華蟾素調(diào)控AKT介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制肝細(xì)胞癌肺轉(zhuǎn)移裸鼠模型的作用機制

通信作者：宋海燕，songhy@126.com（ORCID：0000-0003-2155-8110）；張春蕾，clzhang213@163.com（ORCID：0000-0002-3934-7816）

摘要：目的研究華蟾素通過調(diào)控肝細(xì)胞癌（HCC）上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）抑制HCC轉(zhuǎn)移的作用和機制。方法將36只6周齡雄性BALB/c裸鼠尾靜脈注射MHCC97H細(xì)胞建立肝癌肺轉(zhuǎn)移瘤模型，隨機分為華蟾素高、低劑量組和對照組。建模當(dāng)日起分別腹腔注射華蟾素120μL/kg、60μL/kg或生理鹽水，每周2次。8周后取肺組織行HE染色檢測肝癌肺轉(zhuǎn)移率。MHCC97H細(xì)胞用華蟾素高、低劑量（2.5μL/mL、5μL/mL）干預(yù)，通過劃痕實驗、RT-PCR以及Western Blot檢測細(xì)胞遷移能力和EMT相關(guān)分子的表達。用CoCl2孵育模擬低氧環(huán)境誘導(dǎo)MHCC97H細(xì)胞，同時加入高、低劑量華蟾素干預(yù)，通過劃痕實驗和Western Blot檢測華蟾素對低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移能力和EMT的影響。使用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析華蟾素對MHCC97H細(xì)胞的效應(yīng)機制。用Western Blot檢驗華蟾素干預(yù)對MHCC97H細(xì)胞的蛋白激酶B（AKT）、磷酸化AKT（P-AKT）表達水平的影響。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用成組t檢驗。結(jié)果華蟾素干預(yù)組裸鼠較對照組肝癌肺轉(zhuǎn)移率下降。與對照組相比，華蟾素干預(yù)使MHCC97H細(xì)胞劃痕愈合率減小、上皮型分子表達上調(diào)（t=2.860，Plt;0.05），并使EMT轉(zhuǎn)錄因子和基質(zhì)型分子下調(diào)（t值分別為3.545、2.022、2.852、2.341，P值均lt;0.05）。低氧誘導(dǎo)上調(diào)MHCC97H細(xì)胞劃痕愈合率和基質(zhì)型分子、EMT轉(zhuǎn)錄因子表達水平（P值均lt;0.05），華蟾素干預(yù)逆轉(zhuǎn)EMT變化并抑制劃痕愈合（P值均lt;0.05）。肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，華蟾素組與對照組存在顯著的基因差異，華蟾素主要影響了腫瘤、代謝、免疫和信號傳導(dǎo)相關(guān)基因表達，其中AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的差異基因數(shù)量最多。進一步檢測發(fā)現(xiàn)華蟾素干預(yù)可下調(diào)HCC細(xì)胞AKT、P-AKT和P-AKT/AKT的水平（t值分別為2.434、3.401、2.258，P值均lt;0.05）。結(jié)論華蟾素可抑制肝癌轉(zhuǎn)移，尤其對于低氧環(huán)境誘導(dǎo)的肝癌轉(zhuǎn)移具有顯著抑制作用，調(diào)控AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的HCC細(xì)胞EMT可能是其部分作用機制。

關(guān)鍵詞：癌，肝細(xì)胞；腫瘤轉(zhuǎn)移；華蟾素；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

基金項目：上海市青年科技英才揚帆計劃項目（20YF1450000）；龍華醫(yī)院科技創(chuàng)新項目（CX202205）；上海市衛(wèi)生健康委衛(wèi)生行業(yè)臨床研究專項（202040223）

Mechanism of action of cinobufotalin in inhibiting lung metastasis of hepatocellular carcinoma by regulating AKT-mediated epithelial-mesenchymal transition in a nude mouse model

YANG Yue1a，XU Siyu1a，WANG Jue1a，DU Shilin2，ZHANG Chunlei1a，SONG Haiyan1a.（1.a.Institute of Digestive Diseases，b.Department of Emergency，Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China；2.Department of Emergency，Zhongshan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China）

Corresponding authors：SONG Haiyan，songhy@126.com（ORCID：0000-0003-2155-8110）；ZHANG Chunlei，clzhang213@163.com（ORCID：0000-0002-3934-7816）

Abstract：Objective To investigate the effect and mechanism of cinobufotalin in inhibiting hepatocellular carcinoma（HCC）metastasis by regulating epithelial-mesenchymal transition（EMT）.Methods A total of 36 male BALB/cnude mice，aged 6 weeks，were given injection of MHCC97H cells via the caudal vein to establish a model of HCC lung metastasis，and then the mice were randomly divided into high-and low-dose cinobufotalin groups and control group.Since the day of modeling，the mice in the high-and low-dose cinobufotalin groups were given intraperitoneal injection of cinobufotalin at a dose of 120μL/kg and 60μL/kg，respectively，and those in the control group were given intraperitoneal injection of normal saline，twice a week.After 8 weeks，HE staining was performed for lung tissue to measure the lung metastasis rate of HCC.MHCC97H cells were treated with high-dose（2.5μL/mL）or low-dose（5μL/mL）cinobufotalin for 24 hours，and wound healing assay，RT-PCR，and Western blot were used to measure cell migration ability and the expression of EMT-related molecules.MHCC97H cells were induced in a simulated hypoxic environment with CoCl2 incubation，with high-and low-dose cinobufotalin added for intervention，and wound healing assay and Western blot were used to investigate the effect of cinobufotalin on cell migration ability and EMT induced by hypoxia.Transcriptome analysis was used to investigate the effect mechanism of cinobufotalin on MHCC97H cells，and Western blot was used to observe the effect of cinobufotalin on the expression levels of protein kinase B（AKT）and phosphorylated AKT（P-AKT）in MHCC97H cells.A one-way analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups，and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups；the independent-samples t test was used for comparison of categorical data between two groups.Results Compared with the control group，the cinobufotalin group had a significant reduction in the lung metastasis rate of HCC.Compared with the control group，cinobufotalin intervention reduced the wound healing rate of MHCC97H cells，upregulated the expression of epithelial-type molecules（t=2.860，Plt;0.05），and downregulated the expression of EMT transcription factors（EMT-TFs）and mesenchymal molecules（t=3.545，2.022，2.852，and 2.341，all Plt;0.05）.Hypoxia induction upregulated the wound healing rate of MHCC97H cells and the expression levels of mesenchymal molecules and EMT-TFs（Plt;0.05），and cinobufotalin intervention reversed EMT change and inhibited wound healing（Plt;0.05）.The transcriptome analysis of MHCC97H cells showed significant gene differences between the cinobufotalin group and the control group，and cinobufotalin mainly affected the expression of genes associated with tumor，metabolism，immunity，and signal transduction，with the largest number of differentially expressed genes in the AKT signal transduction pathway.Further measurement showed that cinobufotalin intervention downregulated the expression levels of AKT，P-AKT，and P-AKT/AKT in MHCC97H cells（t=2.434，3.401，and 2.258，all Plt;0.05）.Conclusion Cinobufotalin can inhibit the metastasis of HCC，especially hypoxia-induced HCC metastasis，and regulation of EMT mediated by the AKT signal transduction pathway in HCC cells might be one of its mechanisms of action.

Key words：Carcinoma，Hepatocellular；Neoplasm Metastasis；Hua Chan Su；Epithelial-Mesenchymal Transition

Research funding：Shanghai Youth Technology Talents Sailing Program（20YF1450000）；Longhua Hospital Technology Innovation Project（CX202205）；Clinical Research Special Project of Shanghai Municipal Health Commission（202040223）

肝癌是全球第六常見癌癥和第三癌癥相關(guān)死亡原因，在我國占癌癥死因的第二位，肝細(xì)胞癌（HCC）是其中最常見的類型［1-2］。HCC進展迅速，且具有高度侵襲轉(zhuǎn)移能力，易發(fā)生肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移，能通過手術(shù)切除患者僅占10%～15%，并且術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率高［3-4］，導(dǎo)致大多數(shù)HCC患者預(yù)后較差。近年來研究［5-6］顯示，腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）是其侵襲轉(zhuǎn)移能力增強的重要機制，成為現(xiàn)代抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療研究的關(guān)鍵靶標(biāo)。有多種因素可誘導(dǎo)HCC細(xì)胞發(fā)生EMT，如炎性微環(huán)境、肝纖維化、代謝應(yīng)激等，其中低氧是包括HCC在內(nèi)的實體瘤EMT的常見誘因［7］。

中醫(yī)藥在我國HCC治療中效果確切，單獨或聯(lián)合其他治療具有抑制進展、減少復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、延長生存期等作用。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝癌主要病機為本虛標(biāo)實、正虛邪實，正虛以脾虛為突出，邪實以邪氣內(nèi)蘊、熱毒血瘀等為突出，運用清熱解毒、疏肝理氣、活血散結(jié)等治法。蟾蜍在《新修本草》記載：“主邪氣，破癥堅血，癰腫，陰瘡，服之不患熱病”。華蟾素自中華大蟾蜍提取，是我國自行研制的二類新藥和國家中藥保護品種，具有清熱解毒、化瘀潰堅、利水消腫、止痛等功效，廣泛應(yīng)用于包含HCC在內(nèi)的中晚期腫瘤的治療。華蟾素聯(lián)合肝動脈插管灌注化療栓塞療效優(yōu)于常規(guī)藥物，并且能夠減輕肝癌患者肝臟炎癥，改善生存質(zhì)量［8-9］。實驗研究［10-11］發(fā)現(xiàn)華蟾素可以抑制HCC的生長和轉(zhuǎn)移，但其相關(guān)機制研究目前仍然缺乏。因此，本研究擬基于EMT調(diào)控，通過體內(nèi)外實驗研究華蟾素抑制HCC轉(zhuǎn)移的作用和相關(guān)機制。

1實驗方法

1.1動物實驗

1.1.1實驗動物和藥物5周齡雄性BALB/c裸鼠36只，

購自上海靈暢生物科技有限公司［許可證號為SCXK（滬）2018-0003；合格證編號為20180003031851］，飼養(yǎng)于龍華醫(yī)院SPF級動物房裸鼠室，飼養(yǎng)室內(nèi)溫度為（24±2）℃，濕度（55±10）%，光照時間12 h（8∶00—20∶00）。華蟾素注射液為安徽華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品（國藥準(zhǔn)字Z34020273，批號：22G110-1）。根據(jù)華蟾素的人常規(guī)劑量按照人鼠體表面積換算為低劑量，高劑量為低劑量的2倍。鑒于既往文獻［11］更低劑量無明顯效應(yīng)，因此本研究未使用更低劑量。ALT和肌酐檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司（貨號：C009-2-1，C011-2-1）。

1.1.2 HCC肺轉(zhuǎn)移裸鼠模型及藥物干預(yù)裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，尾靜脈注射1×106個MHCC97H細(xì)胞以建立HCC肺轉(zhuǎn)移模型［12］。隨機分為3組：華蟾素高劑量組（n=12）、華蟾素低劑量組（n=10）、對照組（n=12），建模當(dāng)日起分別腹腔注射華蟾素高（120μL/kg）、低劑量（60μL/kg）或生理鹽水，每周2次，持續(xù)8周。

1.1.3肺組織HE染色8周后麻醉處死裸鼠，取肺組織置于4%中性福爾馬林中固定24 h，隨后脫水、石蠟包埋，并進行連續(xù)切片，厚度為5μm/片。切片脫蠟后用蘇木素染色2 min，伊紅染色20 s，自來水沖洗后封片，在顯微鏡下拍攝。

1.1.4小鼠血清生化指標(biāo)檢測依據(jù)試劑盒說明檢測小鼠血清ALT和肌酐含量。

1.2細(xì)胞實驗

1.2.1實驗材料DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素（美國賽默飛世爾科技公司，貨號：11965092、15140122）、CoCl2（AR滬試，貨號：10007216）、Trizol（美國Life Technologies公司，貨號：15596018）、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA擴增試劑盒（艾科瑞生物，貨號：AG11706、AG11740）、RIPA蛋白裂解液（碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：P0013B）、微量BCA蛋白定量試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號：CW0014S）、ECL發(fā)光底物（美國Millipore公司，貨號WBKLS0500）?？贵w來源：vimentin、AKT、P-AKT、N-cadherin、Snail、EPCAM均購自武漢proteintech公司，貨號分別為10366-1-AP、10176-2-AP、66444-1-Ig、22018-1-AP、13099-1-AP、21050-1-AP；Slug、β-actin、HRP Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）購于武漢ABclonal公司，貨號分別為A1057、AC026、AS014。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞MHCC97H購于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所，培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、95％空氣濕度和5％CO2條件下培養(yǎng)。用含有150μmol/L CoCl2培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞，模擬低氧環(huán)境。

1.2.3劃痕實驗將5×105個MHCC97H細(xì)胞種植于6孔板中，待鋪滿后用10μL tip頭進行劃痕。加入高（5μL/mL）、低劑量（2.5μL/mL）華蟾素干預(yù)肝癌細(xì)胞。低氧實驗中加入CoCl2同時孵育，模擬低氧環(huán)境。24 h后觀察劃痕愈合情況，于顯微鏡下拍照并用Image J分析各組細(xì)胞遷移情況。

1.2.4 RT-PCR檢測提取細(xì)胞總RNA，運用Evo M-MLVRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物由上海閃晶分子生物科技有限公司合成，序列如下：hActin F：TGACGTGGACATCCGCAAAG，R：CTGGAAGGTGGACAGCGAGG；hE-cadherin F：AATTGC TCACATTTCCCAACTC，R：GATTTGATCTGAACCAGGTT TTTAG；hVimentin F：AAATGGCTCGTCACCTTCG，R：CAGATTAGTTTCCCTCAGGTTCA。應(yīng)用SYBR Green Pro Taq HSqPCR試劑盒在Stepone Plus儀器（美國Applied Biosystems公司）上進行PCR擴增，以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用2?△△Ct方法計算基因mRNA表達水平。

1.2.5 Western Blot檢測用RIPA裂解液超聲下裂解細(xì)胞提取蛋白，用BCA法檢測濃度。蛋白加入上樣緩沖液，經(jīng)95℃變性后用10%的SDS-PAGE電泳分離條帶。條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后加入抗β-actin（1∶50 000稀釋）、vimentin、N-cadherin（1∶5 000稀釋）、AKT、Snail、EpCAM、Slug（1∶1 000稀釋）或P-AKT（1∶2 000稀釋）抗體于4℃孵育過夜。然后膜加入二抗（1∶5 000稀釋），室溫孵育1 h，于ECL發(fā)光液反應(yīng)后用Tanon 4600生物發(fā)光成像儀（上海天能科技有限公司）進行條帶采集分析。1.3基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析華蟾素（5μL/mL）干預(yù)24 h的MHCC97H細(xì)胞及對照細(xì)胞，加入Trizol輕柔吹打后凍存，委托上海伯豪生物技術(shù)有限公司進行mRNA測序分析。RNA抽提質(zhì)檢合格后構(gòu)建測序文庫，使用Illumina NovaSeq6000平臺，用PE150（Pair-end 150 bp）模式進行測序。1.4統(tǒng)計學(xué)方法用SPSS 24.0和Graphpad Prism 9.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和作圖，計量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用成組t檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1華蟾素抑制HCC轉(zhuǎn)移裸鼠尾靜脈注射MHCC97H細(xì)胞并干預(yù)8周后，圖1a、b顯示肺組織連續(xù)切片HE染色結(jié)果。對照組裸鼠多數(shù)出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移灶，其肺轉(zhuǎn)移率為83%（12只裸鼠中10只出現(xiàn)轉(zhuǎn)移），華蟾素低劑量組肺轉(zhuǎn)移率60%（10只中有6只轉(zhuǎn)移），高劑量組肺轉(zhuǎn)移率50%（12只中有6只轉(zhuǎn)移），表明華蟾素對裸鼠HCC肺轉(zhuǎn)移具有干預(yù)作用。圖1c、d顯示，和對照組相比，用藥組血清ALT活力和肌酐含量的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均gt;0.05），表明華蟾素對裸鼠無肝腎毒性。

MHCC97H細(xì)胞劃痕實驗（圖2）顯示，劃痕24 h后，對照組細(xì)胞間隙明顯縮?。慌c對照組相比，華蟾素干預(yù)組劃痕愈合程度均減少（P值均lt;0.01）。提示華蟾素可抑制HCC細(xì)胞的遷移能力。

2.2華蟾素調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞EMT相關(guān)分子的表達水平為探索華蟾素影響肝癌轉(zhuǎn)移的機制，檢測了EMT相關(guān)分子的表達水平。RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，華蟾素高劑量干預(yù)的MHCC97H細(xì)胞E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的mRNA表達升高（Plt;0.05）、波形蛋白（vimentin）mRNA水平下降（Plt;0.05），華蟾素低劑量干預(yù)僅有降低趨勢（圖3a）。因此，后續(xù)實驗主要選用華蟾素高劑量。Western Blot結(jié)果如圖3b、c所示，與對照組相比，華蟾素處理的HCC細(xì)胞上皮型標(biāo)志物上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）的表達水平升高（t=2.860，Plt;0.01），而EMT轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug表達水平以及基質(zhì)型標(biāo)志物vimentin和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）表達水平降低（t值分別為3.545、2.022、2.852、2.341，P值均lt;0.05）。

2.3華蟾素對低氧誘導(dǎo)的HCC細(xì)胞遷移及EMT的作用肝癌作為一種實體瘤，瘤組織中往往存在血供不足造成的低氧微環(huán)境，這與EMT發(fā)生密切相關(guān)［7］，因此本研究進行了低氧誘導(dǎo)下細(xì)胞遷移能力及EMT相關(guān)檢測。劃痕實驗顯示，低氧誘導(dǎo)的MHCC97H細(xì)胞劃痕愈合率增加（Plt;0.05），華蟾素干預(yù)使其下調(diào)（P值均lt;0.05）（圖4a、b）。同時，低氧誘導(dǎo)使肝癌細(xì)胞EMT相關(guān)基質(zhì)型分子N-cadherin、vimentin和EMT轉(zhuǎn)錄因子Snail表達上調(diào)（P值均lt;0.05）；華蟾素可逆轉(zhuǎn)這些表達變化（P值均lt;0.05）（圖4c、d）。

2.4華蟾素干預(yù)的HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析mRNA sequence數(shù)據(jù)聚類分析熱圖顯示華蟾素組和對照組MHCC97H細(xì)胞間存在顯著的基因表達差異（圖5a）?；鹕綀D顯示華蟾素干預(yù)后共有3 112個基因表達差異，其中2 346個基因上調(diào)、766個基因下調(diào)（圖5b）。KEGG富集分析顯示，華蟾素主要影響了肝癌細(xì)胞與腫瘤、細(xì)胞生長運動、代謝、免疫和信號傳導(dǎo)等相關(guān)基因的表達（圖5c）。在信號傳導(dǎo)通路中，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)差異基因數(shù)量最多，有75個基因在華蟾素干預(yù)后表達發(fā)生改變，包括磷脂酰肌醇3-激酶調(diào)節(jié)亞基1（1PIK3R1）、磷酸酶PTEN、磷酸酶PHLPP2等表達上調(diào)，纖維連接蛋白1、血管內(nèi)皮生長因子α、血小板源性生長因子β等表達下調(diào)。

2.5華蟾素抑制HCC細(xì)胞PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，對MHCC97H細(xì)胞PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化水平進行檢測。結(jié)果顯示，和對照相比，華蟾素處理的HCC細(xì)胞中AKT、磷酸化AKT（phospho-AKT，P-AKT）及P-AKT/AKT水平均下調(diào)（t值分別為2.434、3.401、2.258，P值均lt;0.05）（圖6）。

3討論

臨床研究［13-14］顯示，華蟾素在肝癌、胰腺癌、肺癌、淋巴瘤等中晚期腫瘤中均表現(xiàn)出抑制腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用，可延長患者生存期，改善中晚期腫瘤患者生活質(zhì)量。另外，Meta分析［15］表明，與單獨TACE治療的HCC患者相比，TACE聯(lián)合華蟾素注射液輔助治療能夠顯著延長患者總生存期，提高患者生活質(zhì)量。華蟾素聯(lián)合解毒顆?？赏七t肝癌術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，提高術(shù)后生存率［16］。通過體內(nèi)實驗，本研究也證實華蟾素抑制裸鼠肝癌肺轉(zhuǎn)移的作用，體外實驗表明該作用可能由于其抑制HCC細(xì)胞的遷移能力。

研究［17］表明EMT與腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力密切相關(guān)。EMT是上皮型細(xì)胞轉(zhuǎn)換為具有運動能力的間充質(zhì)型細(xì)胞表型并伴隨有細(xì)胞黏附分子的表達和細(xì)胞骨架的改變［18］。在此過程中，受EMT轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist等調(diào)控，腫瘤細(xì)胞逐漸丟失上皮細(xì)胞的部分特征，如E-鈣黏蛋白水平下降，導(dǎo)致細(xì)胞的黏附力降低，同時獲得間質(zhì)細(xì)胞的某些特殊屬性，vimentin、N-cadherin等表達升高，使細(xì)胞骨架改變形態(tài)趨向紡錘形，細(xì)胞運動遷移能力增強，從而促進腫瘤細(xì)胞的擴散和轉(zhuǎn)移［19-21］。本研究發(fā)現(xiàn)華蟾素干預(yù)可下調(diào)EMT轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug及基質(zhì)型相關(guān)分子的表達，上調(diào)上皮型分子的表達水平，表明華蟾素可以抑制HCC細(xì)胞的EMT變化。

腫瘤生長迅速，對氧及能量物質(zhì)需求增加，且腫瘤組織內(nèi)往往血液供應(yīng)不足，有90%的實體腫瘤存在低氧微環(huán)境，其中HCC是低氧最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一［22-23］。研究［24］發(fā)現(xiàn)低氧能夠上調(diào)血管擴張劑刺激磷酸化蛋白（vasodilator-stimulated phosphoprotein，VASP）表達，VASP通過激活A(yù)KT和ERK信號通路促進EMT和基質(zhì)金屬蛋白的表達，促進HCC侵襲轉(zhuǎn)移。低氧誘導(dǎo)CSN8（COP9 signalosome subunits 8）在結(jié)直腸細(xì)胞中高表達，通過調(diào)控EMT促進結(jié)直腸細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力［25］。本研究應(yīng)用CoCl2模擬低氧環(huán)境，發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)使HCC細(xì)胞遷移能力較對照組增加，華蟾素干預(yù)使其明顯下調(diào)。并且低氧誘導(dǎo)加劇HCC細(xì)胞EMT，華蟾素干預(yù)使其逆轉(zhuǎn)。

為進一步探討華蟾素對肝癌的效應(yīng)機制，進行HCC細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。結(jié)果顯示，華蟾素影響了肝癌代謝、免疫、細(xì)胞生長運動等多方面，差異基因KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)華蟾素干預(yù)對PI3K/AKT信號通路影響顯著。PI3K/AKT被認(rèn)為是抑制腫瘤細(xì)胞EMT的重要信號通路［26-27］，激活該通路可調(diào)控EMT轉(zhuǎn)錄因子促進腫瘤細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化［28-29］。其中AKT是該信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵激酶。研究［30］發(fā)現(xiàn)，Osteoglycin（OGN）通過抑制PI3K/Akt信號激活，從而抑制乳腺癌細(xì)胞EMT，降低乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。PI3K/AKT信號通路也是TGF-β誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，抑制該通路可抑制EMT進而抑制肺癌轉(zhuǎn)移［31］。此外，藥物可通過調(diào)控PI3K/AKT信號介導(dǎo)抑制EMT效應(yīng)。如野黃芩苷可下調(diào)PI3K/AKT活化抑制黑色素瘤細(xì)胞EMT和血管生成［32］。蟾毒靈、黃酮苷可通過誘導(dǎo)PI3K/AKT信號失活從而抑制肝癌細(xì)胞EMT，發(fā)揮抗肝癌轉(zhuǎn)移的作用［33-34］。本研究結(jié)果顯示華蟾素干預(yù)HCC細(xì)胞可下調(diào)AKT的表達和活化水平。另外，PTEN及PHLPP2可下調(diào)AKT活化通路中的第二信使而具有負(fù)調(diào)控作用［35］，本研究中轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測到在華蟾素干預(yù)組上調(diào)這兩種蛋白磷酸酶。這些結(jié)果提示該藥物可能通過對PI3K/AKT信號調(diào)控抑制HCC細(xì)胞EMT。

綜上，本研究結(jié)果表明，華蟾素可抑制肝癌的轉(zhuǎn)移，尤其對于低氧環(huán)境誘導(dǎo)的肝癌轉(zhuǎn)移具有顯著抑制作用，其機制可能與通過調(diào)控AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)的HCC細(xì)胞EMT有關(guān)。本研究有助于闡釋華蟾素對肝癌效應(yīng)機制的認(rèn)識，為中醫(yī)藥治療肝癌提供科學(xué)依據(jù)。中藥提取物作用靶點廣泛復(fù)雜，因此后續(xù)本課題組將依據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)及體內(nèi)外實驗結(jié)果，對華蟾素調(diào)控EMT及其他肝癌生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機制進一步深入探討。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2019年4月18日經(jīng)由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批，批號：LHERAW-19017，符合實驗室動物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：楊悅、續(xù)嗣鈺、王玨、杜施霖參與收集數(shù)據(jù)，資料分析；楊悅負(fù)責(zé)撰寫論文；張春蕾、宋海燕負(fù)責(zé)課題設(shè)計，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：2023-12-20；錄用日期：2024-01-23

本文編輯：王亞南

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