細(xì)胞外囊泡介導(dǎo)的核酸遞送及其在癌癥治療中的應(yīng)用

關(guān)鍵詞 細(xì)胞外囊泡；核酸遞送；基因治療；癌癥治療；納米流式檢測技術(shù)；評述

核酸療法（Nucleic acid therapy）是一種基于核酸分子的醫(yī)學(xué)治療方法，主要利用核酸（如DNA 和RNA 等）調(diào)節(jié)基因表達(dá)和修復(fù)遺傳缺陷，從而實現(xiàn)疾病治療[1]。核酸療法不僅在治療遺傳病、癌癥和感染性疾病等方面顯示出巨大的應(yīng)用潛力，還為疑難疾病和罕見病提供了新的治療選擇。核酸療法中的藥物包括質(zhì)粒DNA（Plasmid DNA， pDNA）、mRNA、miRNA、反義寡核苷酸（Antisense oligonucleotides，ASO）及小干擾RNA（Small interfering RNA， siRNA）等，應(yīng)用范圍包括基因編輯、基因添加和基因沉默。迄今為止，已有十余種核酸藥物獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)并上市[2]。然而，核酸類藥物在體內(nèi)發(fā)揮有效作用的過程中面臨諸多挑戰(zhàn)，包括易受血清核酸酶降解、被免疫系統(tǒng)清除、與非靶細(xì)胞發(fā)生非特異性相互作用等[2-4]。因此，開發(fā)高效的遞送載體是核酸療法在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中取得成功的關(guān)鍵。目前，遞送載體主要分為病毒載體和非病毒載體兩類。盡管包括慢病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺相關(guān)病毒在內(nèi)的病毒載體在遞送效率上具有優(yōu)勢，但病毒載體在安全性和大規(guī)模生產(chǎn)方面存在限制。相對而言，開發(fā)高效且安全的非病毒載體成為了核酸類藥物遞送研究的主要關(guān)注點。

細(xì)胞外囊泡（Extracellular vesicles， EVs）是細(xì)胞分泌到胞外的具有磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)的納米小泡[5-7]。幾乎所有細(xì)胞均能分泌EVs，根據(jù)其分泌途徑的不同， EVs 主要分為多泡體與細(xì)胞膜融合后釋放的外泌體（Exosomes， 30～150 nm）及細(xì)胞膜直接出芽形成的微囊泡（Microvesicles， MVs， 50～1000 nm）[5]。與脂質(zhì)納米顆粒（Lipid nanoparticles， LNPs）等傳統(tǒng)非病毒載體相比， EVs 作為天然的脂質(zhì)納米顆粒，展現(xiàn)出多方面優(yōu)勢。EVs 在體液中更加穩(wěn)定，不易被巨噬細(xì)胞或網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)去除，具有高生物相容性、低免疫原性，并可跨越血腦屏障，被認(rèn)為是極具應(yīng)用前景的核酸藥物遞送載體[8-10]。此外，不同細(xì)胞來源的EVs 所攜載的生物活性分子（如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等）存在顯著差異，這種差異賦予了EVs 不同的生物學(xué)功能，如靶向特定細(xì)胞、激活特定信號通路等，極大地拓展了EVs 的生物應(yīng)用范圍[11]。傳統(tǒng)的納米顆粒被內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞后，易被困于內(nèi)體，并進(jìn)一步被遞送至溶酶體進(jìn)行降解。研究表明，一部分EVs 可通過獨特的機(jī)制逃避溶酶體途徑，使裝載物在內(nèi)體中的有效釋放率達(dá)到10%～25%。相比之下，傳統(tǒng)納米顆粒通過溶酶體途徑的逃逸效率僅為1%～2%[12]，這使得EVs 在遞送效率上表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢。本文對近年來EVs 作為核酸遞送載體的研究進(jìn)行了綜述（圖1），簡要介紹了現(xiàn)有裝載方法（內(nèi)源性裝載和外源性裝載）的性能及應(yīng)用、核酸裝載質(zhì)量的評估策略等，總結(jié)了EVs 介導(dǎo)的核酸遞送在癌癥治療中的應(yīng)用，并分析了現(xiàn)存的問題和挑戰(zhàn)，最后對其未來的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

1 內(nèi)源性裝載

細(xì)胞內(nèi)部存在復(fù)雜的分選機(jī)制，在轉(zhuǎn)運內(nèi)體分選復(fù)合體（Endosomal sorting complex required for transport）及核酸結(jié)合蛋白等的作用下，可識別并分選特定的核酸分子（如mRNA、miRNA 和tRNA 等），并通過EVs 的形式釋放，在細(xì)胞之間進(jìn)行信息傳遞[13]。因此，通過調(diào)控EVs 的生物發(fā)生途徑，可以實現(xiàn)特定核酸分子的EVs內(nèi)源性裝載。

1.1 提升胞質(zhì)核酸裝載物濃度

基于EVs 的分泌途徑， EVs內(nèi)部的裝載物濃度與胞質(zhì)的內(nèi)容物濃度成正比。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，通過一定的外部刺激可以促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)特定核酸分子濃度增加，從而提高EVs內(nèi)的核酸濃度。Jiang 等[14]發(fā)現(xiàn)，低氧應(yīng)激下的心臟祖細(xì)胞會增加EVs 中miRNA-21 的含量；利用攜帶miRNA-21 的EVs處理心肌細(xì)胞，可以下調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白PDCD4 的表達(dá)水平。此外，通過母細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方式也能增強(qiáng)特定核酸的表達(dá)，從而提高EVs 的內(nèi)源性核酸負(fù)載。Sharif 等[15]利用miRNA-124 對母細(xì)胞進(jìn)行脂質(zhì)轉(zhuǎn)染，產(chǎn)生攜帶miRNA-124 的EVs，這些EVs 可用于增強(qiáng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的化療敏感性。除了直接轉(zhuǎn)染相應(yīng)的核酸，還可采用編碼治療性的pDNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。Wang 等[16]在pDNA 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞所分泌的EVs 中發(fā)現(xiàn)了由pDNA 轉(zhuǎn)錄得到的HChrR6 mRNA，這種mRNA 可以編碼一種細(xì)菌酶，可將前藥CNOB 激活為治療乳腺癌的細(xì)胞毒性藥物。Katakowski 等[17]通過pDNA 轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，獲得了負(fù)載miRNA-146b 的EVs，用于治療大鼠模型中的腦腫瘤。然而，以轉(zhuǎn)染方式獲得的EVs 通常難以控制轉(zhuǎn)染后除目的裝載物之外的其它相關(guān)產(chǎn)物負(fù)載至EVs 中。

1.2 增強(qiáng)裝載物分揀能力

EVs 生物發(fā)生及其裝載物分揀研究的不斷深入為EVs內(nèi)特定裝載物的富集研究提供了新思路。其中， RNA 因其體積小、豐度高且可與生物膜特異性結(jié)合而易被富集到EVs 中[13]。Villarroya-Beltri 等[18]發(fā)現(xiàn)， miRNA 中某些特定序列（如miR-575、miR-451、miR-125a-3p 和miR-198 等）可自主地被富集至EVs 中。這些序列可優(yōu)先結(jié)合RNA 結(jié)合蛋白（RNA binding protein， RBP）hnRNPA2B1，并伴隨hnRNPA2B1被優(yōu)先分揀至EVs 中。hnRNPA2B1 的過表達(dá)可以增加特定miRNA 在EVs 中的負(fù)載量。此外，將RBP與EVs 特征蛋白構(gòu)建融合蛋白，也可實現(xiàn)EVs內(nèi)特定RNA 的富集。Hung 等[19]將MS2 噬菌體外殼蛋白與EVs腔內(nèi)蛋白Lamp2b 融合，顯著增加了HEK293FT 細(xì)胞來源EVs內(nèi)具有MS2 外殼蛋白結(jié)合能力的mRNA 的負(fù)載量。相較于未融合MS2 外殼蛋白的EVs，改造后的EVs內(nèi)mRNA 的負(fù)載量增加了6 倍（圖2A）。同樣， Li 等[20]將EVs膜蛋白CD9 與RNA 結(jié)合蛋白HuR 融合，構(gòu)建了CD9-HuR 功能化EVs。這些功能化EVs 可高效富集特異性RNA（如富含AU 堿基的RNA），并將dCas9 mRNA 遞送至肝臟細(xì)胞，成功實現(xiàn)了對增殖和分化相關(guān)靶基因C/ebpα表達(dá)的下調(diào)。與游離dCas9 mRNA 相比，使用功能化EVs 可使目的基因的表達(dá)量降低約20 倍，極大地提升了基因編輯的效果（圖2B）。

1.3 EVs內(nèi)封裝腺相關(guān)病毒載體

EVs 作為細(xì)胞分泌的納米小泡，除了可主動裝載小分子核酸外，還可封裝多種病毒載體，有效規(guī)避體內(nèi)已有的中和抗體（Neutralizing antibodies， NAbs）的作用，從而實現(xiàn)更高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效果。腺相關(guān)病毒載體（Adeno-associated virus vector， AAV Vector）因具有安全性高、免疫原性低和表達(dá)時程長等優(yōu)勢，成為了基因治療領(lǐng)域極具應(yīng)用前景的病毒載體[21]?，F(xiàn)階段全球共有7 款基于AAV 載體的基因治療藥物獲批上市，超過200 種基于AAV 載體的基因治療候選藥物處于臨床研究階段[22]。然而， NAbs 可與游離AAV 結(jié)合，導(dǎo)致其快速清除和脫靶效應(yīng)，極大地影響了基因治療的效果[23]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自然分泌的EVs內(nèi)封裝有AAV（EV-AAV），并且該組分可通過超速離心純化富集[24]。相較于傳統(tǒng)的AAV 載體， EVAAV可更有效地穿過包括血腦屏障或視網(wǎng)膜內(nèi)界膜在內(nèi)的多種生物屏障，規(guī)避NAbs 的影響，展現(xiàn)出更佳的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。2017 年， Gy?rgy 等[24]通過EV-AAV 將外源基因遞送至小鼠的耳蝸和前庭毛細(xì)胞中。與傳統(tǒng)AAV 載體20%的轉(zhuǎn)導(dǎo)率相比， EV-AAV 在耳中目標(biāo)細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)率高達(dá)50%～65%（圖2C）。2023年，Li 等[25]使用5 種不同的體內(nèi)和體外模型系統(tǒng)，證明在NAbs 存在的情況下，與游離AAV 相比， EV-AAV載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效力和治療效果明顯提高（圖2D），該結(jié)果證明了EV-AAV 載體作為治療心力衰竭的基因遞送工具的潛力。此外，與AAV 復(fù)雜的純化方案相比， EV-AAV 的生產(chǎn)成本較低，通過超速離心沉淀法即可完成純化，無需繁瑣的密度梯度離心。

2 外源性裝載

相較于利用EVs 的生物生成途徑實現(xiàn)核酸裝載的內(nèi)源性裝載方式，外源性裝載是一種更直接且靈活的策略。外源性裝載是在分離純化得到EVs 后，通過被動孵育、膜透化或機(jī)械破壞EVs膜以及EVs 與脂質(zhì)體膜融合等策略實現(xiàn)EVs 對核酸的裝載。

2.1 被動孵育

被動孵育是一種非侵入性的裝載方式，可最大程度地保持EVs 結(jié)構(gòu)的完整性。然而，由于核酸分子本身具有負(fù)電性，難以跨過EVs膜進(jìn)入EVs內(nèi)部，因此，被動孵育的方法通常用于將經(jīng)膽固醇或其它疏水分子化學(xué)修飾的核酸分子嵌入到EVs 的膜表面。Haraszti 等[26]通過將膽固醇修飾的siRNA 與EVs共孵育，獲得了膜表面結(jié)合有siRNA 的EVs。除了治療性核酸分子外，被動孵育也常用于對EVs 表面進(jìn)行核酸適體（Aptamer）的修飾。Zou 等[27]利用可特異性識別酪氨酸蛋白激酶7 的核酸適體sgc8 對EVs 進(jìn)行功能化，成功實現(xiàn)了載有化療藥物多柔比星（Doxorubicin， Dox）的EVs 對腫瘤的靶向殺傷。此外，還可通過與EVs 表面特征蛋白結(jié)合實現(xiàn)核酸分子的嵌入。Gao 等[28]將CP05（一種與CD63 結(jié)合的錨定肽）與ASO偶聯(lián)，并與EVs共孵育，實現(xiàn)了EVs 表面ASO 的修飾，其結(jié)合效率達(dá)到82.5%。經(jīng)過修飾后的EVs 在肌營養(yǎng)不良小鼠模型中展現(xiàn)出增加肌營養(yǎng)不良蛋白活性的功能（圖3A）。然而，被動孵育的方式大多只能將核酸分子負(fù)載于EVs 表面，因此該方法更適用于siRNA 和ASO 等穩(wěn)定性較強(qiáng)的核酸分子。

2.2 化學(xué)膜透化

表面活性劑（包括皂素和Triton X-100等）具有膜透化功能，可通過改變EVs膜的通透性，有利于核酸分子包封進(jìn)入EVs內(nèi)部。與其它負(fù)載方法相比，膜透化處理可盡可能地保持EVs 的粒徑不變。Zhang 等[29]利用具有膜透化活性的細(xì)菌毒素（鏈球菌溶血素）將腫瘤抑制性DNA-miRNA 復(fù)合物載入EVs 中，有效抑制了與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA-155 的表達(dá)。此外，在熱休克條件下， CaCl₂ 可介導(dǎo)包括miRNA 和siRNA 等在內(nèi)的小核酸分子進(jìn)入EVs 中。該方法的作用機(jī)制是在低滲CaCl₂ 溶液中，通過熱休克引起EVs膜通透性的改變，促進(jìn)EVs 對CaCl₂-核酸復(fù)合物的吸收。Zhang 等[30]通過改良的CaCl₂ 轉(zhuǎn)染方法，成功地增加了特定的miRNA 模擬物及抑制劑在EVs 中的負(fù)載量，并證明通過該方法負(fù)載的miRNA 可發(fā)揮正常功能。Sayyed 等[31]利用CaCl₂ 轉(zhuǎn)染法將miRNA-155 抑制劑負(fù)載入EVs內(nèi)，實現(xiàn)了對口腔癌化療耐藥性的逆轉(zhuǎn)。

2.3 電穿孔膜透化

電穿孔是最常用的EVs 中核酸的裝載方法之一。該方法通過高強(qiáng)度電場瞬時改變膜通透性，使EVs膜表面產(chǎn)生孔隙，進(jìn)而使外源核酸分子可進(jìn)入EVs內(nèi)腔。2011年， Alvarez-Erviti 等[32]利用電穿孔技術(shù)將siRNA 裝載至未成熟樹突狀細(xì)胞分泌的EVs 中，用于治療阿爾茲海默癥。此后，電穿孔技術(shù)的應(yīng)用范圍不斷拓展，涵蓋了包括miRNA[33-34]、mRNA[35]以及其它核酸分子[36-37]的EVs裝載。2022年， Wan等[38]利用電穿孔技術(shù)在肝星狀細(xì)胞來源的EVs中負(fù)載CRISPR-Cas9基因編輯的核糖核蛋白復(fù)合物（Ribonucleoprotein，RNP），實現(xiàn)了對肝臟疾病的精確組織特異性治療（圖3B）。盡管電穿孔技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，但仍存在一些問題。首先，有研究指出，電穿孔技術(shù)在裝載siRNA 時會產(chǎn)生大量siRNA 聚集體，這些聚集物難以通過離心去除，導(dǎo)致EVs內(nèi)siRNA負(fù)載量被高估[39]。此外， Hood等[40]利用動態(tài)光散射（Dynamic light scattering，DLS）分析電穿孔前后EVs 的粒徑，發(fā)現(xiàn)電穿孔可能破壞EVs 結(jié)構(gòu)的完整性，并誘導(dǎo)EVs 顆粒團(tuán)聚。Usman 等[41]評估了通過電穿孔方式在紅細(xì)胞EVs 中裝載3 種不同大小核酸分子（ASO、Cas9 mRNA 和pDNA）的效果，結(jié)果顯示，電穿孔法可使20%～24%的ASO 和18%的Cas9 mRNA 裝載至EVs 中，并且這些負(fù)載核酸可正常發(fā)揮功能。然而，裝載分子量較大的pDNA 時，裝載效果顯著降低。此外，部分研究指出，電穿孔法裝載DNA 時，裝載效率依賴于DNA 分子的大??；當(dāng)DNA 長度超過750 bp 時， EVs 的封裝能力顯著受限[38]。Kim 等[37]采用電穿孔技術(shù)在EVs 中裝載CRISPR/Cas9 表達(dá)質(zhì)粒，用于抑制細(xì)胞程序性死亡蛋白PARP-1 的表達(dá)，但EVs內(nèi)質(zhì)粒的封裝效率僅為1.75%。因此，在使用電穿孔技術(shù)時，需要謹(jǐn)慎考慮聚集問題，并優(yōu)化電穿孔所使用的緩沖液成分、脈沖容量、場強(qiáng)，以及電穿孔前的EVs 濃度、核酸濃度和后續(xù)純化策略等多個關(guān)鍵參數(shù)。

2.4 超聲及擠壓處理

超聲處理技術(shù)通過在EVs 的膜上產(chǎn)生微孔，實現(xiàn)核酸在其內(nèi)部的封裝。Lamichhane 等[42]提出，超聲處理可作為電穿孔技術(shù)的替代方法，用于將siRNA 裝載至EVs 中，以治療HER2 陽性乳腺癌。與被動孵育相比，超聲處理顯著提高了siRNA 在EVs 中的裝載效率，包封率提高了3 倍。與電穿孔技術(shù)相比，超聲處理所產(chǎn)生的的siRNA 聚集現(xiàn)象僅約為電穿孔技術(shù)的1/12。然而，當(dāng)超聲處理超過30 s 時，在35 kHz頻率下，超聲處理可能會導(dǎo)致siRNA 降解。此外，通過施加剪切應(yīng)力也可引起EVs膜的缺陷，從而促進(jìn)核酸的封裝。Grossen 等[43]通過擠出和微流控混合的方法，將ASO 封裝到牛奶來源的EVs 中。該研究結(jié)果表明，裝載有化學(xué)修飾ASO 的EVs 可有效實現(xiàn)靶基因的敲低，并進(jìn)一步通過體內(nèi)實驗驗證其治療效果。

2.5 脂質(zhì)體與EVs膜融合

前述方法在對EVs 進(jìn)行核酸負(fù)載時，通常難以實現(xiàn)大分子核酸的高效負(fù)載。作為一種人工合成的納米顆粒，脂質(zhì)體具有與EVs 類似的磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)，并因其高載藥效率而備受關(guān)注。當(dāng)脂質(zhì)體與EVs相互接近并發(fā)生膜融合時，內(nèi)腔水溶液可融合為一個整體。基于此特性， EVs 與脂質(zhì)體的融合已被廣泛應(yīng)用于EVs內(nèi)容物的分析[44-46]及EVs 載藥等研究。通過EVs 與脂質(zhì)體的融合，不僅能充分利用脂質(zhì)體的高載藥和易修飾的優(yōu)勢，還能結(jié)合EVs 良好的生物相容性、低免疫原性和長循環(huán)時間的特性，賦予融合體較長的體內(nèi)循環(huán)時間及特異性的腫瘤靶向能力。因此，脂質(zhì)體與EVs 的膜融合成為了EVs 高效裝載大分子核酸的有效解決方案之一。2018 年， Lin 等[47]通過EVs 與脂質(zhì)體膜融合的方式獲得了雜化EVs，用于將CRISPR/Cas9 表達(dá)質(zhì)粒遞送至間充質(zhì)干細(xì)胞中。結(jié)果表明，與僅含有Runx2 sgRNAs 的CRISPR/dCas9 系統(tǒng)對照組相比，攜帶CRISPR/Cas9 表達(dá)質(zhì)粒的雜化EVs 可使靶基因Runx2 的表達(dá)下調(diào)2 倍（圖3C）。2022 年， Liang 等[48]通過基因工程改造，在EVs 表面蛋白Lamp2b 的N 端融合軟骨細(xì)胞親和肽（CAP），構(gòu)建了軟骨細(xì)胞靶向的EVs。將這些CAP 工程化的EVs 與包封了靶向基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP-13）的CRISPR/Cas9 質(zhì)粒的脂質(zhì)體進(jìn)行膜融合，形成雜化EVs，可有效抑制軟骨細(xì)胞中MMP-13 的表達(dá)，減弱軟骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的降解，從而實現(xiàn)對骨關(guān)節(jié)炎的治療。EVs 與脂質(zhì)體融合的策略不僅提升了EVs 作為核酸遞送載體的負(fù)載效率，還為解決EVs自身遞送效率不均一、靶向能力不可控等問題提供了新的思路。

內(nèi)源性裝載的優(yōu)勢在于通過對母細(xì)胞進(jìn)行改造自動地將核酸“貨物”精準(zhǔn)分揀至EVs 的內(nèi)腔或表面。然而，由于EVs 的分泌依賴細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的“貨物”分揀機(jī)制，母細(xì)胞的改造可能對EVs 的生成途徑、分泌水平以及蛋白質(zhì)含量產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響其下游應(yīng)用[49-50]。此外，內(nèi)源性裝載僅限于細(xì)胞培養(yǎng)衍生的EVs，難以應(yīng)用于牛奶和植物來源EVs 中核酸分子的裝載。與之相比，外源性裝載方法表現(xiàn)出更廣泛的適用性。不同的外源性裝載技術(shù)由于工作原理各異，表現(xiàn)出不同的優(yōu)勢及局限性。研究者可根據(jù)具體需求，選擇最合適的外源性裝載方法，用于EVs 中核酸分子的裝載。

3 EVs 核酸裝載質(zhì)量評估

盡管基于EVs 的核酸藥物遞送體系具有眾多顯著優(yōu)勢，但目前缺乏有效的評估EVs 核酸裝載效果的方法。EVs 核酸裝載系統(tǒng)的顆粒濃度、粒徑分布、核酸裝載比例和裝載量等理化性質(zhì)是決定其體內(nèi)行為及藥效的關(guān)鍵指標(biāo)[51-52]，因此，亟需建立準(zhǔn)確且快速的定量表征方法。其中，顆粒濃度直接影響核酸藥物在疾病部位的濃度以及藥物的體內(nèi)循環(huán)時間，同時可用于評估藥物保存的長期穩(wěn)定性；粒徑分布對藥物的體內(nèi)分布具有重要影響；核酸裝載比例和裝載量的評估是衡量EVs 核酸裝載效率的關(guān)鍵指標(biāo)之一，不僅可用于不同產(chǎn)品和批次之間的對比，還為后續(xù)給藥方案的設(shè)計提供了重要參考。

Grossen 等[43]通過高效液相色譜結(jié)合波長為260 nm 的紫外檢測器，成功測定了牛奶來源的EVs 中負(fù)載的ASO。此外，實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）[53-54]和32P-放射性標(biāo)記[55]等技術(shù)也可用于評估EVs 的核酸裝載效率。然而，由于細(xì)胞來源、細(xì)胞狀態(tài)以及分泌途徑等的不同， EVs 在粒徑、分子組成及生物學(xué)功能方面存在顯著的個體差異性和多樣性。因此，不同EVs 核酸藥物的裝載能力也存在較大的差異，集權(quán)平均的分析方法無法在單顆粒水平對這種異質(zhì)性進(jìn)行探究。流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）是一種可對懸液中的細(xì)胞或細(xì)胞大小的顆粒進(jìn)行快速、高通量和多參數(shù)定量分析的先進(jìn)技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于EVs 的單顆粒多參數(shù)定量檢測[56-58]。其中，散射光可反映顆粒的粒徑或顆粒度等物理特性，而多色熒光信號可揭示EVs 的蛋白質(zhì)、核酸等生物化學(xué)信息。2018 年， van der Pol 等[59]評估了多種商品化流式細(xì)胞儀對EVs 粒徑范圍的檢測能力，結(jié)果表明，常規(guī)配置的流式細(xì)胞儀僅適用于檢測較大尺寸的EVs，只有少數(shù)高靈敏設(shè)備（如Apogee A50-Micro、BD nflux 和BD LSRⅡ）可檢測300～600 nm 粒徑范圍內(nèi)的EVs。然而，大多數(shù)EVs 的粒徑小于100 nm，因此，流式細(xì)胞儀難以有效檢測小粒徑的EVs。通過熒光染料標(biāo)記并采用熒光觸發(fā)模式，檢測靈敏度顯著提升。Zhupanyn 等[60]利用ImageStream 成像流式細(xì)胞儀分析脂膜染料PKH67 標(biāo)記的EVs 與DY647 標(biāo)記的siRNA 共定位情況，可驗證EVs 是否成功裝載siRNA。然而，傳統(tǒng)FCM 難以檢測熒光亮度小于200 或500 個異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）分子的信號。此外，隨著EVs 尺寸減小，其可負(fù)載的核酸含量顯著減少，這進(jìn)一步增加了FCM 對EVs 核酸裝載分析的難度。

2014年，本課題組結(jié)合瑞利光散射與鞘流單分子熒光檢測技術(shù)，成功研發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的納米流式檢測技術(shù)（Nano-flow cytometry， nFCM）。與傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀相比， nFCM 的散射檢測靈敏度提升了4～5個數(shù)量級，熒光檢測靈敏度提升了1～2 個數(shù)量級。此前，本課題組利用SYTO 82 核酸染色技術(shù)協(xié)助美國Alnylam Pharmaceuticals公司對其臨床Ⅱ期基因沉默納米藥物siRNA 載荷脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）進(jìn)行了表征，成功區(qū)分了載有siRNA 的LNPs 和空白LNPs，并測定了siRNA 載荷LNPs 的顆粒濃度、包封率及單顆粒藥物載量分布等參數(shù)（圖4A）[61]。EVs 本身攜帶核酸分子， EV-DNA 在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)以及腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。2022 年， Liu 等[62]采用SYTO 16 核酸染料和核酸內(nèi)切酶處理策略，對EV-DNA 進(jìn)行了單顆粒水平的分析（圖4B）。通過散射與熒光信號的雙參數(shù)檢測，實現(xiàn)了對游離DNA、攜帶DNA 的EVs 和不含DNA 的EVs 及其它雜質(zhì)顆粒的單顆粒分辨， 3類群體的占比分別為42.4%、22.7%和34.9%。研究表明， DNA 陽性EVs 主要分為兩大亞群，即表面黏附DNA 的小粒徑EVs（lt;100 nm）和內(nèi)腔攜帶DNA 的較大粒徑EVs（80～200 nm）。此外，南方醫(yī)科大學(xué)鄭磊課題組[63]基于DNA 納米線誘導(dǎo)的核酸放大技術(shù)，利用nFCM 在單顆粒水平實現(xiàn)了對乳腺癌細(xì)胞系來源EVs 中miR-1246的定量檢測。nFCM 對單顆粒的分析結(jié)果表明，采用電穿孔技術(shù)將FAM 標(biāo)記的siRNA 裝載入EVs時，存在電擊緩沖液、siRNA 和EVs 的自團(tuán)聚問題，這些聚集體無法通過離心去除，導(dǎo)致雜質(zhì)顆粒的產(chǎn)生及裝載效率的高估（圖4C）。因此， nFCM 在評估EVs內(nèi)核酸裝載效果方面展現(xiàn)出顯著潛力，未來有望成為該領(lǐng)域的重要工具。

4 EVs 介導(dǎo)的核酸遞送在癌癥治療中的應(yīng)用

癌癥是目前全球范圍內(nèi)導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一，亟需開發(fā)具有高特異性和安全性的治療方法[64]。近年來， EVs 介導(dǎo)的核酸療法已成為癌癥治療的一種強(qiáng)大工具。EVs 攜載著來源于母細(xì)胞的生物活性分子，這種分子的多樣性使得不同細(xì)胞來源的EVs具備獨特的功能。因此，使用EVs 作為核酸分子的遞送載體，可以根據(jù)核酸分子的靶向作用選擇特定來源的EVs，用于癌癥治療。

4.1 腫瘤細(xì)胞來源的EVs

與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞表面通常過表達(dá)CD47（整合素相關(guān)蛋白），這種蛋白可觸發(fā)巨噬細(xì)胞上的抑制性受體SIRPα，逃避吞噬作用和抗腫瘤免疫[65]。腫瘤來源的EVs（Tumor-derived extracellular vesicles，TDEVs）繼承了母細(xì)胞逃逸吞噬的特性。在藥物裝載后，這些TDEVs 可類似于特洛伊木馬般逃過巨噬細(xì)胞的識別[66-67]。此外， TDEVs 可通過其表面的特征蛋白實現(xiàn)對相似腫瘤細(xì)胞的自我識別，從而發(fā)揮靶向功能[67-68]。Kim 等[37]利用卵巢癌細(xì)胞來源的EVs 負(fù)載CRISPR/Cas9 表達(dá)質(zhì)粒，成功實現(xiàn)了對母細(xì)胞的基因編輯。相比于上皮細(xì)胞來源的EVs，同源的EVs 可選擇性地在卵巢癌腫瘤中積累，表現(xiàn)出更有效的體內(nèi)遞送和基因編輯效果。然而，研究發(fā)現(xiàn)， TDEVs 可通過其負(fù)載的物質(zhì)（如mRNA、DNA 和蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞間傳遞信息，將腫瘤細(xì)胞的分子和遺傳信息傳播到鄰近或遠(yuǎn)端組織，從而促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[69]。盡管有研究表明， TDEVs 可根據(jù)其表面蛋白的表達(dá)進(jìn)入特定的受體細(xì)胞，但由于TDEVs 攜帶的裝載物是致癌轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵組成部分，這極大地限制了TDEVs 在藥物遞送中的應(yīng)用[68]。Zhou 等[70]通過去除肝癌細(xì)胞EVs 的內(nèi)容物，并將EVs膜與磷脂雜合，制備了脂質(zhì)納米囊泡（Lipid nanovesicles， LEVs），用于siRNA 的穩(wěn)定負(fù)載和遞送。LEVs具有良好的生物相容性，可以防止siRNA 在血漿中降解，并通過硫酸肝素蛋白聚糖介導(dǎo)的途徑，促進(jìn)其被同源的肝癌細(xì)胞特異性攝取，從而實現(xiàn)“歸巢”靶向。進(jìn)入細(xì)胞后，LEVs 可規(guī)避內(nèi)涵體降解途徑，通過高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞內(nèi)“高速路徑”實現(xiàn)轉(zhuǎn)運，顯著提高siRNA的轉(zhuǎn)染效率，在癌癥治療領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景（圖5A）。

4.2 免疫細(xì)胞來源的EVs

免疫細(xì)胞主要存在于血液和組織中，承擔(dān)著抵御病原體入侵，清除病變或衰老細(xì)胞的職責(zé)，其數(shù)量和生理狀態(tài)與人體健康密切相關(guān)[71-72]。免疫細(xì)胞來源的EVs 在免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮了核心作用，對包括腫瘤、心血管和神經(jīng)退行性疾病在內(nèi)的多種疾病起到了至關(guān)重要的作用[73-75]。因此，免疫細(xì)胞來源的EVs 在免疫治療中具有巨大的應(yīng)用潛力。目前，包括巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞（Natural killer cells，NK cells）等多種免疫細(xì)胞來源的EVs 與核酸療法協(xié)同用于抗腫瘤治療。

巨噬細(xì)胞來源的EVs 繼承了巨噬細(xì)胞固有的腫瘤靶向特性，可被腫瘤組織的細(xì)胞因子招募[76]。此外，巨噬細(xì)胞具有優(yōu)異的生物相容性和高代謝率，使其可大量分泌EVs，因而巨噬細(xì)胞成為理想的EVs 藥物遞送平臺供體細(xì)胞[77]。Gong 等[78]利用巨噬細(xì)胞來源的EVs 作為載體，將膽固醇修飾的miRNA 和化療藥物Dox 共遞送至三陰性乳腺癌細(xì)胞中，實現(xiàn)了基因療法與化療的協(xié)同抗腫瘤作用。在腫瘤微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞通常存在M1 和M2 兩種亞群。M1 型巨噬細(xì)胞可分泌促炎因子，直接殺傷腫瘤細(xì)胞，或通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中其它免疫細(xì)胞的功能抑制腫瘤細(xì)胞的生長[79-81]。相反， M2 型巨噬細(xì)胞通過分泌生長因子促進(jìn)腫瘤生長，或者通過分泌免疫抑制因子抑制腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。Liu 等[82]通過基因工程改造母細(xì)胞，獲得了水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）修飾的M1 型巨噬細(xì)胞EVs（M1 EVs），并通過電穿孔技術(shù)將抗PD-L1 的siRNA 裝載到EVs內(nèi)部。由于M1 EVs具有天然的腫瘤靶向能力， EVs 可定向歸巢至腫瘤部位，其表面的VSV-G 誘導(dǎo)EVs 與靶細(xì)胞膜融合，繞過內(nèi)吞途徑實現(xiàn)siPD-L1 的胞質(zhì)遞送，進(jìn)而有效觸發(fā)PD-L1 的沉默效果。該體系有效阻斷了PD-L1/PD-1 的相互作用，提高了CD8 陽性T 細(xì)胞的比例，并與M1 EVs內(nèi)的細(xì)胞因子協(xié)同作用，促進(jìn)了M2 型巨噬細(xì)胞向M1 型巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，展現(xiàn)出令人滿意的抗腫瘤效果（圖5B）。

NK 細(xì)胞是淋巴細(xì)胞家族的一員，與T 細(xì)胞和B 細(xì)胞同屬，作為先天免疫的重要效應(yīng)因子，在抗腫瘤方面具有重要作用。源自NK 細(xì)胞的EVs 保持了NK 細(xì)胞的免疫刺激能力，因此在腫瘤免疫治療方面具有巨大的應(yīng)用潛力[83-84]。研究表明，源自NK 細(xì)胞的EVs具有特定的腫瘤細(xì)胞殺傷特性，對正常細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性[85]。2019 年， Neviani 等[86]的研究表明，攜帶腫瘤抑制因子microRNA-186 的NK 的EVs 表現(xiàn)出針對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞毒性，并可抑制免疫逃逸。2022 年， Zhang 等[87]通過NK 細(xì)胞來源的EVs 負(fù)載siRNA 和光敏劑Ce6，實現(xiàn)了光動力治療（Photodynamic therapy， PDT）與核酸療法的協(xié)同腫瘤免疫治療。在激光照射下， ROS 的產(chǎn)生實現(xiàn)了有效的PDT，促進(jìn)了M1 巨噬細(xì)胞的極化和DC 成熟，同時促進(jìn)了siRNA 的內(nèi)體逃逸和胞質(zhì)釋放，展現(xiàn)出理想的癌癥治療效果（圖5C）。

4.3 間充質(zhì)干細(xì)胞來源的EVs

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells， MSCs），又稱多能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，是一類多能成體干細(xì)胞，可從骨髓[88]、臍帶[89]、胎盤[90]和脂肪[91]等多種組織中獲得。這些細(xì)胞展現(xiàn)出極強(qiáng)的再生能力，能主動遷移至炎癥部位并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[92]。有研究表明， MSCs能通過分泌EVs 而發(fā)出信號，促進(jìn)或抑制不同癌癥腫瘤發(fā)展[93-94]。此外， MSCs 衍生的EVs 對腫瘤部位具有強(qiáng)烈的遷移性，在抗腫瘤藥物遞送方面展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。O′Brien 等[95]通過轉(zhuǎn)染獲得負(fù)載腫瘤抑制miR379 的MSCs EVs 用于乳腺癌的體內(nèi)治療。Zhou 等[96]采用電穿孔技術(shù)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的EVs內(nèi)裝載Galectin-9 siRNA，并通過表面修飾負(fù)載奧沙利鉑（Oxaliplatin， OXA）前藥的方式構(gòu)建了基于EVs 的雙功能胰腺癌治療納米材料。在被胰腺癌細(xì)胞內(nèi)化后， Galectin-9 siRNA 可阻斷Galectin-9/dectin-1，逆轉(zhuǎn)M2 極化腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞以增強(qiáng)免疫治療；同時， OXA 觸發(fā)胰腺腫瘤部位的免疫原性死亡，并通過抑制DNA 合成和修復(fù)殺死腫瘤細(xì)胞（圖5D）。目前， MSCs 來源的EVs 在癌癥治療方面的應(yīng)用仍處于起步階段，有待進(jìn)一步研究以加速其臨床應(yīng)用。

不同來源的EVs 因其攜載的生物活性分子的差異性，在用于癌癥治療的核酸遞送過程中展現(xiàn)出多樣的生物功能，可根據(jù)治療策略的需求選擇相應(yīng)的EVs 類型[13，67，97]。此外，核酸療法還可與化療藥物、光動力治療等其它癌癥治療策略聯(lián)合應(yīng)用，以獲得更好的療效。

5 總結(jié)與展望

相較于傳統(tǒng)的納米載體， EVs具有更低的免疫原性、更小的細(xì)胞毒性和更強(qiáng)的跨越生物屏障的能力，是理想的核酸遞送載體。這些優(yōu)點使EVs 可保護(hù)核酸分子免受宿主免疫系統(tǒng)的降解和清除。此外，EVs 還具有母細(xì)胞賦予的靶向特定細(xì)胞和激活特定信號通路的能力，這使其在疾病治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了極大的應(yīng)用潛力。其中，外泌體是目前臨床前研究和臨床試驗中應(yīng)用最廣泛的EVs 類型。截至2024 年8 月，根據(jù)美國臨床試驗數(shù)據(jù)庫（www.ClinicalTrials.gov）的檢索，已有229 項與外泌體相關(guān)的臨床試驗，其中90 項涉及癌癥治療，例如，美國MD 安德森癌癥中心，正在開展一項I 期臨床試驗，旨在利用裝載有KrasG12D siRNA 的間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體治療攜帶KrasG12D 突變的轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者。本文綜述了EVs 作為核酸遞送載體的貨物裝載方法及其在癌癥治療領(lǐng)域的研究進(jìn)展。盡管現(xiàn)階段EVs 介導(dǎo)的核酸遞送已經(jīng)取得了顯著的研究進(jìn)展，但仍然存在一些挑戰(zhàn)。首先， EVs 的規(guī)?；a(chǎn)是其應(yīng)用轉(zhuǎn)化的瓶頸，尤其在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)和高效分離方面，設(shè)備開發(fā)至關(guān)重要。目前，多種策略被用于提高EVs 產(chǎn)量，包括生物反應(yīng)器[98]、微載體3D 培養(yǎng)[99]以及微流控裝置[100-101]等技術(shù)。結(jié)合切向流過濾和色譜分離技術(shù)，可實現(xiàn)EVs 的高效分離和純化。其次，如何更高效地將核酸裝載至EVs 中仍面臨挑戰(zhàn)。與合成納米顆粒相比， EVs 的核酸封裝效率（尤其對于大分子量的核酸分子）還有待進(jìn)一步提升。最后，在以EVs 作為核酸遞送載體用于疾病治療的研究中，個性化精準(zhǔn)治療備受關(guān)注。鑒于EVs 的異質(zhì)性及人體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境，來自患者自身細(xì)胞的EVs 有望成為最佳的遞送載體。例如，通過微創(chuàng)或手術(shù)獲取患者的腫瘤細(xì)胞后，進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)，生產(chǎn)出相應(yīng)的EVs。此類EVs 不僅可裝載特定的核酸分子，還攜帶腫瘤特異性抗原，未來有望成為個性化的天然腫瘤疫苗[67]。雖然存在上述多方面的挑戰(zhàn)，但基于EVs 的核酸遞送已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段，相信未來一定可進(jìn)一步發(fā)揮EVs 作為核酸遞送載體的潛在臨床應(yīng)用價值。