微生物實驗教學(xué)中微波爐對廢菌滅活處理方法的探索

摘"要：高校微生物教學(xué)中菌類相關(guān)課程較多，為了降低廢菌對實驗室生物安全的威脅，避免其損害學(xué)生及教師的生命健康，本文以實驗室常用的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、青霉、根霉和黃曲霉為例，利用微波爐對其進(jìn)行不同時長的照射處理，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)菌在固體和液體環(huán)境中的滅活分別需要3min和2min，三種霉菌在固體和液體環(huán)境中的滅活分別需要2min和1.5min。該廢菌滅活方案造價低、易操作、耗時短、效率高，適用于本科微生物教學(xué)實驗室中學(xué)生的使用。因此可以安排在相關(guān)實驗教學(xué)課程當(dāng)中，并推廣至醫(yī)學(xué)、科研類實驗室。

關(guān)鍵詞：高校微生物教學(xué)；生物安全；廢菌；微波爐；滅活

中圖分類號：Q933""文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

1"高校本科微生物教學(xué)實驗室生物安全現(xiàn)狀

高校微生物實驗課主要是為了讓學(xué)生掌握各類微生物相關(guān)的實驗基本操作，其中“細(xì)菌革蘭氏染色與形態(tài)觀察”“霉菌制片與形態(tài)觀察”是微生物實驗課中較為重要的課程，該實驗教學(xué)目的是讓學(xué)生掌握細(xì)菌和霉菌形態(tài)觀察的制片方法，并認(rèn)識其形態(tài)結(jié)構(gòu)，從而把理論的、抽象的知識具體化，鍛煉學(xué)生動手操作能力，培養(yǎng)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣。然而，該課程的開展也引起了以下一些問題。

1.1"實驗室環(huán)境復(fù)雜

進(jìn)入實驗室的本科生基數(shù)較大，需要的細(xì)菌和霉菌的實驗材料較多。微生物隨著實驗操作過程中產(chǎn)生的氣溶膠而擴(kuò)散［1］，其中霉菌會附著在空氣中的塵埃里［2］，因此實驗結(jié)束后，如果這些材料沒有得到及時滅活處理，會造成實驗室的嚴(yán)重污染。目前各類呼吸道流行傳染疾病較為高發(fā)，實驗室微生物污染不僅會影響學(xué)生實驗結(jié)果，還會增加教師和學(xué)生呼吸道感染、皮膚過敏等疾病的發(fā)病概率［3］。

1.2"學(xué)生缺乏實驗室經(jīng)驗

進(jìn)入高校本科教學(xué)實驗室的群體主要是毫無科研實驗經(jīng)歷的本科生，他們對實驗原理理解不夠深入、儀器使用不熟練、藥品材料性能不了解、缺乏實驗應(yīng)變能力，加之本科生基數(shù)較大，課程時間有限，教師很難做到一對一詳細(xì)的實驗指導(dǎo)和監(jiān)督，這些因素給實驗室的廢菌處理工作增加了一定的難度。

1.3"微生物滅活方法不適用

目前常用的微生物滅活方法較多，物理方法如加熱、紫外線［4］等，然而加熱不徹底會造成二次污染，紫外線照射的范圍有限，效果不定；化學(xué)方法如漂白水、酸堿試劑和酒精等，該方法藥品用量較大，并且細(xì)菌的細(xì)胞壁成分復(fù)雜，對消毒劑的敏感程度具有選擇性，更有大量的化學(xué)殘留；生物療法如抗生素等，造價太高［56］。

經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，微波的產(chǎn)熱功能能夠殺滅微生物［7］，并且病原微生物的細(xì)胞液吸收微波的能力強(qiáng)于周圍其他物質(zhì)，因此微波可以殺滅細(xì)菌、霉菌、病毒和細(xì)菌芽孢［8］。微波爐具有熱效率高、耗電量小、方便快捷等特點(diǎn)，現(xiàn)今在普通家庭生活和實驗室中使用非常普遍。實驗設(shè)定了固體和液體滅菌環(huán)境、不同的微波爐照射時間，從而對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、青霉、根霉和黃曲霉進(jìn)行滅活處理，以確認(rèn)微波爐對菌類滅活的有效性。

2"基于微波爐的廢菌滅活實驗

2.1"實驗儀器與材料

2.1.1"實驗儀器

微波爐（美的M1231E）、立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安LDZX50KBS）、培養(yǎng)箱（博迅）等。

2.1.2"菌種

大腸桿菌（ATCC35218）、枯草芽孢桿菌（CMCC63501）、青霉（ATCC36839）、根霉（GM10）、黃曲霉（ATCC9643），購自普通微生物菌種保藏中心，本室傳代保存。

2.1.3"培養(yǎng)基制備

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl"5g、瓊脂10g、水1000mL。土豆PDA培養(yǎng)基：土豆200g、瓊脂10g、葡萄糖20g、水1000mL。

2.2"實驗設(shè)計

2.2.1"固體培養(yǎng)基中菌類滅活

將準(zhǔn)備好的不同細(xì)菌和霉菌玻璃平板（每個平板內(nèi)帶菌固體培養(yǎng)基10g）置于微波爐托盤中央高火照射至預(yù)定時間，取出放涼后，拿至超凈工作臺中分別接種至牛肉膏蛋白胨和土豆PDA固體斜面（已滅菌），培養(yǎng)箱37℃和28℃，逐日觀察是否有對應(yīng)菌長出。

2.2.2"液體培養(yǎng)基中菌類滅活

取準(zhǔn)備好的不同細(xì)菌和霉菌菌液（OD600=0.8）10mL于三角瓶中，將其置于微波爐托盤中央高火照射至預(yù)定時間，取出放涼后，拿至超凈工作臺中分別接種至牛肉膏蛋白胨和土豆PDA固體斜面（已滅菌），培養(yǎng)箱37℃和28℃，逐日觀察是否有對應(yīng)菌長出。

2.2.3"數(shù)據(jù)統(tǒng)計

周滅活率=（該組總樣品數(shù)-周長菌樣品數(shù)）/該組總樣品數(shù)×100%，本文實驗次數(shù)大于等于3，圖表中為平均滅活率。

2.3"實驗結(jié)果

2.3.1"微波爐對細(xì)菌的滅活效果

如表1所示，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌在固體和液體環(huán)境中，分別經(jīng)微波爐照射180s和120s，基本可達(dá)到廢菌滅活效果。有研究發(fā)現(xiàn)微波爐對革蘭陰性桿菌的作用強(qiáng)于革蘭陽性菌［9］，這與本文的結(jié)果也是相符的。然而消毒滅菌的效果與樣本量也有著十分明顯的正相關(guān)關(guān)系，因此在實際應(yīng)用過程中，需要根據(jù)廢菌重量、體積和濃度設(shè)定好微波爐照射時間。

2.3.2"微波爐對霉菌的滅活效果

通過對微波爐照射后接種的青霉斜面觀察，無論固體還是液體環(huán)境中，微波爐照射30s滅活率可達(dá)到50%，照射60s菌體基本已完全被滅活，照射90s可達(dá)到100%；根霉在固體和液體環(huán)境中分別照射120s和90s菌體基本已完全被滅活；黃曲霉在固體和液體環(huán)境中分別照射120s和90s可達(dá)到100%的滅活率（表2）。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)：（1）三種霉菌經(jīng)微波爐照射后生長較為緩慢，這說明微波爐的輻射對霉菌產(chǎn)生了較大的損傷；（2）青霉在固體和液體環(huán)境中的滅活所需的微波爐照射時間基本相似，且與根霉和黃曲霉相比更容易被滅活；（3）根霉和黃曲霉在液體環(huán)境中更容易被滅活。

綜上所述，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌若在固體環(huán)境中需要經(jīng)微波爐照射3min，在液體環(huán)境中需要照射2min可達(dá)到完全的滅活；青霉無論在液體還是固體環(huán)境中，經(jīng)微波爐照射1.5min可達(dá)到完全的滅活；根霉和黃曲霉在液體和固體環(huán)境中，分別經(jīng)微波爐照射1.5min和2min可達(dá)到完全的滅活。根據(jù)以上數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：（1）微波爐對霉菌的滅活比細(xì)菌效率高，這可能是由于霉菌的孢子暴露在空氣中，更容易被滅活；（2）液體環(huán)境中微波爐的滅菌效率更高。

因此，在“菌類的制片與形態(tài)觀察實驗”實驗結(jié)束之后，要求學(xué)生將廢棄固體廢菌置于玻璃平皿或者燒杯中，液體廢菌置于三角瓶或者燒杯中，按照下圖進(jìn)行廢菌處理。由于微波爐對細(xì)菌和霉菌的滅活率與其種類、質(zhì)量、體積和濃度有關(guān)，因此在應(yīng)用中要根據(jù)實際情況設(shè)定好微波爐照射時間，經(jīng)滅活處理后再丟棄，并清洗相關(guān)器具。該方法處理比較集中、造價低、耗時短、使用便捷、易操作，非常適用于實驗技能較薄弱的本科生。

3"實驗教學(xué)實施過程及時間安排

在菌類的制片與形態(tài)觀察課程中，教師需要在講述實驗原理和操作之后，向?qū)W生講述微波爐滅活的細(xì)節(jié)和方法及生物安全的重要性，讓學(xué)生理解接受實驗后對廢菌處理的方法和必要性。表3中的4—7步驟為該課程加入的四個步驟。學(xué)生實驗完成后，要求學(xué)生按照“三步法”完成實驗室消毒工作，第1步，按照文中實驗得到的結(jié)論（上圖）以微波爐法處理固體或者液體廢菌，本文在實驗中每個樣品量較少，如果學(xué)生廢棄樣品重量或者體積較大，需要延長微波爐照射時間，以確保滅活的有效性；第2步，用75%的酒精清潔實驗室臺面、地面及空氣；第3步，用75%的酒精處理垃圾桶，并清理垃圾。在實驗室清理消毒過程中，教師做好監(jiān)督管理，避免學(xué)生將活菌直接丟在垃圾桶當(dāng)中。

4"教學(xué)討論及反思

在以往的實驗教學(xué)中，實驗人員會在學(xué)生實驗下課之后進(jìn)行廢菌處理，并對教室進(jìn)行消毒清理，這種方法雖然減輕了課程壓力，但是導(dǎo)致學(xué)生忽視病原菌類的危害性、生物安全的緊迫性和實驗室環(huán)境安全的重要性，并在實驗過程中過度放松隨意，引起個人及實驗室大面積的廢菌污染。菌類的制片與形態(tài)觀察課程實驗較為簡單，學(xué)生基本在一個課時之內(nèi)就能完成實驗及結(jié)果觀察分析，將生物安全的講解、廢菌處理、實驗室環(huán)境衛(wèi)生清理納入該課程具有可行性和必要性。這部分課程內(nèi)容的加入讓學(xué)生在實驗操作中保持對微生物的警惕性，在實驗后能夠認(rèn)真積極地應(yīng)用微波爐進(jìn)行廢菌處理和實驗室衛(wèi)生清理，一方面分擔(dān)了實驗室工作強(qiáng)度，維持了良好的實驗室環(huán)境，另一方面讓學(xué)生在掌握實驗技術(shù)的過程中，加強(qiáng)生物安全、實驗室環(huán)境安全和生態(tài)安全的意識，為自己和他人的生命健康安全負(fù)起責(zé)任。

目前已有微生物實驗室［10］和臨床細(xì)菌檢驗中［11］對常用培養(yǎng)基、相關(guān)器具［12］、實驗服［13］等進(jìn)行微波爐滅菌處理。因此，在微生物教學(xué)實驗室中，可以利用微波爐的滅菌功能對相關(guān)器具材料進(jìn)行處理，從而保證學(xué)生的實驗順利開展，該方法極大地節(jié)約了時間及能源。此外，不同實驗室由于實驗內(nèi)容和微生物污染的種類不同，其他醫(yī)療衛(wèi)生、食品、科研機(jī)構(gòu)應(yīng)根據(jù)本實驗室的實際情況設(shè)定微波爐滅活方案，并結(jié)合多種方法來維護(hù)實驗室生物安全。

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