn)確性[3]，但受高昂的檢測費用以及復(fù)雜繁瑣的檢驗流程限制難以推廣至社區(qū)家庭。此外，由于需專業(yè)人員操控設(shè)備與分析結(jié)果，患者往往不能在第一時間拿到檢測結(jié)果，在篩查進(jìn)程中占用很大的時間成本。

CA199作為一種與胰腺癌密切相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物[4]，對胰腺癌敏感性最高。其存在于胰、胃、肺等組織結(jié)構(gòu)中[5]。在外周血液中，CA199濃度在37 U/mL以下浮動變化。另一方面，CA199在胰腺癌的診斷上有較高的特異性，在鑒別良性與惡性病變方面表現(xiàn)良好[6]。

免疫層析試紙條可利用免疫學(xué)原理，通過免疫學(xué)方法檢測和鑒定樣本中的目標(biāo)標(biāo)志物[7]。其較低的檢測成本與快速便攜的特點，使得面向家庭的篩查成為可能。此外，借助量子點熒光納米微球作為熒光探針標(biāo)記腫瘤標(biāo)志物，可以使得免疫層析試紙條的結(jié)果檢測將不再依賴于大型且專業(yè)的檢測設(shè)備[8]。

然而，由于免疫層析試紙條容易受到復(fù)雜的體液樣本基質(zhì)干擾，尤其是全血樣本中的紅細(xì)胞會將紙基材料染成紅色，強烈的可見干擾致使檢測結(jié)果存在較大的誤差[9]。此外，血液中的黃疸、溶血酶等物質(zhì)會產(chǎn)生自發(fā)熒光[10]，降低傳感信號質(zhì)量，嚴(yán)重影響檢測靈敏度。因此對于全血檢測，有必要在液體到達(dá)免疫層析試紙條中的檢測區(qū)域之前從全血樣本基質(zhì)中去除紅細(xì)胞。從全血中分離血漿的傳統(tǒng)方法，如離心、電滲流、介電泳和磁相互作用等[11]，只能在配備精密儀器與專業(yè)人員的實驗室進(jìn)行，無法滿足全血即時檢測的需求。

微流控芯片又被稱為微全分析系統(tǒng)，可以將生物、化學(xué)等實驗集成在芯片上實現(xiàn)微流體操縱[12-13]。由于其設(shè)計靈活且結(jié)構(gòu)精細(xì)，在細(xì)胞分選、化學(xué)分析與檢測領(lǐng)域微流控芯片有極大的發(fā)揮空間。因此，基于微流控芯片設(shè)計的微陣列過濾結(jié)構(gòu)[14-16]，不僅可以物理隔離樣本中的紅細(xì)胞，且不影響紅細(xì)胞狀態(tài)，從而避免了溶血的發(fā)生。

本研究設(shè)計了一種新型的微流控微陣列濾紅結(jié)構(gòu)用于濾除血液樣本中的紅細(xì)胞，并與免疫層析試紙條相結(jié)合，可有效識別量子點熒光納米微球標(biāo)記的CA199檢測抗體。表征驗證了量子點熒光納米微球的穩(wěn)定性與特異性，并進(jìn)一步分析了微流控微陣列濾紅結(jié)構(gòu)在實際檢測中的應(yīng)用效果，為胰腺癌的家庭化篩查提供了一種全新的策略。

1實驗部分

1.1試劑和儀器

實驗中所用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購于中國北京索萊寶公司。三甲基氯硅烷、N?羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽（磺基-NHS）與1?乙基?3?（3?二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（1?ethyl?3?（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide，EDC）購置于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。磷酸鹽緩沖溶液（peptonebuffered sbolution，PBS）購于武漢賽維爾生物科技有限公司。量子點熒光納米微球?625由珈源量子點提供。樣品墊與結(jié)合墊購于上海杰一生物技術(shù)有限公司，吸水墊與PVC底板由南京微測生物科技有限公司提供，硝酸纖維素膜購于上海賽多利斯公司。

實驗中所用的主要儀器有蘇斯MJB4光刻機（德國），Millipore超純系統(tǒng)（德國），Beckman Coulter高速冷凍離心機（美國），超聲波儀器（中國），Tecan Spark多功能酶標(biāo)儀（瑞士）。

1.2微流控芯片制備

微流控芯片設(shè)計基于AutoCAD軟件完成。硅片經(jīng)前烘后，使用光刻機進(jìn)行曝光。曝光后經(jīng)后烘、顯影流程完成對硅片圖案化處理。使用三甲基氯硅烷對硅片表面進(jìn)行修飾，將聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）預(yù)聚物溶液灌注至硅片表面，置于真空箱內(nèi)充分排出預(yù)聚物中氣泡，后轉(zhuǎn)移至烘干箱中完成固化定型。剝離并切割所需PDMS芯片，將切割好的芯片結(jié)構(gòu)置于異丙醇溶液中浸泡去除殘留的三甲基氯硅烷，隨后使用去離子水進(jìn)行超聲清洗。使用直徑4.5 mm的圓沖預(yù)先打孔，使用等離子清洗機完成微流控芯片與玻璃基板的鍵合。

1.3量子點熒光納米微球標(biāo)記CA199檢測抗體

將10μL量子點熒光納米微球分散至MES溶液中，離心后分離上層清液，重新加入MES溶液并進(jìn)行超聲分散。分別配制10 mg/mL的EDC溶液與NHS溶液，加入上述溶液中，充分混合后離心。離心結(jié)束后分離上層清液并加入1 mL抗體稀釋液，與CA199檢測抗體溶液混合后孵育1.5 h。孵育完成加入20%（質(zhì)量體積比）BSA溶液封閉，再次離心后分離量子點熒光納米微球，并復(fù)溶于含有10%（質(zhì)量體積比）蔗糖、5%海藻糖與1%BSA的混合液中，置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4微流控?免疫層析試紙條制備

免疫層析試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊、硝酸纖維素膜與PVC底板構(gòu)成。首先將硝酸纖維素膜粘貼在PVC底板上，一端粘貼吸水墊，對應(yīng)一端粘貼樣品墊與結(jié)合墊。預(yù)先配制好含有0.1%蔗糖的PBS緩沖液稀釋的山羊抗小鼠IgG溶液，使用滑膜噴金標(biāo)機將上述溶液均勻預(yù)置在硝酸纖維素膜上形成C線，以同樣過程處理CA199捕獲抗體溶液形成T線。后置于37℃干燥箱中干燥后裁切為寬度均勻的免疫層析試紙條以備使用。將上述免疫層析試紙條插入微流控芯片所預(yù)先裁切留下的插槽中，對齊使樣品墊與微流控芯片出液口緊密接觸。

1.5交叉反應(yīng)驗證

使用同批次免疫層析試紙條分別檢測同水平下CA199，前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA），甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP），糖鏈抗原153（CA153），白細(xì)胞介素?8（interleukin?8，IL?8）與白細(xì)胞介素?10（interleukin?10，IL?10），在365 nm激發(fā)光下記錄檢測結(jié)果并使用ImageJ軟件完成灰度值分析。

1.6紅細(xì)胞過濾效果檢驗

將稀釋后的老鼠外周血液樣本100μL從入液口加入微流控芯片中，靜置5 min，通過光學(xué)顯微鏡觀察各區(qū)域紅細(xì)胞密度并分析與所通過條形障礙陣列的數(shù)學(xué)關(guān)系。

1.7微流控芯片對照實驗

預(yù)先將微流控結(jié)構(gòu)與免疫層析試紙條相結(jié)合，并另取等量免疫層析試紙條作為對照組。按照0，1 U/mL，2 U/mL，4 U/mL，8 U/mL濃度梯度使用10倍稀釋的血液樣本稀釋CA199抗原。取配制好的上述溶液按照梯度等量滴入對照組中免疫層析試紙條的樣品墊上，靜置10 min后，在波長365 nm激發(fā)光下記錄熒光信號強度。重復(fù)上述步驟，將溶液按梯度滴入微流控-免疫層析試紙條的芯片入液口，10 min后記錄數(shù)據(jù)。使用ImageJ軟件完成灰度值分析。

2結(jié)果與討論

2.1表征分析

使用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察量子點熒光納米微球。由圖1可以看出，納米微球由多種量子點納米材料所構(gòu)成，微球的粒徑范圍約為100～200 nm。納米微球在波長365 nm的激發(fā)光下，可產(chǎn)生波長625 nm的發(fā)射光（圖2）。為此，量子點熒光納米微球可在紫外光激發(fā)下，觀察到較為明顯的紅光。

此外，標(biāo)記后的納米微球分散性質(zhì)良好，且24 h后無明顯的顏色或沉淀變化（圖3（a）），說明該納米微球懸浮液有較好的膠體穩(wěn)定性。在多批次的量子點熒光納米微球熒光信號檢測中，其檢測信號發(fā)光效果穩(wěn)定（圖3（b））。多方面證明量子點熒光納米微球可在紫外光下裸眼觀察熒光效果，其穩(wěn)定性良好，可用于免疫層析試紙條的制備。

2.2交叉反應(yīng)

對于除CA199外不同抗原的結(jié)合位點，CA199捕獲抗體與檢測抗體表現(xiàn)出良好的特異性結(jié)合效果。如圖4所示，在同濃度下的多種標(biāo)志物溶液中，CA199免疫層析試紙條C線表現(xiàn)出差異性較大且強烈的熒光檢測信號，其余樣本溶液中檢測信號遠(yuǎn)低于目標(biāo)標(biāo)志物。結(jié)果表明量子點熒光納米微球標(biāo)記的CA199檢測抗體不存在明顯的交叉反應(yīng)，可應(yīng)用于免疫層析試紙條的檢測。

2.3微流控微陣列濾紅結(jié)構(gòu)設(shè)計

為防止紅細(xì)胞破裂發(fā)生溶血，致使細(xì)胞中血紅蛋白等溢出，影響抗原抗體非特異性結(jié)合與熒光信號檢測，本研究中微流控芯片采用了一種密集排列的條形陣列結(jié)構(gòu)（圖5），陣列間距隨著通道延伸由12μm不斷縮小至8.4μm，采用物理阻隔的方法去除血液樣本中的紅細(xì)胞。此外，由于陣列間距較小，縱橫比高，且微流控芯片整體結(jié)構(gòu)狹窄，毛細(xì)作用力同樣可以促進(jìn)血液樣本向前擴散，最終流至與免疫層析試紙條相連接的部分，后續(xù)由吸水墊牽引完成樣本檢測。

由圖6可以看出，隨著通道的不斷深入，條形陣列對于紅細(xì)胞的阻隔效果3cec4bc2f60fe060b5afa498c0835631越發(fā)明顯，且未觀察到破損的紅細(xì)胞。經(jīng)過五道陣列后，紅細(xì)胞基本上已完全去除（圖7），不再觀察到高密度的紅細(xì)胞。微流控微陣列濾紅結(jié)構(gòu)可以在5 min內(nèi)完成100μL樣本過濾且不影響后續(xù)的免疫層析試紙條工作，可以滿足過濾紅細(xì)胞的實驗需求。

2.4微流控芯片?免疫層析試紙條

如圖8和圖9所示，檢測樣本首先經(jīng)微流控芯片入液口進(jìn)入微流控通道，在毛細(xì)力與壓力作用下，樣本通過微陣列區(qū)域，紅細(xì)胞由于體積較大難以通過微流控濾紅結(jié)構(gòu)。在濾除絕大部分紅細(xì)胞后，樣本繼續(xù)前進(jìn)至免疫層析試紙條樣品墊，隨后在結(jié)合墊上，量子點熒光納米微球標(biāo)記的檢測抗體與CA199發(fā)生特異性結(jié)合。層析作用下，樣本中標(biāo)記抗體與標(biāo)志物所形成的復(fù)合物被C線上預(yù)置的包被抗體所捕獲，最終形成三明治夾心結(jié)構(gòu)。在波長365 nm紫外光照射下，可用肉眼觀察到紅色熒光。若樣本中無目標(biāo)標(biāo)志物，則C線無明顯熒光信號。樣本中剩余的量子點熒光納米微球標(biāo)記的檢測抗體繼續(xù)前進(jìn)至T線與山羊抗小鼠IgG相結(jié)合，最終可以在T線上觀察到紅色熒光。陽性樣本在紫外光照射下最終可在免疫層析試紙條上觀察到兩條明顯的紅色熒光條帶，而陰性樣本僅可觀察到一條熒光條帶。

2.5對照結(jié)果分析

在免疫層析試紙條與微流控芯片?免疫層析試紙條的對照實驗中，如圖10（a）所示，對照組中由于未增加濾紅結(jié)構(gòu)過濾樣本中的紅細(xì)胞，CA199與抗體結(jié)合效率降低，最終檢測結(jié)果熒光信號強度大幅下降。此外，受樣本中紅細(xì)胞影響，免疫層析試紙條的檢測區(qū)域背景信號較強，難以區(qū)分有效檢測信號。而經(jīng)微流控微陣列濾紅結(jié)構(gòu)過濾后的檢測樣本（圖10（b）），免疫層析試紙條產(chǎn)生了顯著且強烈的熒光檢測信號（圖11）。實驗證明了微流控芯片對于免疫層析試紙條檢測結(jié)果有顯著的增強作用。

2.6檢測限計算

參照按倍比稀釋的CA199標(biāo)志物濃度所做出的熒光檢測信號曲線，使用計算機進(jìn)行Logistic4參數(shù)擬合，擬合曲線如圖12所示。曲線相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，與檢測結(jié)果吻合良好。

檢測限又稱檢出限，指的是系統(tǒng)對所需檢測樣品所能檢測出來的最低濃度或者最小劑量，通常用零濃度下背景強度加上3倍的標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行計算。計算式為

式中：A，B，C，D為Logistic4參數(shù)擬合方程中所用參數(shù)；IBlank與σBlank分別為平均響應(yīng)以及從空白單位收集的背景強度的標(biāo)準(zhǔn)差。

通過式（1）計算得出，微流控芯片?免疫層析試紙條對于CA199的檢測限為4.2 U/mL，低于臨床檢測限37 U/mL。檢測限更低也有助于降低樣本假陽性的概率。

3結(jié)論

簡單高效地構(gòu)建了方便快捷且穩(wěn)定的微流控?免疫層析試紙條，其成本低廉，易于推廣。其中微陣列濾紅結(jié)構(gòu)對過濾外周血液樣本中的紅細(xì)胞表現(xiàn)良好，顯著降低了樣本中紅細(xì)胞的密度，且不會影響紅細(xì)胞形態(tài)，避免了溶血的發(fā)生。量子點納米熒光微球與CA199檢測抗體結(jié)合所形成的復(fù)合物，仍然保持良好的特異性與穩(wěn)定性，可準(zhǔn)確識別樣本中的目標(biāo)標(biāo)志物，檢測結(jié)果可通過肉眼在紫外光照下定性判斷。相較于未經(jīng)濾紅的血液樣本，微流控?免疫層析試紙條檢測出了顯著的熒光信號，系統(tǒng)檢測限為4.2 U/mL，低于臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，為早期篩查提供了可能。然而檢測指標(biāo)單一難以為胰腺癌的診斷提供詳細(xì)且具體的病患情況，與其他標(biāo)志物如癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）進(jìn)行聯(lián)合檢測，將是值得探索且潛力巨大的研究方向。微流控?免疫層析試紙條操作簡單且便于檢測，無需借助專業(yè)的檢測設(shè)備與工作人員，為胰腺癌普篩的家庭化進(jìn)程提供了新型解決方案。

參考文獻(xiàn)：

[1]STATHIS A，MOORE M J.Advanced pancreatic carcinoma：current treatment and future challenges[J].Nature Reviews Clinical Oncology，2010，7（3）：163–172.

[2]EOSEWICZ S，WIEDENMANN B.Pancreatic carcinoma[J].The Lancet，1997，349（9050）：485–489.

[3]GUO B C，LIAN W，LIU S，et al.Comparison of diagnostic values between CA125 combined with CA199 and ultrasound combined with CT in ovarian cancer[J].Oncology Letters，2019，17（6）：5523–5528.

[4]ZENG P J，LI H，CHEN Y L，et al.Chapter Fourteen-Serum CA199 levels are significantly increased in patients suffering from liver，lung，and other diseases[J].Progress in Molecular Biology and Translational Science，2019，162：253–264.

[5]LUO G P，JIN K Z，DENG S M，et al.Roles of CA19-9 in pancreatic cancer：biomarker，predictor andpromoter[J].Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Reviews on Cancer，2021，1875（2）：188409.

[6]O'BRIEN D P，SANDANAYAKE N S，JENKINSON C，et al.Serum CA19-9 i8wLCBaZTVbjW0Zng+cgT8Q==s significantly upregulated up to 2 years before diagnosis with pancreatic cancer：implications for early disease detection[J].Clinical Cancer Research，2015，21（3）：622–631.

[7]YANG Q H，GONG X Q，SONG T，et al.Quantum dot-based immunochromatography test strip for rapid，quantitative and sensitive detection of alpha fetoprotein[J].Biosensors and Bioelectronics，2011，30（1）：145–150.

[8]COLAK H，AYDIN A，NAZLI B，et al.Detection of presence of cow’s milk in sheep’s cheeses by immunochromatography[J].Food Control，2006，17（11）：905–908.

[9]QUASHIE N B，DE KONING H P，RANFORD-CARTWRIGHT L C.An improved and highly sensitive microfluorimetric method for assessing susceptibility of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs in vitro[J].Malaria Journal，2006，5：95.

[10]MIELCZAREK W S，OBAJE E A，BACHMANN T T，et al.Microfluidic blood plasma separation for medical diagnostics：is it worth it[J].Lab on a Chip，2016，16（18）：3441–3448.

[11]GAO X F，BORYCZKA J，KASANI S，et al.Enabling direct protein detection in a drop of whole blood with an"on-strip"plasma separation unit in a paper-based lateral flowstrip[J].Analytical Chemistry，2021，93（3）：1326–1332.

[12]HEMMIG E，TEMIZ Y，G?K?E O，et al.Transposing lateral flow immunoassays to capillary-driven microfluidics using self-coalescence modules and capillary-assembled receptor carriers[J].Analytical Chemistry，2020，92（1）：940–946.

[13]ZHANG Y，ZHU H，YING Z，et al.Design and application of metal organic framework ZIF-90-ZnO-MoS2 nanohybrid for an integrated electrochemical liquid biopsy[J].Nano Letters，2022，22（16）：6833–6840.

[14]PARK S，SHABANI R，SCHUMACHER M，et al.On-chip whole blood plasma separator based on microfiltration，sedimentation and wetting contrast[J].Microsystem Technologies，2016，22（8）：2077–2085.

[15]SON J H，LEE S H，HONG S，et al.Hemolysis-free blood plasma separation[J].Lab on a Chip，2014，14（13）：2287–2292.

[16]MARIA M S，CHANDRA T S，SEN A K.Capillary flow-driven blood plasma separation and on-chip analyte detection in microfluidic devices[J].Microfluidics and Nanofluidics，2017，21（4）：72.

（編輯：張磊）