通過加權基因共表達網(wǎng)絡和LASSO分析識別兒童呼吸道合胞病毒的診斷基因

摘 要 目的：運用生物信息學方法挖掘兒童呼吸道合胞病毒（RSV）的診斷標志物，為RSV的靶向治療提供依據(jù)。方法：從GEO中獲得RSV的基因表達數(shù)據(jù)集。運用差異表達分析、免疫浸潤分析、WGCNA和LASSO確定RSV的關鍵生物標志物。同時，繪制ROC曲線對關鍵基因的診斷性能進行評估。結(jié)果：共識別出592個差異基因和10種差異浸潤的免疫細胞，例如中性粒細胞。WGCNA和LASSO分析篩選出7個關鍵的生物標志物，包括ADM、LTF、UBE2J1、PDK4、S100A4、BST1、CAMP。此外，ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)這些基因具有較高的診斷價值。結(jié)論：篩選的7個基因可作為RSV的診斷生物標志物。

關鍵詞 呼吸道合胞病毒 診斷基因 中性粒細胞 加權基因共表達網(wǎng)絡分析

中圖分類號：R446.9； R725.1 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2024）19-0063-09

引用本文 董海麗， 王國勝， 谷雙龍， 等. 通過加權基因共表達網(wǎng)絡和LASSO分析識別兒童呼吸道合胞病毒的診斷基因[J]. 上海醫(yī)藥， 2024， 45（19）： 63-71.

Identification of diagnostic genes related to respiratory syncytial virus in children based on WGCNA and LASSO algorithms

DONG Haili， WANG Guosheng， GU Shuanglong， SONG Nanping

（Department of Pediatrics， Zhengzhou 460 Hospital， Zhengzhou 450000， China）

ABSTRACT Objective： The diagnostic biomarkers of respiratory syncytial virus （RSV） in children were explored by bioinformatics analysis to provide basis for targeted therapy of RSV. Methods： Gene expression profiles of RSV were obtained from the GEO database. Differential expression analysis， immune infiltration analysis， WGCNA and LASSO were applied to identify the key biomarkers of RSV. Meanwhile， ROC curve was utilized to evaluate the diagnostic performance of key genes. Results： A total of 592 differentially expressed genes and 10 differential immune cells （such as neutrophils） were identified between RSV and healthy samples. Further， WGCNA and LASSO analysis screened out seven key biomarkers， including ADM， LTF， UBE2J1， PDK4， S100A4， BST1， and CAMP. In addition， ROC curve showed that these genes had high diagnostic value. Conclusion： The identified seven biomarkers may serve as diagnostic biomarkers for RSV.

KEY WORDS respiratory syncytial virus； diagnostic genes； neutrophils； weighted gene co-expression network analysis

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是全球兒童呼吸道感染的主要原因[1]。據(jù)統(tǒng)計，每年有210萬5歲以下的兒童因RSV感染需要門診治療或住院，并且在全世界28 d至6個月的嬰兒中，RSV疾病的總死亡率負擔為1/28[2-3]。因此，迫切需要有效的RSV預防策略來解決這一重大公共衛(wèi)生問題和負擔。帕利珠單抗廣泛的用于預防嬰兒RSV疾病[4]。盡管其藥效已經(jīng)得到證實，但是尚未引進國內(nèi)臨床應用[5]。迄今為止，RSV疫苗仍然處于開發(fā)階段。此外，診斷RSV感染的有效方法也十分有限。所以，了解RSV感染的分子發(fā)病機制對于指導未來的診斷和治療至關重要。目前，已有研究旨在尋找RSV的診斷標志物，揭示其潛在的分子機制[6-7]。但是，識別RSV診斷生物標志物的相關研究仍然缺乏。本研究利用一系列生物信息學分析旨在探討與RSV中免疫浸潤細胞相關的關鍵生物標志物。本工作將有望為提高RSV患者的診斷以及治療靶點的開發(fā)提供幫助。

1 材料和方法

1.1 表達譜數(shù)據(jù)的收集和預處理

從NCBI GEO數(shù)據(jù)庫中下載6個兒童RSV芯片數(shù)據(jù)集，包括GSE188427、GSE105450、GSE103842、GSE103119、GSE80179、GSE77087。其中，GSE188427包括353個樣本，來自于51個健康志愿者和302個RSV患者的全血樣本，在本研究中作為訓練集。其余數(shù)據(jù)集作為模型驗證數(shù)據(jù)集。另外，使用R語言中的affy包對下載的數(shù)據(jù)進行預處理，并使用rma函數(shù)進行歸一化處理。

1.2 基因差異表達分析

通過limma包對健康和RSV患者中的基因進行差異表達分析，計算基因相應的P值和logFC值。同時，利用FDR方法對P值進行多重檢驗校正，得到P-adjust（Benjamini-Hochberg校正）。差異表達基因（differential expressed genes，DEGs）的閾值為：P-adjust<0.05和|logFC|>1.2。

1.3 GSEA功能分析

為了探索疾病組和正常組之間的差異調(diào)節(jié)通路，使用GSEA（V4.3.2）對DEGs進行功能富集分析，包括GO-BP、KEGG和Reactome。顯著富集的閾值為P-adjust<0.05。

1.4 免疫微環(huán)境分析

基于患者和對照樣本的基因表達數(shù)據(jù)，利用CIBERSORT對樣本中22種免疫細胞的比例進行計算。隨后，運用Wilcox檢驗比較了兩組間免疫細胞浸潤水平的差異。

1.5 WGCNA分析

使用WGCNA篩選與RSV有關的關鍵基因。通過篩選中位數(shù)絕對偏差（median absolute deviation，MAD）排名前75%且MAD值>0.01的基因進行共表達分析（13 963個基因）。隨后，計算每個模塊與差異的免疫細胞浸潤程度之間的相關性。獲得與免疫細胞最相關的模塊后（又稱為hub模塊），將模塊基因與DEGs取交集，從而得到與免疫細胞浸潤相關的關鍵基因用于后續(xù)分析。

1.6 關鍵基因的功能富集分析

利用DAVID 2021對這些基因進行GO功能和KEGG通路富集分析。選取P-adjust<0.05作為顯著富集的閾值。

1.7 診斷基因篩選

運用R4.3.1語言中的glmnet包（V4.1-7）從關鍵基因中篩選診斷基因。首先，進行單因素logistic回歸分析，選取P<0.05的基因進行后續(xù)分析。接下來，利用LASSO分析來篩選RSV的診斷基因。LASSO回歸分析在R軟件中運行10次K交叉驗證，用于對包含的變量進行居中和歸一化處理，然后選擇最佳的l值。

1.8 列線圖的構(gòu)建

通過rms包繪制包括診斷基因的列線圖來判斷RSV患病的風險率，并且繪制校正曲線來驗證模型的準確性。

1.9 外部數(shù)據(jù)集驗證

在5個驗證隊列中，對診斷基因在健康對照和RSV樣本中的表達水平進行比較。隨后，利用pROC包繪制診斷基因的ROC曲線，通過計算AUC值評估基因的預測性能。

2 結(jié)果

2.1 DEGs篩選和GSEA富集分析

在RSV和對照中共篩選到592個DEGs，包括453個上調(diào)和139個下調(diào)基因。GSEA結(jié)果揭示這些基因主要富集在380個GO-BP類目，57個KEGG通路和149個Reactome通路。圖1展示了NES排名前5的結(jié)果。

2.2 RSV和健康對照患者呈現(xiàn)不同的免疫景觀

10種免疫細胞的浸潤水平在兩組中有顯著差異（圖2A和2B）。在RSV樣本中，活化樹突狀細胞（activated dendritic cells）、M0型巨噬細胞（M0 macrophages）、活化肥大細胞（activated mast cells）、中性粒細胞（neutrophils）、活化CD4記憶T細胞（activated T cells CD4 memory）的豐度遠高于對照樣本，而native B細胞（native B cells）、嗜酸性粒細胞（eosinophils）、靜息肥大細胞（resting mast cells）、靜息自然殺傷細胞（resting NK cells）、天然CD4 T細胞（native T CD4 cells）的豐度低于對照樣本。

2.3 利用WGCNA識別關鍵模塊

如圖3A所示，當軟閾值為6時（對應的R2為0.75），滿足網(wǎng)絡的無標度拓撲，且平均連通性高。通過基因相關性構(gòu)建層次聚類樹狀圖，共識別出20個相似的基因模塊（圖3B）。隨后，以免疫浸潤程度作為表型，分析模塊特征值與10種差異免疫細胞之間的相關性。包含991個基因的“MEYellow”模塊與中性粒細胞具有較強的相關性，皮爾森相關系數(shù)為0.84（圖3C）。因此認為“MEYellow”模塊為hub模塊，其中包含的基因用于后續(xù)分析。

2.4 RSV中關鍵差異基因的篩選和功能富集分析

將DEGs和“MEYellow”模塊基因整合，得到232個重疊的基因（圖4A）。對這些關鍵基因進行功能富集分析。GO富集分析結(jié)果顯示，基因主要影響細胞因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of cytokine production）（GO-BP）、分泌顆粒腔（secretory granule lumen）（GO-CC）、模式識別受體活性（pattern recognition receptor activity）（GO-MF）（圖4B～D）。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)基因在中性粒細胞胞外陷阱的形成（neutrophil extracellular trap formation）等通路中顯著富集（圖4E）。

2.5 RSV中診斷基因的鑒定

為了進一步識別核心的診斷基因，基于lambda值進行了LASSO回歸分析。共識別出7個RSV中最具代表性的診斷基因，包括ADM、LTF、UBE2J1、PDK4、S100A4、 BST1、CAMP（圖5A～C）。隨后，基于這7個診斷生物標志物，建立了預測RSV的列線圖模型（圖5D）。校準曲線顯示疾病的預測概率和實際發(fā)生概率之間的誤差很小，表明列線圖對RSV患者的預測準確性較高（圖5E）。

2.6 生物標志物的驗證

利用5個外部驗證數(shù)據(jù)集對7個特征基因的表達和診斷效能進行驗證（圖6）。與對照組相比，RSV組中7個基因的mRNA水平呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，尤其是S100A4、CAMP、ADM、BST1（均P<0.05）。在5個數(shù)據(jù)集中，診斷基因聯(lián)合模型的AUC值均大于0.9，表明模型具有較高的分類性能。此外，還對每個基因進行了ROC分析。在5個驗證集中，ADM、UBE2J1、S100A4、BST1、CAMP的AUC值均大于0.7。這些結(jié)果表明篩選的特征標志物在RSV中顯示出良好的診斷效能。

3 討論

有證據(jù)表明天然免疫應答的不同組成部分參與RSV感染的控制，且適當?shù)墓逃忻庖邞鹪赗SV感染的消退中具有重要的作用[8-9]。所以，RSV的免疫病理學機制的研究有助于疫苗的研發(fā)。

本研究發(fā)現(xiàn)中性粒細胞在RSV中的浸潤水平顯著增加。已有研究報道了RSV感染與中性粒細胞之間的相關性。臨床研究發(fā)現(xiàn)，RSV感染后，約80%浸潤的細胞是中性粒細胞，并且其強烈的內(nèi)流是RSV誘導的急性下呼吸道感染的氣道炎癥的常見特征[10-11]。另外，RSV感染中的中性粒細胞氣道炎癥會導致黏液生成過多、上皮損傷和氣道重塑，進而引起肺功能損傷和肺部疾病[12]。因此，在RSV感染期間靶向中性粒細胞可能是改善患兒的不良肺部預后的潛在治療方法。后續(xù)的分析中，本研究重點關注了中性粒細胞相關的關鍵基因。

結(jié)合WGCNA和LASSO回歸分析，最終確定了7個具有診斷性能的生物標志物，包括ADM、LTF、UBE2J1、PDK4、S100A4、BST1、CAMP。ROC分析發(fā)現(xiàn)這些基因均具有良好的診斷性能。氣道ADM的異常表達可能導致上皮和黏膜功能失調(diào)，與哮喘的發(fā)生和發(fā)展有關，并可能是預測社區(qū)獲得性肺炎死亡率的一個關鍵的生物標志物[13-14]。UBE2J1在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上可降解錯誤折疊的蛋白質(zhì)，其過表達可增強登革熱病毒感染，并且該基因可通過影響泛素化過程在重癥COVID-19患者中起關鍵作用[15-16]。S100A4在炎癥過程中發(fā)揮重要作用。已有證據(jù)表明其與淋巴細胞計數(shù)呈正相關，因此該基因參與哮喘氣道炎癥的發(fā)病機制[17]。BST1可抑制中性粒細胞通過內(nèi)皮層的浸潤，發(fā)揮抗炎特性[18]。CAMP（又稱為LL-37）具有抗菌、細胞趨化和炎癥反應調(diào)節(jié)功能[19]。RSV感染后可誘導氣道上皮細胞表達LL-37，并且該基因可能是先天性宿主抵抗RSV感染的重要靶點[20]。LTF編碼的蛋白在中性粒細胞的次級顆粒中發(fā)現(xiàn)，具有已知的抗病毒活性，包括RSV[21]。兒童膿毒癥心肌病患者的血清中PDK4水平顯著升高，并且與疾病的嚴重程度和器官損傷密切相關[22]。總而言之，這些研究證實篩選出來的基因均與炎癥相關的疾病有關，可間接或直接地參與RVS的發(fā)生。

本研究還發(fā)現(xiàn)基因主要富集在“中性粒細胞胞外陷阱的形成”通路中。在RSV患兒的氣道中觀察到大量的中性粒細胞募集，而激活的中性粒細胞可釋放中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular trap，NETs）[23]。研究發(fā)現(xiàn)NETs能夠捕獲RSV，從而阻止病毒顆粒與靶細胞結(jié)合，防止感染。然而，NETs的大量產(chǎn)生會阻塞氣道并損害肺功能，從而加重嬰幼兒感染的炎癥癥狀[24]。因此，必須嚴格調(diào)控NETs的形成[25]。然而，NETs在RVS感染下的有益和有害影響之間的界限仍未揭示，所以尋找一種靶向NETs及其相關蛋白的理想療法是亟待解決的一個挑戰(zhàn)。

我們的工作首次利用WGCNA結(jié)合LASSO方法識別了RSV的特異性診斷生物標志物，加深了對其發(fā)病機制的認識。然而，這些發(fā)現(xiàn)均是通過生物信息學分析得到的，還需要通過體內(nèi)和體外實驗來探索這些基因在RSV中的具體作用。

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