PD-L1和CD8在HER2陽(yáng)性乳腺癌患者中的表達(dá)及其與病理參數(shù)相關(guān)性分析

[摘要]目的通過(guò)評(píng)估程序性死亡受體配體1（programmedcelldeath-ligand1，PD-L1）和分化群8（clusterofdifferentiation8，CD8）在腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)情況及其與患者臨床病理特征的相關(guān)性，明確PD-L1和CD8在判斷人表皮生長(zhǎng)因子受體2（humanepidermalgrowthfactorreceptor2，HER2）陽(yáng)性乳腺癌患者預(yù)后方面的作用。方法選取2016年10月至2018年10月山東省滕州市中心人民醫(yī)院收治的HER2陽(yáng)性乳腺癌患者65例，所有患者均為女性。癌組織切片經(jīng)免疫組織化學(xué)方法標(biāo)記PD-L1和CD8；收集患者的臨床病理資料，包括年齡、組織學(xué)分級(jí)、P53、KI-67、雌激素受體、孕激索受體、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分類（tumornodemetastasisclassification，TNM）分期在內(nèi)的7項(xiàng)與預(yù)后相關(guān)的臨床病理參數(shù)。分別分析PD-L1和CD8的表達(dá)是否和上述臨床病理參數(shù)相關(guān)。結(jié)果PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率為21.5%，PD-L1陽(yáng)性表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)和TNM分期相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.250，P=0.044；χ2=13.730，P=0.001）；CD8陽(yáng)性表達(dá)率為21.5%，CD8表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)和TNM分期相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.023，P=0.018；χ2=6.117，P=0.047）。結(jié)論P(yáng)D-L1和CD8表達(dá)與乳腺癌組織學(xué)分級(jí)和TNM分期相關(guān)，可能是HER2陽(yáng)性乳腺癌患者重要的預(yù)后標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞]程序性死亡受體配體1；分化群8；人表皮生長(zhǎng)因子受體2；乳腺癌；預(yù)后

[中圖分類號(hào)]R737.9;R730.7[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[DOI]10.3969/j.issn.1673-9701.2024.29.011

ExpressionofPD-L1andCD8inHER2positivebreastcanceranditsclinicopathologicalsignificance

ZHAOTiantian1，DUANChao1，ZHAOXuwen1，MANQirong2，WANGXiangge1

1.PathologyDepartment，TengzhouCentralPeople’sHospital，Tengzhou277500，Shandong，China;2.OncologyDepartment，TengzhouCentralPeople’sHospital，Tengzhou277500，Shandong，China

[Abstract]ObjectiveTodeterminetheroleofprogrammedcelldeath-ligand1（PD-L1）andclusterofdifferentiation8（CD8）injudgingtheprognosisofhumanepidermalgrowthfactorreceptor2（HER2）positivebreastcancerpatients，throughevaluatingtheexpressionofPD-L1andCD8inthetumormicroenvironment，andtheircorrelationwithclinicopathologicaldata.MethodsAtotalof65HER2positivebreastcancerpatientswerecollectedadmittedtoTengzhouCentralPeople’sHospitalinShandongProvincefromOctober2016toOctober2018，allofwhomwerewomen.TheparaffinslicesofcancertissuewerelabeledwithPD-L1andCD8usingimmunohistochemicalmethods.Collectclinicopathologicaldataofpatients，including7prognosticparameters，suchasage，histologicalgrade，P53，KI-67，estrogenreceptor，progesteronereceptorandtumornodemetastasisclassification（TNM）staging.StatisticalanalysiswasconductedtodeterminewhethertheexpressionofPD-L1andCD8werecorrelatedwiththeaboveclinicopathologicaldata.ResultsPD-L1positiveratewas21.5%，thepositiveexpressionofPD-L1wascorrelatedwithhistologicalgradingandTNMstaging，andthedifferenceinresultswasstatisticallysignificant（χ2=6.250，P=0.044;χ2=13.730，P=0.001）;CD8positiveratewas32.3%，theexpressionofCD8cellswascorrelatedwithhistologicalgradingandTNMstaging，andthedifferenceinresultswasstatisticallysignificant（χ2=8.023，P=0.018;χ2=6.117，P=0.047）.ConclusionPD-L1andCD8expressionarecorrelatedwithbreastcancerhistologicalgradeandTNMstage.PD-L1andCD8expressionmaybeimportantprognosticmarkersforHER2positivebreastcancerpatients.

[Keywords]Programmedcelldeath-ligand1;Clusterofdifferentiation8;Humanepidermalgrowthfactorreceptor2;Breastcancer;Prognosis

人表皮生長(zhǎng)因子受體2（humanepidermalgrowthfactorreceptor2，HER2）陽(yáng)性乳腺癌占乳腺癌患者總數(shù)的15%～20%，且HER2陽(yáng)性腫瘤惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，患者預(yù)后差。臨床研究已證實(shí)HER2陽(yáng)性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)[1]。在免疫系統(tǒng)中，T細(xì)胞通過(guò)識(shí)別外來(lái)和內(nèi)在抗原，協(xié)調(diào)有效的免疫反應(yīng)。T細(xì)胞可識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原，分化群8（clusterofdifferentiation8，CD8）表達(dá)陽(yáng)性的T細(xì)胞又稱細(xì)胞毒性T細(xì)胞，具有殺傷靶細(xì)胞的功能，在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有關(guān)程序性死亡受體（programmedcelldeath，PD）-1和程序性死亡受體配體1（programmedcelldeath-ligand1，PD-L1）研究是免疫治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)，在生理狀態(tài)下PD-1/PD-L1通路的激活可發(fā)揮負(fù)性免疫調(diào)節(jié)作用，維持機(jī)體的免疫耐受。在腫瘤微環(huán)境中，PD-L1可表達(dá)于腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞表面，PD-1在腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8陽(yáng)性T表面表達(dá)[2]。PD-L1與PD-1相結(jié)合可導(dǎo)致大量CD8陽(yáng)性T細(xì)胞耗竭，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)無(wú)法有效清除腫瘤發(fā)生腫瘤免疫逃逸[3]。乳腺癌組織中PD-L1陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、雌激素受體（estrogenreceptor，ER）/孕激索受體（progesteronereceptor，PR）陰性、HER2陽(yáng)性等預(yù)后不良的指標(biāo)相關(guān)[4-5]。在三陰型乳腺癌患者中，PD-L1和CD8的表達(dá)與患者腫瘤的臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、生存預(yù)后密切相關(guān)[6]。本研究通過(guò)評(píng)估PD-L1和CD8在腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)情況，分析其與患者臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性，以明確PD-L1和CD8在判斷HER2陽(yáng)性乳腺癌患者預(yù)后方面的作用。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

選取2016年10月至2018年10月山東省滕州市中心人民醫(yī)院收治的HER2陽(yáng)性乳腺癌患者65例，所有患者均為女性，年齡32～69歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：①患者腫瘤標(biāo)本石蠟組織學(xué)切片經(jīng)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HER2結(jié)果為（+++）或經(jīng)熒光原位雜交方法檢測(cè)HER2擴(kuò)增狀態(tài)為陽(yáng)性；②患者術(shù)后常規(guī)病理結(jié)果為乳腺非特殊型浸潤(rùn)性癌；③女性原發(fā)單側(cè)乳腺癌；④患者臨床病理資料完整，同時(shí)有明確的腫瘤臨床分期。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前曾接受過(guò)放化療；②伴有嚴(yán)重的全身性疾??；③就診時(shí)已發(fā)生癌轉(zhuǎn)移。本研究經(jīng)山東省滕州市中心人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：2024-倫理審查-35）。

1.2試劑與儀器

全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)（美國(guó)羅氏公司）；一抗CD8（兔抗人單克隆抗體，邁新生物技術(shù)有限公司）、一抗PD-L1（兔抗人單克隆抗體，瑞士羅氏公司）；OptiViewDAB二抗系統(tǒng)（美國(guó)Ventana公司）；BenchMark全自動(dòng)染色平臺(tái)（美國(guó)羅氏公司）。

1.3方法

1.3.1免疫組織化學(xué)染色腫瘤標(biāo)本采用10%中性緩沖甲醛溶液固定24h，經(jīng)脫水、透明、包埋等程序，將腫瘤標(biāo)本蠟塊做連續(xù)切片，切片厚度4μm米，裱貼在防脫載玻片上，然后將玻片置于60℃烤箱30min。將烤好的玻片放置于全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)上機(jī)染色，染色程序結(jié)束后，脫水透明封片，光學(xué)顯微鏡下觀察CD8、PD-L1的表達(dá)情況。

1.3.2PD-L1陽(yáng)性結(jié)果判定首先計(jì)算任意強(qiáng)度的部分或完全膜染色的腫瘤細(xì)胞數(shù)目與腫瘤區(qū)域內(nèi)任何強(qiáng)度染色的免疫細(xì)胞數(shù)目之和，然后計(jì)算與腫瘤細(xì)胞總數(shù)的比值，>1%即可判定為陽(yáng)性。腫瘤區(qū)域包含腫瘤細(xì)胞、腫瘤內(nèi)間質(zhì)及腫瘤周圍連續(xù)性間質(zhì)，不包含壞死區(qū)域[4]。

1.3.3CD8陽(yáng)性結(jié)果判定CD8陽(yáng)性棕褐色染色顆粒主要定位于細(xì)胞膜表面，在上述腫瘤區(qū)域內(nèi)隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），明確觀察到陽(yáng)性淋巴細(xì)胞即為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PD-L1表達(dá)與HER2陽(yáng)性乳腺癌病理參數(shù)的關(guān)系

65例HER2陽(yáng)性乳腺癌患者中有14例患者PD-L1表達(dá)呈陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率為21.5%。組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)病例中的PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)（P=0.044），見(jiàn)圖1。TNM分期Ⅲ期病例中的PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期（P=0.001），見(jiàn)圖2。PD-L1陽(yáng)性表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)和TNM分期相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2CD8表達(dá)與HER2陽(yáng)性乳腺癌臨床參數(shù)的關(guān)系

65例HER2陽(yáng)性乳腺癌患者中，21例患者CD8表達(dá)呈陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率32.3%。組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)病例中的CD8陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)（P=0.018），見(jiàn)圖3。TNM分期Ⅲ期病例中的CD8陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于Ⅰ期和Ⅱ期（P=0.047），見(jiàn)圖4。CD8陽(yáng)性表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)和TNM分期相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

3討論

中國(guó)女性乳腺癌發(fā)病率（51.17/10萬(wàn)）僅低于肺癌（58.18/10萬(wàn)）[7]。依據(jù)分子分型，乳腺癌分為4種類型：LuminalA、LuminalB、三陰性和HER2陽(yáng)性。LuminalA型和LuminalB型乳腺癌預(yù)后較好；HER2陽(yáng)性乳腺癌易復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差；三陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移速度快，癌細(xì)胞擴(kuò)散范圍廣，預(yù)后最差。乳腺癌中三陰性乳腺癌免疫原性最強(qiáng)，其次是HER2陽(yáng)性乳腺癌[8-10]。

本研究選取65例HER2陽(yáng)性乳腺癌患者，PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率為21.5%。本研究組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)病例中的PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)；TNM分期Ⅲ期病例中的PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期，由此推斷PD-L1陽(yáng)性表達(dá)與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者預(yù)后差有相關(guān)性。Mondal等[11]對(duì)50例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者的研究表明PD-L1陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤細(xì)胞分化差、ER表達(dá)陰性、HER2表達(dá)陽(yáng)性、Ki-67高表達(dá)相關(guān)。Soliman等[12]用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)6種乳腺癌細(xì)胞系中PD-L1表達(dá)，結(jié)果顯示PD-L1在基底樣癌亞型細(xì)胞系中表達(dá)最高，且預(yù)后最差。

腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞多被認(rèn)為是一種局部免疫反應(yīng)的組織學(xué)表現(xiàn)，間接反映宿主的免疫狀態(tài)和對(duì)腫瘤的抗御能力。乳腺癌中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrationlymphocyte，TILs）以相互對(duì)抗的兩方面力量為主，一方面是以抗腫瘤作用為主的CD4+Th1細(xì)胞、CD8陽(yáng)性T細(xì)胞、NK細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞等，另一方面則是促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的FOXP3+T細(xì)胞、CD4+Th2細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞等[13]。Denkert等[14]對(duì)三陰性乳腺癌患者接受新輔助化療前、后病理切片中的TILs含量比較發(fā)現(xiàn)TILs百分比高的患者總生存期更長(zhǎng)。一項(xiàng)Meta分析研究結(jié)果表明，TILs中的CD8陽(yáng)性亞群與患者無(wú)疾病生存期延長(zhǎng)呈正相關(guān)[15]。研究者對(duì)乳腺癌中分離出的6311個(gè)T細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序后發(fā)現(xiàn)乳腺癌TILs中含有大量的CD8陽(yáng)性細(xì)胞，且在早期三陰性乳腺癌患者中，CD8陽(yáng)性細(xì)胞含量越高預(yù)示患者生存越好[16]。本研究組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)病例中的CD8陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)；TNM分期Ⅲ期病例中的CD8陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于Ⅰ期和Ⅱ期，由此推測(cè)CD8陽(yáng)性T細(xì)胞是TILs抗腫瘤作用的重要細(xì)胞，且表達(dá)率越高，HER2陽(yáng)性乳腺癌患者預(yù)后越好。

也有研究結(jié)果與上述研究結(jié)果不一致。Huang等[17]的Meta分析納入47項(xiàng)研究，結(jié)果顯示表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1與高危臨床病理參數(shù)相關(guān)，患者預(yù)后不良，而當(dāng)TILs表面表達(dá)大量PD-L1時(shí)，這種類型的患者常預(yù)后較好。Schalper等[18]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌患者的組織中PD-1和PD-L1的mRNA表達(dá)量較正常組織都明顯增加，PD-L1mRNA高表達(dá)患者預(yù)后較好，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)生率較低。Bae等[19]研究發(fā)現(xiàn)PD-L1蛋白在乳腺癌中表達(dá)與更好的無(wú)病生存期和總生存期相關(guān)，但不是獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。

綜上所述，本研究證實(shí)PD-L1陽(yáng)性表達(dá)與HER2陽(yáng)性乳腺癌患者預(yù)后差相關(guān)，CD8陽(yáng)性表達(dá)則與患者預(yù)后好相關(guān)。本研究結(jié)果雖有一定意義，但樣本量較小。后續(xù)研究應(yīng)增大樣本量，進(jìn)一步證實(shí)本研究結(jié)果。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–07–03）

（修回日期：2024–10–05）