茶樹‘大面白’線粒體基因組結(jié)構(gòu)特征及其密碼子偏好性分析

摘要：茶樹‘大面白’（Camellia sinensis cv. ‘Damianbai’）是上饒市廣信區(qū)自主培育的國家級品種，其線粒體基因組結(jié)構(gòu)特征及密碼子偏好性尚不清楚。以‘大面白’為試驗(yàn)材料，采用高通量測序技術(shù)對其線粒體全基因組進(jìn)行測序、組裝、注釋，采用生物信息學(xué)軟件對其線粒體基因組的結(jié)構(gòu)特征和密碼子偏好性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，‘大面白’線粒體基因組全長886 354 bp，結(jié)構(gòu)為完整單環(huán)狀分子，GC含量為45.76%；共注釋到78個(gè)功能基因，包括41個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，33個(gè)tRNA基因，4個(gè)rRNA基因；共檢測到59個(gè)SSR（主要為A/T單核苷酸重復(fù)）和100個(gè)Long repeat（主要為正向重復(fù)和回文重復(fù)）。‘大面白’線粒體基因組密碼子偏好性較弱，密碼子偏好以A/U結(jié)尾，密碼子使用偏好性主要受自然選擇的影響，受內(nèi)部突變壓力的影響?。弧竺姘住€粒體基因組的最優(yōu)密碼子為14個(gè)（AAU、GAU、CAU、UUU、AUU、GCU、GGA、ACU、GUU、CGA、UUA、UUG、UCA、UCU）。11個(gè)近緣物種的線粒體基因組在基因區(qū)與‘大面白’線粒體基因組具有高度同源性；‘大面白’線粒體基因組與‘凌云白毫’（ON782577）線粒體基因組的共線性最高，兩者的基因排列順序基本一致；‘大面白’線粒體基因組與其葉綠體基因組之間具有62個(gè)高度同源性的基因片段；‘大面白’與‘凌云白毫’單獨(dú)聚成一小分支，兩者親緣關(guān)系較近。本研究分析了‘大面白’線粒體基因組序列特征及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系，為加強(qiáng)‘大面白’種質(zhì)鑒定及其資源多樣性的開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：‘大面白’；線粒體基因組；結(jié)構(gòu)特征；密碼子偏好性

中圖分類號：S571.1；Q52" " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A" " " " " " " 文章編號：1000-369X（2025）01-0061-18

Analysis of the Structural Characteristics and Codon Usage Biase of the Mitochondrial Genome in

Tea Cultivar ‘Damianbai’

YIN Minghua1，2， ZHANG Mutong1， XU Zilin1， OUYANG Qian1， WANG Meixuan1， LI Wenting1

1. College of Life Sciences， Shangrao Normal University， Shangrao 334001， China;

2. Key Laboratory of Protection and Utilization of Medicinal and Edible Plant Resources in Shangrao， Shangrao 334001， China

Abstract： Camellia sinensis cv. ‘Damianbai’ is a national cultivar in Guangxin District， Shangrao. Its mitochondrial genome structure and codon preference are still unclear. Using ‘Damianbai’ as the experimental material， high-throughput sequencing technology was used to sequence， assemble， and annotate the entire mitochondrial genome of ‘Damianbai’. Bioinformatics software was used to analyze the structural characteristics and codon preferences of its mitochondrial genome. The results show that the mitochondrial genome of ‘Damianbai’ was 886 354 bp in length， with a complete single circular molecule structure and a GC content of 45.76%. A total of 78 functional genes were annotated in the mitochondrial genome of ‘Damianbai’， including 41 protein-coding genes， 33 tRNA genes and 4 rRNA genes. A total of 59 SSRs （mainly A/T single nucleotide repeats） and 100 Long repeats （mainly positive and palindromic repeats） were detected in the mitochondrial genome of ‘Damianbai’. The codon bias of the mitochondrial genome in ‘Damianbai’ is relatively weak， with a preference for codons ending in A or U. The codon usage bias of the mitochondrial genome of ‘Damianbai’ is mainly influenced by natural selection， and is less affected by internal mutation pressure. The optimal codons for the mitochondrial genome of ‘Damianbai’ are 14 （AAU， GAU， CAU， UUU， AUU， GCU， GGA， ACU， GUU， CGA， UUA， UUG， UCA， UCU）. The mitochondrial genomes of 11 closely related species exhibit high homology with the mitochondrial genome of ‘Damianbai’ in the gene region. The mitochondrial genomes of ‘Damianbai’ and ‘Lingyunbaihao’ （ON782577） have the highest collinearity， and their gene arrangement orders are basically the same. There are 62 highly homologous gene fragments between the mitochondrial genome and chloroplast genome of ‘Damianbai’. ‘Damianbai’ and ‘Lingyunbaihao’ belong to a small branch separately， indicating they are closely related. This study analyzed the mitochondrial genome sequence characteristics and phylogenetic relationships of ‘Damianbai’， providing a reference for strengthening the identification of ‘Damianbai’ germplasm and the development and utilization of its resource diversity.

Keywords： Camellia sinensis cv. ‘Damianbai’， mitochondrial genome， structural features， codon usage biase

茶樹（Camellia sinensis）為山茶科山茶屬多年生植物，是重要的經(jīng)濟(jì)作物。茶葉中含有茶多酚、咖啡堿、茶氨酸、茶多糖等多種活性物質(zhì)，具有抗氧化、降血糖、防癌抗癌、增強(qiáng)免疫力等功效[1-2]。茶樹種質(zhì)資源是茶樹新品種選育的基礎(chǔ)，育種工作者可以借助現(xiàn)代生物技術(shù)在種質(zhì)資源的基礎(chǔ)上加快茶樹的育種進(jìn)程[3]。目前，隨著茶樹品種的應(yīng)用和推廣，由于對一些特有茶樹地方種質(zhì)資源的農(nóng)藝性狀、基因組成等信息缺乏認(rèn)識，導(dǎo)致部分具有特異性狀和功能成分的茶樹地方種質(zhì)資源逐漸丟失，嚴(yán)重影響了茶樹遺傳多樣性的保護(hù)及特異種質(zhì)資源的挖掘和創(chuàng)新[4]。‘大面白’（C. sinensis cv. ‘Damianbai’）原產(chǎn)于江西省上饒市上瀘鄉(xiāng)洪水坑，1985年全國農(nóng)作物品種審定委員會(huì)認(rèn)定‘大面白’為國家級品種（編號：GS13018-1985）[5]?！竺姘住闹仓旮叽螅瑯渥碎_張，分枝稀疏，葉片下垂，葉色綠，葉面隆，葉齒粗，葉身內(nèi)折，葉質(zhì)薄軟，葉背白毫多，故名‘大面白’，屬于不抗寒茶樹品種，常用于制作綠茶、紅茶和烏龍茶[6]。

線粒體是廣泛存在于真核生物的雙層膜半自主細(xì)胞器，是真核細(xì)胞呼吸作用和能量轉(zhuǎn)換的重要場所[7]，主要參與調(diào)控細(xì)胞生長、分裂、凋亡和某些化合物的合成、分解等關(guān)鍵代謝過程，具有半自主特性，擁有獨(dú)立的遺傳物質(zhì)和調(diào)控機(jī)制，對細(xì)胞的能量代謝至關(guān)重要，是研究真核生物進(jìn)化、遺傳多樣性以及品種鑒定和新品種選育的重要工具[8]。植物線粒體基因組一般為環(huán)狀雙鏈DNA，大小在數(shù)千堿基對至幾百萬堿基對之間[9]，富含重復(fù)序列和RNA編輯位點(diǎn)，這些重復(fù)序列可以導(dǎo)致線粒體基因組的結(jié)構(gòu)重排，形成基因嵌合體，這些嵌合體的產(chǎn)生可以使線粒體基因組成為植物雄性不育（Cytoplasmic male sterility，CMS）因子的載體，從而影響植物的生存[10]。對于大多數(shù)高等植物來說，核基因組是親代遺傳，而葉綠體基因組和線粒體基因組是母系遺傳，從而消除了父系的影響，降低了遺傳研究的難度，有利于通過線粒體基因組來推斷種內(nèi)或種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[11]。目前，對山茶屬植物的研究主要集中在根系真菌[12]、病毒病害[13]、形態(tài)結(jié)構(gòu)解剖[14]、系統(tǒng)發(fā)育[15]、品種鑒定[16]和葉綠體基因組[17]等方面，對山茶屬植物線粒體基因組的研究也有較多報(bào)道[18-20]。Li等[18]對‘城步峒茶’的線粒體基因組進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)‘城步峒茶’和‘細(xì)連茶1號’線粒體基因組結(jié)構(gòu)十分相似，且均發(fā)生了基因重排。Zhang等[19]對‘云抗10號’的葉綠體和線粒體基因組進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)與葉綠體基因組相比，‘云抗10號’線粒體基因組具有豐富的重復(fù)序列。Liu等[20]對金花茶（Camellia nitidissima）線粒體基因組進(jìn)行了測序，發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)發(fā)育樹中，金花茶與山茶科、夾竹桃科、茄科和菊科聚為一支，尤其與山茶屬植物關(guān)系密切。目前對‘大面白’線粒體基因組的研究尚未見報(bào)道。本研究利用高通量測序技術(shù)對‘大面白’線粒體基因組進(jìn)行測序組裝，對線粒體基因組圖譜和序列特征進(jìn)行表征，分析密碼子使用的偏好性，并對其進(jìn)行全基因組共線性比對、基因組共線性和重排分析以及細(xì)胞器基因組基因水平轉(zhuǎn)移分析，明確‘大面白’在山茶屬植物系統(tǒng)發(fā)育中的位置。旨在為‘大面白’物種鑒定、遺傳多樣性分析以及分子育種等研究提供理論基礎(chǔ)，為山茶屬植物的系統(tǒng)發(fā)育研究提供更豐富的線粒體基因組數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

‘大面白’地栽苗由江西茗龍實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司的‘大面白’種植基地提供。采摘生長旺盛的新鮮幼嫩葉片，洗凈泥沙，用無菌水進(jìn)行處理后，放入﹣80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和測序

采用改良的CTAB法[21]提取組織總DNA。分別采用華大生物BGISEQ-500測序平臺和華大生物PromethION納米孔測序儀進(jìn)行二代測序和三代測序。二代測序試驗(yàn)流程包括樣品質(zhì)量檢測、文庫構(gòu)建、文庫質(zhì)量檢測和文庫BGISEQ-500平臺測序等。三代測序試驗(yàn)流程包括Blue Pippin全自動(dòng)核酸回收系統(tǒng)篩選大片段DNA，文庫構(gòu)建（SQK-LSK109連接試劑盒），每個(gè)文庫取Blue Pippin篩選后約1 μg的DNA進(jìn)行損傷修復(fù)，磁珠法純化回收修復(fù)的DNA后用Qubit熒光計(jì)（ThermoFisher Scientific）測定濃度并計(jì)算回收率，用試劑盒自帶的測序接頭進(jìn)行DNA與接頭的連接以使每個(gè)DNA片段均帶有可被識別的特異接頭序列，磁珠法純化連接后的樣品DNA，用Qubit熒光計(jì)測定濃度并計(jì)算回收率，文庫上機(jī)測序。

1.2.2 線粒體全基因組的組裝、注釋、特征分析和密碼子使用偏好性分析

使用minimap2軟件[22]將三代測序reads比對到NCBI Citrus屬所有線粒體基因組數(shù)據(jù)，提取比對長度大于5 000 bp的reads用于后續(xù)組裝；使用bowtie2軟件[23]將二代測序reads比對廣州佰數(shù)生物科技有限公司自建的線粒體基因組數(shù)據(jù)庫，將比對上的reads用于后續(xù)組裝；使用Unicycler version：v0.4.8組裝軟件[24]將上述提取到的線粒體候選三代和二代reads用于線粒體基因組組裝。使用GeSeq軟件[25]進(jìn)行線粒體注釋，并利用geneious prime軟件[26]對注釋結(jié)果進(jìn)行手動(dòng)矯正。使用OGDRAW軟件[27]制作線粒體基因組圖譜。使用MISA（MIcroSAtellite identification tool）軟件[28]進(jìn)行SSR的分析。利用REPuter軟件[29]對各種類型重復(fù)進(jìn)行有效性和完整性檢測以及重要性評估。采用Sharp等[30]的方法進(jìn)行相對同義密碼子使用度（Relative synonymous codon usage，RSCU）統(tǒng)計(jì)和分析。參考文獻(xiàn)[31-33]的方法對‘大面白’（PP770440）及其11個(gè)近緣種[金花茶（ON645224）、印度茶（MH376284）、‘大紅袍’（PP212895）、‘凌云白毫’（ON782577）、‘肉桂’（PP212896）、‘城步峒茶’（OL989850）、‘西蓮1號’（OM809792）、紫莖（OQ948158）、浙江紅山茶（PP190481）、博白大果油茶（OP270590）、大苞山茶（PP203036）]進(jìn)行密碼子偏好性分析。采用LASTZ version 1.02.00軟件[34]、PhyloSuite軟件[35]、Mauve軟件[36]、blast軟件[37]分別對‘大面白’及其11個(gè)近緣種進(jìn)行全基因共線性比對、多基因聯(lián)合建樹、線粒體共線性和重排圖繪制、線粒體基因組和葉綠體基因組的全基因同源檢測?！竺姘住€粒體基因組序列提交至NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），登錄號為PP770440。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘大面白’線粒體基因組的測序數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)

‘大面白’葉片總堿基數(shù)為8 133 454 200 bp，Q20堿基數(shù)目和比例分別為7 987 758 194 bp和98.208 7%，而Q30堿基數(shù)目和比例分別為7 648 887 471 bp和94.042 3%，GC含量比例為39.146 6%。綜上可知，‘大面白’葉片的測序質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)‘大面白’線粒體基因組的組裝和注釋。

2.2 ‘大面白’線粒體基因組的基因組成

‘大面白’線粒體基因組共注釋到78個(gè)功能基因（表1），包括41個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因（Protein-coding gene，PCG），33個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（Transfer RNA，tRNA）基因，4個(gè)核糖體RNA（Ribosomal RNA，rRNA）基因，無假基因。trnA-TGC、trnT-TGT（2個(gè)拷貝）、rps3、ccmFc、nad2具有5個(gè)外顯子，nad4、rpl2、nad5、nad1具有2個(gè)外顯子?！竺姘住€粒體基因組78個(gè)功能基因通過GO注釋可以將其歸類劃分3類（圖1），即細(xì)胞成分（Cellular component）、分子功能（Molecular function）和生物過程（Biological process）。

2.3 ‘大面白’線粒體基因組的基本結(jié)構(gòu)

‘大面白’線粒體基因組全長886 354 bp，結(jié)構(gòu)為完整單環(huán)狀分子（圖2）。A含量為27.04%，T含量為27.20%，C含量為22.93%，G含量為22.83%，GC含量為45.76%。

2.4 ‘大面白’線粒體基因組SSR和Long repeat分析

‘大面白’線粒體基因組共檢測到59個(gè)SSR（表2），單核苷酸重復(fù)占主導(dǎo)地位，占總數(shù)的54.24%（32個(gè)），二核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)分別為22個(gè)、4個(gè)、1個(gè)。在單核苷酸SSR中，A/T重復(fù)占比最高（49.15%），在二核苷酸重復(fù)中，AT/AT堿基的重復(fù)比例最高（18.64%）?！竺姘住€粒體基因組共檢測到100個(gè)Long repeat，包括正向重復(fù)和回文重復(fù)，其中正向重復(fù)（30～82 bp）57個(gè)，回文重復(fù)（30～26 080 bp）43個(gè)。分散重復(fù)一般包括正向重復(fù)、反向重復(fù)和互補(bǔ)重復(fù)3種類型?！竺姘住€粒體基因組分散重復(fù)只有正向重復(fù)。

2.5 ‘大面白’線粒體基因組密碼子使用偏好性分析

2.5.1 同義密碼子的偏好性分析

‘大面白’及其11個(gè)近緣種線粒體基因組蛋白質(zhì)編碼序列（Coding sequence，CDS）密碼子3個(gè)位置GC含量的平均值為42.48%，GC1、GC2、GC3的平均值分別為47.19%、43.33%、36.91%，3個(gè)位置GC含量的變化趨勢為GC1＞GC2＞GC3（圖3）；‘大面白’線粒體基因組41個(gè)CDS密碼子的有效密碼子數(shù)（ENC）介于33.782～61.000，平均值為53.17，42個(gè)基因的ENC＞35，1個(gè)基因的ENC＜35，密碼子偏好性較弱；‘大面白’11個(gè)近緣種線粒體基因組CDS密碼子的ENC介于31.257～61.000，平均值為52.81。在‘大面白’11個(gè)近緣種線粒體基因組中，有425個(gè)基因的ENC＞35，13個(gè)基因的ENC＜35，密碼子偏好性同樣較弱。‘大面白’線粒體基因組CDS中共有32個(gè)RSCU＞1的密碼子，在這32個(gè)密碼子中，除ACC、AUG、UCC、UGG、UUG外，其余都以A/U結(jié)尾（圖4）；‘大面白’11個(gè)近緣種線粒體基因組CDS中共有345個(gè)RSCU＞1的密碼子，在這345個(gè)密碼子中，除UGG、UUG、AUG、UCC、ACC外，其余也均以A/U結(jié)尾，同樣偏好以A/U結(jié)尾（圖4）。

2.5.2 中性繪圖分析（GC3-GC12分析）

‘大面白’及其11個(gè)近緣種線粒體基因的GC3含量在23.93%～58.59%，GC12含量在26.14%～57.84%，二者絕大多數(shù)沿對角線上方分布（圖5）?！竺姘住捌?1個(gè)近緣種GC3和GC12的相關(guān)系數(shù)r=0.009～0.211（R2=0.000～0.136），其中‘大面白’和紫莖的GC12與GC3的R2為0，說明‘大面白’和紫莖的GC12與GC3無直線相關(guān)關(guān)系，表明定向突變壓力在整體密碼子組成上沒有發(fā)揮重要作用；‘大面白’及其11個(gè)近緣種GC3和GC12的相關(guān)系回歸系數(shù)為0.009～0.211，內(nèi)部突變貢獻(xiàn)率僅0.9%～21.1%，自然選擇貢獻(xiàn)率為78.9%～99.1%，表明‘大面白’及其11個(gè)近緣種線粒體基因組密碼子使用偏好性主要受自然選擇的影響，受內(nèi)部突變壓力的影響小。

2.5.3 ENC-plot分析

‘大面白’及其11個(gè)近緣種線粒體的基因組具有479個(gè)基因，其中有465個(gè)基因的ENC＞35，主要集中在50～60，大部分基因位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的下方（圖6），表明在‘大面白’及其11個(gè)近緣種線粒體基因組479個(gè)基因中，絕大多數(shù)基因ENC的實(shí)際值與預(yù)期值存在較大差異，且‘大面白’及其11個(gè)近緣種線粒體基因組479個(gè)基因的GC3值分布較為集中，可見自然選擇是影響‘大面白’及其11個(gè)近緣種線粒體基因組密碼子使用偏好性的重要原因，密碼子使用偏好性受內(nèi)部突變的影響較小。

2.5.4 PR2-plot分析

從G3/GC3軸看，‘大面白’及其11個(gè)近緣種線粒體基因組絕大多數(shù)基因分布于PR2-plot圖的下方（圖7），說明存在C3＞G3現(xiàn)象。從A3/AU3軸看，‘大面白’及其11個(gè)近緣種線粒體基因組絕大多數(shù)基因分布于PR2-plot圖的左邊（圖7），說明存在A3＞T3現(xiàn)象。密碼子使用偏好性只受內(nèi)部突變影響時(shí)，"應(yīng)C3=G3和A3=T3，說明‘大面白’及其11個(gè)近緣種線粒體基因組密碼子使用偏好性受內(nèi)部突變和自然選擇的雙重影響，其中自然選擇對密碼子使用偏好性的影響更大。

2.5.5 最優(yōu)密碼子確定

RSCU是指對于某一特定的密碼子在編碼對應(yīng)氨基酸的同義密碼子間的相對概率。ΔRSCU是指RSCU高表達(dá)與RSCU低表達(dá)的差值。根據(jù)RSCU＞1且ΔRSCU≥0.08的原則，篩選‘大面白’線粒體基因組的最優(yōu)密碼子（表3）。結(jié)果表明，‘大面白’線粒體基因組的最優(yōu)密碼子為14個(gè)且多以A/U結(jié)尾，即AAU、GAU、CAU、UUU、AUU、GCU、GGA、ACU、GUU、CGA、UUA、UUG、UCA、UCU。

2.6 Lastz全基因組共線性比對

對‘大面白’及其11個(gè)近緣種線粒體基因組進(jìn)行全基因共線性比對（圖8）。以‘大面白’線粒體基因組（PP770440）為參考，將11個(gè)近緣種的線粒體的基因組與其進(jìn)行比對（其中藍(lán)色為正向共線性，紅色為反向共線性），以檢測‘大面白’及其11個(gè)近緣種線粒體基因組的共線性區(qū)段。結(jié)果表明，11個(gè)近緣物種的線粒體基因組在基因區(qū)與‘大面白’線粒體基因組具有高度同源性。

2.7 基因組共線性和重排分析

以‘大面白’的線粒體基因組（PP770440）作為參照，與11個(gè)近緣種線粒體基因組進(jìn)行共線性和重排分析（圖9）。結(jié)果表明，‘大面白’的線粒體基因組與‘凌云白毫’線粒體基因組（ON782577）的共線性最高，兩者的基因排列順序基本一致，表明‘大面白’與‘凌云白毫’的親緣關(guān)系較近，而與其他幾個(gè)物種相似度相對較遠(yuǎn)。總體來看，‘大面白’及其11個(gè)近緣種線粒體基因組間的相似度較高，表明線粒體基因組較為保守。

2.8 細(xì)胞器基因組基因水平轉(zhuǎn)移分析

為了研究‘大面白’線粒體和葉綠體內(nèi)部的基因水平轉(zhuǎn)移，進(jìn)行其線粒體基因組和葉綠體基因組之間的全基因同源檢測（圖10），最終從其線粒體和葉綠體基因組中獲得62個(gè)高度同源的基因片段，表明‘大面白’線粒體和葉綠體內(nèi)部存在基因水平轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，遷移基因大多數(shù)為tRNA，且大多數(shù)tRNA基因在遷移過程中的序列信息并沒有發(fā)生較大的變化，tRNA基因比rRNA基因在遷移過程中更為保守，線粒體中的ccmC基因是由葉綠體中的tRNA遷移轉(zhuǎn)變而來的（表4）。

2.9 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于‘大面白’及其10個(gè)山茶科山茶屬近緣種和1個(gè)山茶科紫莖屬外群種線粒體基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明（圖11），‘大面白’與金花茶、印度茶、‘大紅袍’和‘凌云白毫’聚在1個(gè)分支，其中‘大面白’又與‘凌云白毫’單獨(dú)聚在1個(gè)小分支，說明‘大面白’與‘凌云白毫’親緣關(guān)系較近。

3 討論

植物線粒體基因組的結(jié)構(gòu)特征較為復(fù)雜，有單環(huán)狀、線性、多環(huán)等多種構(gòu)象，且隨著植物物種的不同，其線粒體基因組的大小和存在形式也存在差異[38]。不同物種的線粒體基因組變化較大，存在重組頻繁、水平基因遷移等現(xiàn)象[39]。因此，與葉綠體基因組相比，線粒體基因組拼接難度更大，研究難點(diǎn)更多，構(gòu)象容易發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，目前關(guān)于高等植物線粒體的研究還比較缺乏。本研究結(jié)果表明，‘大面白’線粒體基因組全長為886 354 bp，符合植物線粒體基因組的大小特征，結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)為完整單環(huán)狀分子，GC含量為45.76%，在rRNA基因中最高，這個(gè)結(jié)果與其他山茶屬物種線粒體基因組的研究結(jié)果一致[18-20]。‘大面白’線粒體基因組堿基組成呈AT偏好，AT含量在54.24%，可能與山茶屬線粒體基因組中富含AT堿基的編碼控制區(qū)比例較高有關(guān)[18-20]。研究表明，植物線粒體基因組存在大量的重復(fù)序列，這些重復(fù)序列是分子間重組的關(guān)鍵位點(diǎn)[11]。本研究結(jié)果表明，山茶屬植物線粒體基因組存在大量SSR和Long repeat，在單核苷酸SSR中，A/T重復(fù)占比最高，在Long repeat中，正向重復(fù)和回文重復(fù)占比較高，這與其他高等植物如李屬植物[11]、桑屬植物[40]等的線粒體基因組中的研究結(jié)果一致，可能在高等植物線粒體基因組中正向重復(fù)和回文重復(fù)較為普遍。

在細(xì)胞核和細(xì)胞器的基因編碼中，植物會(huì)傾向于選擇某些特定的密碼子，即核基因組和細(xì)胞器基因組會(huì)存在一定的密碼子使用偏好性[8]。解析核基因組和細(xì)胞器基因組的密碼子使用偏好性，可以了解基因的調(diào)控和進(jìn)化過程[41]。不同基因組、基因之間以及同一基因的密碼子使用偏好性均會(huì)存在差異，而且同一物種的核基因組和細(xì)胞器基因組的密碼子使用偏好性也存在較大差別[42]。單子葉植物核基因編碼區(qū)的密碼子偏好以C/G結(jié)尾，而雙子葉植物核基因編碼區(qū)的密碼子偏好以A/U結(jié)尾，細(xì)胞器基因組如葉綠體基因組和線粒體基因組的密碼子更傾向于以A/U結(jié)尾[43]。本研究結(jié)果顯示，‘大面白’及其11個(gè)近緣種線粒體基因組CDS密碼子的偏好性較弱，其絕大多數(shù)密碼子以A/U結(jié)尾，這與‘大面白’及其16個(gè)近緣種葉綠體基因組[5]的研究結(jié)果相同，也與‘城步峒茶’[18]、‘云抗10號’[19]和金花茶[20]線粒體基因組的研究結(jié)果一致。

研究表明，植物線粒體基因組密碼子的偏好性一般是以內(nèi)部突變或自然選擇作為主要的驅(qū)動(dòng)力，同時(shí)還受到其他多種因素的影響[9]。在研究密碼子使用偏好的成因時(shí)，中性繪圖分析（GC3-GC12分析）是一種重要的分析工具，通過中性繪圖分析可以揭示自然選擇和突變壓力對密碼子使用偏好性的影響[11]。本研究結(jié)果表明，‘大面白’及其11個(gè)近緣種線粒體基因組密碼子使用偏好性主要受自然選擇的影響，而受內(nèi)部突變壓力的影響小。為了進(jìn)一步說明同義密碼子使用偏好性，對‘大面白’及其11個(gè)近緣種線粒體基因組的密碼子使用偏好性進(jìn)行ENC-plot分析，發(fā)現(xiàn)大部分基因位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的下方，ENC的實(shí)際值與預(yù)期值存在較大差異，且GC3值分布集中，表明這些基因的密碼子偏好性主要受自然選擇的制約，內(nèi)部突變的作用次之。在‘大面白’及其11個(gè)近緣種線粒體基因組密碼子的PR2-plot分析中，發(fā)現(xiàn)存在C3＞G3和A3＞T3現(xiàn)象，說明在形成‘大面白’及其11個(gè)近緣種線粒體基因組的密碼子使用偏好性時(shí)，除了受到自然選擇的影響外，還受到內(nèi)部突變及其他因素的影響。究其原因，可能是由于‘大面白’的野生種、半野生種和栽培種的生長環(huán)境較為穩(wěn)定，栽培區(qū)的管理模式日趨生態(tài)化，‘大面白’線粒體基因組的密碼子偏好性受人工選擇、基因突變等影響較小，導(dǎo)致其線粒體基因組的密碼子偏好性較弱[5]?！竺姘住墙?jīng)過長期人工栽培馴化而成的品種，其線粒體基因組的密碼子偏好性可能是由基因突變和自然選擇共同發(fā)揮作用，但自然選擇的作用是主要的[5]。

植物線粒體基因組可以發(fā)生結(jié)構(gòu)重排，會(huì)造成大量基因丟失或獲得，這種現(xiàn)象與細(xì)胞器基因組基因水平轉(zhuǎn)移等有關(guān)[44]。基因丟失或獲得以及頻繁的結(jié)構(gòu)重排是植物線粒體基因組所具有的兩大特征，基因水平轉(zhuǎn)移可以從葉綠體或線粒體基因組遷移到核基因組，也可以從葉綠體向線粒體基因組進(jìn)行遷移，基因水平轉(zhuǎn)移不僅具有基因和插入位點(diǎn)選擇性，而且具有偏好性[45]。被子植物線粒體基因組在結(jié)構(gòu)水平上分化迅速，即使在近緣種間也會(huì)表現(xiàn)出共線性的喪失[46]?！竺姘住捌?1個(gè)近緣種線粒體基因組的共線性分析結(jié)果也體現(xiàn)了這一特點(diǎn)，其線粒體基因組的結(jié)構(gòu)變異較大，共線性程度低，重組率較高，這與7種茄科植物線粒體基因組[47]的共線性分析結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)了nad5、atp9、cox2、rps3、trnA-TGC、trnI-GAT、rrn18、trnV-GAC和ccmFN等基因在‘大面白’線粒體基因組與其近緣種線粒體基因組之間重新排列，其線粒體基因組具有極其復(fù)雜的變異，有可能導(dǎo)致雜交和復(fù)制。這些發(fā)現(xiàn)與之前Li等[18]研究一致，表明植物線粒體基因組存在廣泛的多樣性和重排。此外，植物線粒體基因組中的基因順序差異很大，線粒體DNA的結(jié)構(gòu)可用于追蹤不同物種之間的共同祖先[18]。

為了進(jìn)一步揭示‘大面白’在山茶屬種間的親緣關(guān)系，本研究利用‘大面白’及其10個(gè)山茶科山茶屬近緣種和1個(gè)山茶科紫莖屬外群種的線粒體基因組構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，‘大面白’與金花茶、印度茶、‘大紅袍’‘凌云白毫’聚在一個(gè)分支，在這個(gè)分支中，‘大面白’又與‘凌云白毫’單獨(dú)聚在一小分支，說明‘大面白’與‘凌云白毫’親緣關(guān)系較近。目前針對山茶屬植物線粒體基因組的相關(guān)研究極少，以后需要加大對山茶屬植物類群線粒體基因組的探討，尋找更廣泛的密碼子偏好規(guī)律，為揭示山茶屬植物類群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、理解山茶屬植物類群的進(jìn)化歷程等提供更直接的證據(jù)。

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