〔摘要〕 目的 基于Janus激酶-信號傳導及轉錄激活因子（janus-activated kinase-singal transducers and activators of transcriprion， JAK-STAT）信號通路探究降氣平喘湯干預支氣管哮喘的作用機制。方法 選用SD雄性大鼠48只，隨機分為空白組（等體積蒸餾水）、模型對照組（等體積蒸餾水）、潑尼松組[醋酸潑尼松片6.3 mg/（kg·d）]、中藥低量組[降氣平喘湯3.96 mL/（kg·d）]、中藥中量組[降氣平喘湯7.92 mL/（kg·d）]、中藥高量組[降氣平喘湯15.84 mL/（kg·d）]，每組8只。除空白組外，各組均于第0、7天用卵清蛋白（ovalbumin， OVA）致敏溶液腹腔注射致敏，第14天開始用OVA致敏溶液連續(xù)霧化14 d。造模成功后連續(xù)灌胃給藥14 d。取肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid， BALF）及肺組織進行HE染色、Masson染色、免疫組織化學病理學檢測；ELISA法檢測BALF中白細胞介素（interleukin， IL）-5、IL-13、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、γ-干擾素（interferon-γ， IFN-γ）含量；Western blot法檢測肺組織中JAK1、JAK2、STAT3、p-STAT3、STAT5、p-STAT5蛋白表達水平；RT-PCR法檢測肺組織中JAK1、JAK2 mRNA表達水平。結果 模型對照組大鼠出現(xiàn)肺泡壁增厚，肺泡塌陷和支氣管、血管厚度增厚，大量炎性細胞浸潤及上皮細胞紊亂、脫落、支氣管纖維結締組織增生，肺臟組織纖維化，大量膠原纖維沉積。與潑尼松組相比，中藥低、中、高量組α-平滑肌肌動蛋白（α-Smooth muscle actin，α-SMA）、JAK1蛋白表達水平和p-STAT3/STAT3、p-STAT5/STAT5升高（P<0.05），中藥低、中量組IL-5、IL-13含量及JAK2蛋白表達水平升高（P<0.05），中藥低量組TNF-α含量和JAK1、JAK2 mRNA表達水平升高（P<0.05），IFN-γ含量降低（P<0.05）。與中藥低量組相比，中藥中、高量組α-SMA、JAK1、JAK2蛋白表達水平和p-STAT3/STAT3、p-STAT5/STAT5降低（P<0.05），IFN-γ含量升高（P<0.05），中藥高量組TNF-α、IL-5、IL-13含量降低（P<0.05）。與中藥中量組相比，中藥高量組α-SMA、JAK2蛋白表達水平、p-STAT3/STAT3、p-STAT5/STAT5降低（P<0.05），IL-5含量降低（P<0.05）。結論 降氣平喘湯可能通過調節(jié)Th1/Th2細胞因子平衡，進而調節(jié)JAK-STAT信號通路轉導來改善支氣管哮喘氣道炎癥及緩解氣道重塑。

〔關鍵詞〕 支氣管哮喘；降氣平喘湯；JAK-STAT信號通路；Th1/Th2平衡；作用機制

〔中圖分類號〕R285.5 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.10.006

Exploring the mechanism of action of Jiangqi Pingchuan Decoction in intervening bronchial asthma based on the JAK-STAT signaling pathway

YE Yong1， ZHAO Fan2， HE Siyu2， TONG Yi2， ZHU Qinquan2， ZHANG Di2*

1. The First Clinical School of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To exploring the mechanism of action of Jiangqi Pingchuan Decocion （JQPCD） in intervening bronchial asthma based on the Janus activated kinase-signal transducers and activators of transcription （JAK-STAT） signaling pathway. Methods A total of 48 male SD rats were randomized into blank group （with equal volume of distilled water）， model control group （with equal volume of distilled water）， prednisone group [with prednisone acetate tablets 6.3 mg/（kg·d）]， low- [with JQPCD 3.96 mL/（kg·d）]， medium- [with JQPCD 7.92 mL/（kg·d）]， and high-dose Chinese medicine groups [with JQPCD 15.84 mL/（kg·d）]， with 8 rats in each group. Except for the blank group， all groups were sensitized by intraperitoneal injection of ovalbumin （OVA） sensitization solution on days 0 and 7. From day 14 on， they were continuously nebulized with the OVA sensitization solution for 14 days. After the successful modeling， continuous gavage was administered for 14 days， and bronchoalveolar lavage fluid （BALF） and lung tissue were taken for HE staining， Masson staining， and immunohistochemical pathological testing; ELISA was used to determine the levels of interleukin （IL）-5 ， IL-13， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， and interferon-γ （IFN-γ） in BALF; Western blot was applied to examine the protein expression levels of JAK1， JAK2， STAT3， p-STAT3， STAT5， and p-STAT5 in the lung tissue; RT-PCR was used to check the expression levels of JAK1 and JAK2 mRNA in the lung tissue. Results The model control group of rats showed thickening of alveolar walls， collapse of alveoli， thickening of bronchi and blood vessels， infiltration of a large number of inflammatory cells， disorder and shedding of epithelial cells， proliferation of bronchial fibrous connective tissue， fibrosis of lung tissue， and deposition of a large amount of collagen fibers. Compared with the prednisone group， the levels of α-smooth muscle actin （α-SMA）， JAK1 protein expression， and p-STAT3/STAT3， p-STAT5/STAT5 were increased in the low-， medium-， and high-dose Chinese medicine groups （P<0.05）. Additionally， the levels of IL-5， IL-13， and JAK2 protein expression were increased in the low- and medium-dose Chinese medicine groups （P<0.05）. The levels of TNF-α and JAK1， JAK2 mRNA expression were also increased in the low-dose Chinese medicine group （P<0.05）， while the content of IFN-γ was decreased （P<0.05）. Compared with the low-dose Chinese medicine group， the expression levels of α-SMA， JAK1， JAK2 proteins and p-STAT3/STAT3， p-STAT5/STAT5 were decreased in the medium- and high-dose Chinese medicine groups （P<0.05）， while the content of IFN-γ was increased （P<0.05）. The levels of TNF-α， IL-5， and IL-13 were decreased in the high-dose Chinese medicine group （P<0.05）. Compared with the medium-dose Chinese medicine group， the high-dose Chinese medicine group showed a decrease in α-SMA， JAK2 protein expression levels， p-STAT3/STAT3， and p-STAT5/STAT5 （P<0.05）， as well as a decrease in IL-5 content （P<0.05）. Conclusion JQPCD may improve airway inflammation and alleviate airway remodeling in bronchial asthma by regulating the balance of Th1/Th2 cytokines， thereby modulating the JAK-STAT signaling pathway transduction.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 bronchial asthma; Jiangqi Pingchuan Dectction; JAK-STAT signaling pathway; Th1/Th2 balance; mechanism of action

支氣管哮喘（以下簡稱哮喘）是兒童時期最常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，常伴有阻塞性睡眠呼吸暫停、胃食管反流、過敏性鼻炎等疾病[1-4]。哮喘可發(fā)生在所有年齡段，尤其是14歲以下的兒童[5]。在中國0～14歲的兒童中，大約有3.0%的兒童患有哮喘[6]。近年來，隨著工業(yè)的發(fā)展和環(huán)境污染的惡化，哮喘的發(fā)病率仍在不斷上升[7]。哮喘的發(fā)病機制極為復雜，雖然大多數(shù)兒童可以通過激素治療控制癥狀，但仍需長期使用以鞏固治療，少數(shù)兒童甚至會面臨危及生命的病情惡化風險[8-9]。在治療哮喘的過程中，一些藥物會引起不良反應，如血壓升高、胃潰瘍、腎功能損害等[10]。因此，開發(fā)安全有效的抗哮喘藥非常重要。

張滌教授認為，兒童哮喘的發(fā)病乃外因作用于內因的結果，即內有宿痰伏肺、外有實邪觸發(fā)為其關鍵病機；病位主要在肺、脾、腎三臟；治療上以止咳化痰、降氣平喘、祛邪為主要治則；方用自擬方“降氣平喘湯”。降氣平喘湯是張滌教授基于臨床經(jīng)驗、理論基礎總結的自擬方，方由經(jīng)典名方《攝生眾妙方·定喘湯》化裁而來。方中麻黃、杏仁、白果宣降相宜，止咳平喘，共為君藥；桑白皮、地骨皮可清瀉肺熱，降肺中伏火；葶藶子苦泄辛散，功專瀉肺之實而下氣平喘，紫蘇子降氣化痰而止咳平喘，款冬花、紫菀潤肺下氣、辛開肺郁、化痰濁而咳止，瓜蔞皮清肺熱、潤肺燥、導痰濁下行，甜葉菊生津、防止邪熱過傷津液，以上諸藥共為臣藥；桔梗載藥上行于肺為佐藥；甘草調和諸藥為使藥。諸藥相合，宣降相宜，一以恢復肺氣宣發(fā)肅降功能為旨，宣肅如常則咳喘自平；一著力于化痰、排痰，痰化則咳止。因此，本研究擬通過探究降氣平喘湯干FybVRnA07/jZh5jcHp68sQ==預哮喘的作用機制，為中醫(yī)藥干預哮喘提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠48只，體質量300～350 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物實驗中心，溫度20～25 ℃，濕度50%～70%；動物合格證號：SCXK（湘）2019-0004。實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準，實驗倫理編號：ZYFY20221111-73。

1.2 實驗藥物

降氣平喘湯（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑中心，批號：20230815，規(guī)格：100 mL/瓶）；醋酸潑尼松片（生產(chǎn)自浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：LA23262，規(guī)格：5 mg/片）。

1.3 主要實驗試劑

卵清蛋白（ovalbumin， OVA）（北京索萊寶科技有限公司，批號：A8041）；氫氧化鋁（上海麥克林生化科技股份有限公司，批號：A800852）；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：80008-1-RR）；HRP標記山羊抗兔IgG（賽默飛世爾科技公司，批號：#31460）；DAB顯色液（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，批號：DAB-1031）；腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α， TNF-α）ELISA試劑盒、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒、Western洗滌液、ECL發(fā)光液、Janus激酶2（janus-activated kinase 2， JAK2）抗體、信號傳導及轉錄激活因子5（singal transducers and activators of transcriprion 5， STAT5） 抗體、p-STAT5抗體、羊抗兔IgG-HRP（沈陽萬類生物科技有限公司，批號：WLE05、WLA019、WLA004、WLA013、WLA025、WLA006、WL02188、WL01881、WL05088、WLA023）；白細胞介素（interleukin， IL）-5、IL-13、γ-干擾素（interferon-γ， IFN-γ）ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，批號：E-EL-R0558、E-EL-R0563、E-EL-R0009）；JAK1抗體、STAT3抗體、p-STAT3抗體（安諾倫生物科技有限公司，批號：AF5012、AF6294、AF3293）；TRIpure（美國伯騰儀器有限公司，批號：RP1001）。

1.4 主要實驗儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司，批號：DH36001B）；石蠟切片機（德國徠卡公司，批號：RM2235）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司，批號：QH01-9030A）；超純水系統(tǒng)（力康生物醫(yī)療科技控股集團，批號：NW10LVF）；顯微鏡型號、顯微鏡拍照系統(tǒng)（奧林巴斯有限公司，批號：BX53、DP73）；微量移液器（芬蘭百得有限公司，批號：Proline）；酶標儀（美國伯騰儀器有限公司，批號：ELX-800）；紫外分光光度計（賽默飛世爾科技公司，批號：NANO one）；熒光定量PCR儀（柏業(yè)貿易有限公司，批號：Exicycler 96）等。

1.5 哮喘模型建立

取SD雄性大鼠48只，隨機分為正常組大鼠8只和哮喘模型組大鼠40只。正常組大鼠及哮喘模型組大鼠于第0、7天分別給大鼠腹腔注射生理鹽水及OVA致敏溶液0.2 mL，OVA致敏溶液配制方法為：0.5 g OVA+0.5 g氫氧化鋁+100 mL生理鹽水；第14天將大鼠放入霧化器的有機玻璃盒中，正常組大鼠及模型組大鼠分別以生理鹽水及OVA致敏溶液霧化吸入30 min激發(fā)，每天1次，連續(xù)霧化激發(fā)并給藥14 d。以大鼠出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、易激惹，搔鼻抓耳等癥狀為陽性反應，提示造模成功[7]。

1.6 實驗分組及給藥

正常組大鼠作為空白組，哮喘模型組大鼠隨機分為5組，記為模型對照組、潑尼松組、中藥低量組、中藥中量組、中藥高量組，每組8只。各組均通過灌胃給藥，遇激發(fā)日則在激發(fā)前1 h給予灌胃，每天1次，連續(xù)干預14 d。根據(jù)兒童及成人之間體表面積換算公式計算給藥，然后按照成人與動物之間的藥物換算公式計算給藥[11]?？瞻捉M和模型對照組給予等體積蒸餾水；潑尼松組給予醋酸潑尼松片6.3 mg/kg；中藥低量組給予降氣平喘湯3.96 mL/kg；中藥中量組給予降氣平喘湯7.92 mL/kg；中藥高量組給予降氣平喘湯15.84 mL/kg。

1.7 實驗取材

支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）收集：各組大鼠于末次激發(fā)后24 h麻醉，用大頭針將頭部及四肢固定后用75%乙醇行常規(guī)消毒，剪開大鼠頸部外皮，逐層剝離至看見主支氣管，在環(huán)形軟管（近頭處）用止血鉗夾閉，環(huán)形軟管（近頭處）剪出小口后加以固定。將1 mL生理鹽水注入肺中，不斷按壓肺部，緩慢回抽，備用。肺組織收集：剪開大鼠前胸前外皮，暴露肺部，大鼠肺臟放入多聚甲醛溶液中固定以備切片。

1.8 指標觀察

1.8.1 觀察大鼠生理反應 觀察各組大鼠毛發(fā)、飲食、精神狀態(tài)、呼吸頻率等情況。

1.8.2 HE染色觀察肺組織形態(tài)結構 肺組織常規(guī)石蠟包埋切片（厚度約5 μm），溫箱烘干后再置于60 ℃烘箱烘烤30 min，依次于二甲苯、無水乙醇中浸泡脫蠟，梯度乙醇水合；蒸餾水浸泡后蘇木素、伊紅染液進行染色；梯度乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯透明、中性后樹膠封片。隨后于顯微鏡下觀察染色效果及拍照。

1.8.3 Masson染色觀察肺組織膠原結構 肺組織常規(guī)石蠟包埋切片及切片脫蠟、水合；切片用Regaud蘇木精染液染核6 min后分別用自來水、1%鹽酸乙醇、蒸餾水清洗；紙擦干切片后用麗春紅酸性品紅液漿染1 min、1%磷鉬酸水溶液分化5 min、苯胺藍復染5 min，用0.2%冰醋酸水溶液浸洗。常規(guī)梯度乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯透明、中性后樹膠封片后于顯微鏡下觀察染色效果及拍照。

1.8.4 免疫組織化學檢測α-SMA蛋白表達水平 石蠟切片烤片后脫蠟、水合，切片加入微波爐里加熱至沸騰的抗原修復液（9 mL檸檬酸緩沖液，41 mL檸檬酸鈉緩沖液于450 mL蒸餾水混合），持續(xù)小火加熱10 min后自然冷卻至室溫，PBS浸泡5 min，3次；H2O2室溫孵育，PBS沖洗后加1% BSA，室溫孵育。加入一抗（1∶200），4 ℃過夜，PBS浸泡5 min，3次；加二抗（1∶500），37 ℃孵育60 min，PBS沖洗后加入100 μL DBS顯色試劑，待顏色變深后于水中終止；加蘇木素復染3 min，1%鹽酸乙醇分化3 s，自來水返藍20 min。常規(guī)脫水、透明、封片后于顯微鏡下觀察染色效果及拍照。

1.8.5 ELISA法檢測BALF中細胞因子含量 根據(jù)ELISA試劑盒產(chǎn)家的要求操作，紫外分光光度計于450 nm進行測定，然后計算離心后BALF中IL-5、IL-13、TNF-α、IFN-γ細胞炎癥因子含量。

1.8.6 Western blot檢測肺組織中JAK1、JAK2、ST？鄄AT3、p-STAT3、STAT5、p-STAT5蛋白表達水平 肺組織加入蛋白裂解液，在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min（離心半徑8 cm），分離上清液，即為蛋白抽提物。蛋白抽提物加入BCA蛋白標準液，用移液器反復吹打，37 ℃反應20 min，溶液由綠色變?yōu)樽仙笤O定讀取波長為570 nm進行讀數(shù)，計算樣本的蛋白濃度。組裝電泳裝置，聚丙烯酰胺凝膠制備用；用5×Loading Buffer和PBS稀釋蛋白樣品，煮沸5 min后進行電泳。PVDF轉膜，取出膜于封閉液中，脫色搖床上振蕩封閉1 h。加入一抗（1∶500或1∶1 000）4 ℃孵育過夜，用TBST清洗4次，每次5 min；加入二抗（1∶5 000），37 ℃孵育45 min，用TBST清洗6次，每次5 min。滴加新鮮配制的ECL混合溶液發(fā)光檢測，暗室曝光，用凝膠圖象處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer軟件）進行分析。

1.8.7 RT-PCR檢測肺組織中JAK1、JAK2 mRNA表達水平 取肺組織磨漿后依次加入TRIpure裂解液、氯仿，在4 ℃下以10 000 r/min離心10 min（離心半徑8 cm）取無色水相層；加等體積異丙醇混勻后-20 ℃過夜，離心棄上清液；加75%乙醇，離心棄上清液；再加RNase-free ddH2O，充分混勻，沉淀完全溶解后即為樣本總RNA。使用紫外分光光度計NANO one測定各樣本中RNA的濃度。將RNA進行反轉錄得到cDNA，反應體系如下，模板 RNA：1 μg、All-in-One First-Strand SuperMix：4 μL、dsDNase：1 μL、Nuclease-Free Water To 20 μL。

將上述cDNA用通用生物股份有限公司合成PCR引物進行PCR擴增，反應程序及引物序列詳見表1。反應程序：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s。用熒光定量PCR儀進行熒光定量分析。以β-actin為內參，數(shù)據(jù)以2-△△CT值為準。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用Graph Pad Prism9.5軟件對實驗結果進行統(tǒng)計學及可視化分析，計量資料均使用“ｘ±s”表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且符合方差齊性檢驗采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠生理反應變化

空白組哮喘模型建立期間及干預后可見大鼠體毛光滑柔亮，飲食量、反應、呼吸頻率、精神狀態(tài)等正常。模型對照組、潑尼松組及中藥低、中、高量組哮喘模型建立期間及干預后大鼠體毛暗淡無光、干枯、糟亂，納食量減少，反應遲緩，出現(xiàn)口唇發(fā)紺，呼吸急促、點頭樣呼吸、哮鳴音，煩躁不安、易激惹，搔鼻抓耳等癥狀。用藥干預后，潑尼松組、中藥高量組上述癥狀明顯減輕，中藥中量組癥狀減輕，中藥低量組癥狀無明顯減輕。

2.2 各組大鼠肺組織病理變化

2.2.1 降氣平喘湯對大鼠肺組織形態(tài)結構的影響 空白組可見氣管、血管厚度正常，未見炎性細胞浸潤，肺泡充盈，肺泡壁厚度正常。模型對照組可見肺泡壁增厚，肺泡塌陷和支氣管、血管厚度增厚，大量炎性細胞浸潤。潑尼松組、中藥高量組炎性細胞數(shù)量較模型對照組明顯減少。中藥中量組肺泡壁、支氣管、血管厚度、炎性細胞數(shù)量較模型對照組稍減少。中藥低量組肺泡壁、支氣管、血管厚度、炎性細胞數(shù)量較模型對照組無明顯變化。詳見圖1。

2.2.2 降氣平喘湯對大鼠肺組織膠原結構的影響 空白組可見上皮細胞、支氣管纖維結締組織正常，少許淡藍色膠原纖維沉積；模型對照組可見上皮細胞紊亂、脫落、支氣管纖維結締組織增生，肺臟組織纖維化，大量膠原纖維沉積；潑尼松組可見少量膠原纖維沉積；中藥低、中、高量組隨著劑量的加重，膠原纖維沉積量逐漸減少。詳見圖2。

與空白組相比，模型對照組纖維化面積占比升高（P<0.05）；與模型對照組相比，潑尼松組和中藥低、中、高量組纖維化面積占比下降（P<0.05）；與潑尼松組相比，中藥低、中、高量組纖維化面積占比升高（P<0.05）；與中藥低量組相比，中藥中、高量組纖維化面積占比下降（P<0.05）；與中藥中量組相比，中藥高量組纖維化面積占比降低（P<0.05）。詳見圖3。

2.2.3 降氣平喘湯對大鼠肺組織α-SMA蛋白表達水平的影響 與空白組相比，模型對照組α-SMA蛋白表達水平升高（P<0.05）；與模型對照組相比，潑尼松組和中藥低、中、高量組α-SMA蛋白表達水平下降（P<0.05）；與潑尼松組相比，中藥低、中、高量組α-SMA蛋白表達水平升高（P<0.05）；與中藥低量組相比，中藥中、高量組α-SMA蛋白表達水平下降（P<0.05）；與中藥中量組相比，中藥高量組α-SMA蛋白表達水平下降（P<0.05）。詳見圖4—5。

2.3 降氣平喘湯對Th1細胞因子TNF-α、IFN-γ含量影響

與空白組相比，模型對照組TNF-α含量升高（P<0.05）、IFN-γ含量下降（P<0.05）；與模型對照組相比，潑尼松組和中藥高量組TNF-α含量下降（P<0.05），潑尼松組和中藥中、高量組IFN-γ含量升高（P<0.05）；與潑尼松組相比，中藥低量組TNF-α含量升高（P<0.05）、IFN-γ含量下降（P<0.05）；與中藥低量組相比，中藥高量組TNF-α含量下降（P<0.05），中藥中、高量組IFN-γ含量升高（P<0.05）。詳見圖6。

2.4 降氣平喘湯對Th2細胞因子IL-5、IL-13含量影響

與空白組相比，模型對照組IL-5、IL-13含量升高（P<0.05）；與模型對照組相比，潑尼松組及中藥中、高量組IL-5、IL-13含量降低（P<0.05）；與潑尼松組相比，中藥低、中量組IL-5、IL-13含量升高（P<0.05）；與中藥低量組相比，中藥高量組IL-5、IL-13含量降低（P<0.05）；與中藥中量組相比，中藥高量組IL-5含量降低（P<0.05）。詳見圖7。

2.5 降氣平喘湯對JAK1、JAK2蛋白表達水平的影響

與空白組相比，模型對照組JAK1、JAK2蛋白表達水平升高（P<0.05）；與模型對照組相比，潑尼松組和中藥中、高量組JAK1蛋白表達水平降低（P<0.05），潑尼松組和中藥低、中、高量組JAK2蛋白表達水平降低（P<0.05）；與潑尼松組相比，中藥低、中、高量組JAK1蛋白表達水平升高（P<0.05），中藥低、中量組JAK2蛋白表達水平升高（P<0.05）；與中藥低量組相比，中藥中、高量組JAK1、JAK2蛋白表達水平均降低（P<0.05）；與中藥中量組相比，中藥高量組JAK2蛋白表達水平降低（P<0.05）。詳見圖8。

2.6 降氣平喘湯對STAT3、p-STAT3、STAT5、p-STAT5蛋白表達水平的影響

空白組、模型對照組、潑尼松組及中藥低、中、高量組各組間STAT3、STAT5蛋白表達水平無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。與空白組相比，模型對照組p-STAT3/STAT3、p-STAT5/STAT5升高（P<0.05）；與模型對照組相比，潑尼松組及中藥低、中、高量組p-STAT3/STAT3、p-STAT5/STAT5降低（P<0.05）；與潑尼松組相比，中藥低、中、高量組p-STAT3/STAT3、p-STAT5/STAT5升高（P<0.05）；與中藥低量組相比，中藥中、高量組p-STAT3/STAT3、p-STAT5/STAT5降低（P<0.05）；與中藥中量組相比，中藥高量組p-STAT3/STAT3、p-STAT5/STAT5降低（P<0.05）。詳見圖9。

2.7 降氣平喘湯對JAK1、JAK2 mRNA表達水平影響

與空白組相比，模型對照組JAK1、JAK2 mRNA表達水平升高（P<0.05）；與模型對照組相比，潑尼松組和中藥高量組JAK1、JAK2 mRNA表達水平降低（P<0.05）；與潑尼松組相比，中藥低量組JAK1、JAK2 mRNA含量升高（P<0.05）。詳見圖10。

3 討論

哮喘常因基因及環(huán)境因素之間的復雜作用而發(fā)作；前者包括遺傳背景、哮喘或其他特應性疾病的家族史等[12-13]；后者包括生活環(huán)境、海拔高度、氣候條件、飲食、過敏原等[14-16]。哮喘的發(fā)病機制極為復雜，目前多認為哮喘是一種炎癥性疾病[15]。諸多研究表明，Th1/Th2失衡是導致哮喘的重要機制[16-17]。

本研究觀察模型對照組大鼠生理反應出現(xiàn)體毛暗淡無光、干枯、糟亂，納食量減少等癥狀，表明經(jīng)OVA致敏的大鼠為哮喘模型，符合現(xiàn)有的研究結果。而隨著降氣平喘湯劑量的增加，上述哮喘相關癥狀逐漸減輕，表明降氣平喘湯可以改善哮喘模型大鼠生理反應變化。

HE染色結果提示，在哮喘發(fā)作期間，炎癥細胞浸潤到支氣管周圍，參與炎癥反應。經(jīng)醋酸潑尼松及降氣平喘湯干預后，炎癥細胞浸潤減少；且隨著降氣平喘湯劑量的增加，炎癥細胞浸潤依次減少，組織損傷程度逐漸減輕，表明降氣平喘湯可以有效減少肺組織的炎性滲出，改善組織損傷。Masson染色結果提示，經(jīng)OVA致敏的哮喘模型大鼠具有氣道上皮纖維化的病理變化，經(jīng)醋酸潑尼松及降氣平喘湯干預后，膠原纖維沉積的面積減小，且具有劑量依賴性。表明降氣平喘湯可以改善哮喘模型大鼠氣道上皮纖維化的病理變化。

α-SMA是存在于平滑肌細胞中一種豐富的蛋白質，其肌動蛋白絲可以產(chǎn)生細胞收縮和張力，維持細胞的結構和功能，與氣道重塑及哮喘嚴重程度密切相關[18]。研究發(fā)現(xiàn)，采用OVA致敏的哮喘大鼠模型α-SMA增加，具有氣道炎癥及氣道重塑的表型[19-20]。免疫組織化學結果提示，經(jīng)OVA致敏的哮喘模型具有氣道重塑表型，經(jīng)醋酸潑尼松及降氣平喘湯干預后，α-SMA蛋白表達下降，且具有劑量依賴性。表明降氣平喘湯可通過減少α-SMA蛋白表達來緩解氣道重塑的作用。

哮喘是一種由過度活化的Th2細胞介導的慢性炎性疾病，Th1免疫應答常被認為是哮喘等過敏性疾病的保護因素[21]。其中，Th1細胞分化的關鍵細胞因子TNF-α、IFN-γ在其中發(fā)揮了重要作用[22]。研究表明，哮喘的發(fā)生通常伴隨著免疫系統(tǒng)的不平衡，從Th1向Th2傾斜導致IFN-γ產(chǎn)生不足[23]；TNF-α增強氣道平滑肌收縮，這可能有助于氣道高反應性的發(fā)展[24]。當變應原進入低氣道時，樹突狀細胞將變應原呈遞給Th2細胞，Th2細胞分泌IL-5、IL-13，IL-5促進嗜酸性粒細胞向肺部聚集，IL-13直接致敏氣道平滑肌肉收縮，刺激上皮細胞分泌黏蛋白，并誘導纖維化。ELISA結果提示，與空白組相比，模型對照組TNF-α、IL-5、IL-13水平升高，IFN-γ水平下降，表明TNF-α、IL-5、IL-13具有促進炎癥反應的作用，IFN-γ具有抑制炎癥反應的作用；經(jīng)醋酸潑尼松及降氣平喘湯干預后，發(fā)現(xiàn)中藥低量組無明顯干預作用，潑尼松組及中藥中、高量組TNF-α、IL-5、IL-13水平下降，IFN-γ水平升高，且干預效果無明顯差異；上述結果表明降氣平喘湯可以通過調節(jié)Th1、Th2炎癥因子平衡來減輕氣道炎癥反應。

當過敏原等抗原出現(xiàn)后，幼稚的CD4+輔助性T細胞在不同細胞因子的刺激下分化成不同的亞群，而分化過程主要由譜系特異性轉錄因子如Th1、Th2驅動[25]，其分泌的TNF-α、IFN-γ、IL-5、IL-13細胞因子是JAK-STAT信號通路的關鍵因子，可通過不同的JAK和STAT蛋白信號傳導來參加哮喘的病理過程[22]。諸多實驗研究表明，炎癥因子及JAK/STAT信號通路與哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關[26-28]。本研究通過運用Western blot法檢測JAK1、JAK2及STAT3、STAT5、p-STAT3、p-STAT5蛋白表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，模型對照組JAK1、JAK2蛋白表達水平及p-STAT3/STAT3、p-STAT5/STAT5升高；經(jīng)過降氣平喘湯干預后，與模型對照組相比，中藥中、高量組JAK1、JAK2蛋白表達水平及p-STAT3/STAT3、p-STAT5/STAT5明顯下降，其中中藥高量組在JAK2蛋白及p-STAT3/STAT3、p-STAT5/STAT5較中藥中量組更低。另外，本研究也采用RT-PCR檢測了JAK1、JAK2 mRNA的相對表達水平。結果表明，與空白組相比，模型對照組JAK1、JAK2 mRNA的相對表達水平升高；經(jīng)過降氣平喘湯干預后，與模型對照組相比，中藥高量組的JAK1、JAK2 mRNA的相對表達水平下降；表明OVA致敏的哮喘模型大鼠可能與JAK-STAT信號通路有關，而降氣平喘湯可以通過調節(jié)JAK1、JAK2、p-STAT3、p-STAT5蛋白表達水平及JAK1、JAK2基因表達水平來改善哮喘炎癥情況。

綜上表明，降氣平喘湯可能通過調節(jié)Th1/Th2細胞因子平衡，進而調節(jié)JAK-STAT信號通路轉導來改善哮喘氣道炎癥及緩解氣道重塑。本研究通過OVA誘導大鼠哮喘模型，研究降氣平喘湯干預哮喘的作用機制，體現(xiàn)了中醫(yī)藥可以通過疾病的作用靶點來干預疾病，但仍有一定的不足，后續(xù)本研究團隊將加用抑制劑和激動劑來進一步證實降氣平喘湯通過調節(jié)JAK-STAT信號通路轉導干預哮喘。

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