表沒食子兒茶素沒食子酸酯抗?jié)h灘病毒效果研究

摘要：為明確表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）在體內(nèi)外對漢灘病毒（Hantaan virus，HTNV）的抑制成效，開展以下試驗：（1）運用細胞活力檢測法測定EGCG的細胞毒性；（2）在感染HTNV的不同時段添加EGCG進行處理，采用蛋白免疫印跡、實時熒光定量PCR、間接免疫熒光及斑點形成試驗（Focus formation assay，F(xiàn)FA）檢測HTNV在A549細胞內(nèi)24、48 h的病毒表達量，同時使用Autodock vina軟件進行分子對接，確定EGCG抗HTNV的潛在作用靶點；（3）通過灌胃給藥方式給予攻毒裸鼠高中低劑量的EGCG，并檢測其體重及生存率。結(jié)果表明，使用100 μmol·L-1 EGCG體外有效抑制HTNV感染，且該抑制效果主要作用于HTNV的吸附階段；分子對接試驗顯示，EGCG可與HTNV的Gn、Gc相互作用，結(jié)合能分別為﹣9.0、﹣7.1 kcal·mol-1；高中低劑量EGCG（50.0、25.0、12.5 mg·kg-1）治療感染裸鼠后，有效降低了攻毒裸鼠死亡率，裸鼠體重下降幅度均明顯減少。

關(guān)鍵詞：漢灘病毒；表沒食子兒茶素沒食子酸酯；抗病毒感染

中圖分類號：S571.1；S435.711" " " " " "文獻標(biāo)識碼：A" " " " " " 文章編號：1000-369X（2025）01-0145-12

Study on the Effect of Epigallocatechin Gallate

Against Hantaan Virus

LUO Lulu1，2， ZHAO Yuexi2， WANG Yanbo2， XING Yi2， QI Yang2， MA Hongwei2，

CHENG Linfeng2， ZHANG Fanglin2*

1. School of Life Sciences， Northwest University， Xi'an 710069， China;

2. Basic Medical College of Air Force Medical University， Xi'an 710032， China

Abstract： The purpose of this study was to investigate the inhibitory effect of epigallocatechin gallate （EGCG） on the Hantaan virus （HTNV） both in vitro and in vivo， and to identify the potential targets of EGCG against HTNV using molecular docking. First， the cytotoxicity of EGCG was determined using a cell viability assay. Then， EGCG was administered for treatment at different time points during HTNV infection， and the viral expression of HTNV in A549 cells was detected by western blotting， real-time PCR， indirect immunofluorescence， and focus formation assay （FFA） at 24 h and 48 h. Molecular docking was conducted using Autodock Vina software. Finally， the challenged nude mice were administered high， medium， and low doses of EGCG via gavage， and their body weight and survival rates were measured. The results indicate that the administration of 100 μmol·L-1 EGCG effectively inhibited HTNV infection in vitro， primarily affecting the adsorption stage of HTNV. The molecular docking results demonstrate that EGCG could interact with HTNV Gn and Gc， with binding energies of ﹣9.0 kcal·mol-1 and ﹣7.1 kcal·mol-1， respectively. High， medium， and low doses of EGCG （50.0， 25.0， 12.5 mg·kg-1） effectively reduced the mortality rate of challenged nude mice， and significantly mitigated weight loss in these mice.

Keywords： HTNV， EGCG， antiviral infection

漢灘病毒（Hantaan virus，HTNV）是單負鏈RNA病毒，屬漢坦病毒科（Hantaviridae）正漢坦病毒屬（Orthohantavirus）[1]。HTNV基因組包含L、M和S 3個片段，分別編碼RNA依賴的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）、包膜糖蛋白（Glycoprotein，GP，包含Gn和Gc）和核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，NP）[2]。HTNV在臨床上能引起腎綜合征出血熱（Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS），造成發(fā)熱、出血、急性腎功能損害，同時引起外周肺部病變以及肺功能損傷等癥狀[3-4]。目前臨床上以對癥治療為主[5]，有研究報道疾病早期應(yīng)用利巴韋林可減輕腎功能損傷，然而廣譜抗病毒藥物利巴韋林存在對肝腎功能有損傷、特殊人群有禁忌的缺陷[6-7]，因此需要研制或篩選出有效的特異抗HTNV藥物，以應(yīng)對HTNV感染。

綠茶中的一種多酚類物質(zhì)，即表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG），相對于其他7種兒茶素多酚單體，具有更顯著的抗炎、抗菌、抗病毒和抗氧化作用[8]。有研究表明，EGCG對多種病毒具有抗病毒活性，如登革病毒（Dengue virus，DENV）、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）、人乳頭瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）、皰疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）[9-14]。鑒于EGCG作為一種潛在的抗病毒活性候選藥物，其在HTNV感染下的抗病毒效能尚待明確，本研究旨在通過構(gòu)建細胞感染模型來系統(tǒng)評估EGCG的抗HTNV活性。同時，為深入理解其作用機制，運用分子對接技術(shù)詳盡分析EGCG與HTNV蛋白之間的結(jié)合特性與相互作用模式，為后續(xù)深入探索EGCG針對HTNV的抗病毒機制奠定堅實的試驗與理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

A549細胞是一種人肺腺癌細胞系，廣泛應(yīng)用于呼吸道病毒的研究中，因其具有較高的病毒易感性，能夠較好地模擬病毒感染人體的過程。E6細胞則是一種常用于病毒復(fù)制和傳播研究的細胞系，具有穩(wěn)定的生長特性和較高的病毒復(fù)制效率。因此從細胞的易感性、代表性以及試驗的可操作性綜合考慮，選用這兩種細胞系作為感染細胞，均采購自位于中國武漢的中國典型培養(yǎng)物保藏中心（簡稱CCTCC），置于37 ℃、含有5% CO2的恒溫孵育箱中。本研究所用的HTNV病毒株為國際知名的76～118株，由我國疾病預(yù)防控制中心杭長壽研究員提供，隨后在本實驗室進行了妥善保存與擴增。試驗中所用的EGCG（產(chǎn)品編號：Cat.# HY-13653）采購自美國MedChemExpress公司。細胞增殖與活性評估的關(guān)鍵工具—細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）購自Thermo公司。此外，Micro BCA?蛋白質(zhì)定量試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司。實驗室內(nèi)部還制備了針對HTNV核衣殼蛋白（NP）的小鼠單克隆抗體（IA8），用于特異性檢測。同時，從Sangon Biotech公司引入了GAPDH抗體以及Alexa 488標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗，用于免疫熒光等試驗。辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）同樣來源于Sangon Biotech，為后續(xù)的斑塊形成試驗（Focus forming assay，F(xiàn)FA）等提供了關(guān)鍵酶源。Hoechst 33258熒光染料，用于細胞核染色，購自MedChemExpress公司。本研究采用的HTNV感染試驗?zāi)Ｐ蜑闊o胸腺裸鼠（品種：BALB/c Nude），6～8周齡，體重維持在18～22 g，購自成都的藥康生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

A549和E6細胞在37 ℃和5% CO2孵箱生長，并在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將細胞密度為70%～80%的A549細胞分別接種在6孔板、12孔板和24孔板中，培養(yǎng)過夜。6孔板接種量為每孔2.5×105個，12孔板接種量為每孔1×105個，24孔板接種量為每孔5×104個。E6細胞接種在96孔板中接種量為每孔4×104個。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞存活率

為了確定不同濃度的EGCG對A549細胞存活率的影響，根據(jù)試驗要求設(shè)置分組為試驗組、對照組、空白組。首先在96孔細胞培養(yǎng)板中不完全接種細胞，空白組為不接種細胞的孔即不進行加藥加10%DMEM培養(yǎng)基處理，試驗組是指在接種的細胞中加入100 μL用10% DMEM培養(yǎng)基稀釋成不同濃度（25、50、75、100、125、150、175 μmol·L-1）的EGCG，對照組是指在接種的細胞中加入100 μL的10%DMEM培養(yǎng)基。每組設(shè)置5個孔，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育處理48 h后，避光加入含有10% CCK-8試劑的10%DMEM培養(yǎng)基，室溫孵育1 h后，使用BioTek Epoch酶標(biāo)儀檢測在450 nm處的吸光度，得到不同濃度的EGCG處理下的CCK-8試驗OD值。測量時，設(shè)置如下參數(shù)：試驗組吸光度（As）、空白組吸光度（Ab）、對照組吸光度（Ac），并利用如下公式計算細胞存活率（Cv）。接著以藥物濃度為橫坐標(biāo)、以存活率為縱坐標(biāo)，使用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行曲線擬合，查找曲線上存活率為50%時對應(yīng)的藥物濃度（CC50）。

\"Cv=\"" （\"As\" \"－\" \" \"Ab\" ）/\"Ac－Ab\" ×\"100%\" ···················（1）

1.2.3 病毒浸染

為了確定在感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection，MOI）為1的條件下所需的病毒量，首先將HTNV在37℃、CO2環(huán)境控制的孵箱中持續(xù)感染2 h。隨后，替換原有培養(yǎng)基為含2%胎牛血清（Foetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM培養(yǎng)基，或含指定濃度EGCG的培養(yǎng)基。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h后，依據(jù)具體的研究設(shè)計進行后續(xù)試驗操作。

1.2.4 EGCG對HTNV的半數(shù)抑制濃度

在12孔細胞培養(yǎng)板中接種A549細胞，并沿用之前描述的病毒感染流程。在HTNV感染的同時，向各組細胞分別添加0、25、50、75、100 μmol·L-1不同濃度的EGCG。感染2 h后，替換培養(yǎng)基為含有相應(yīng)EGCG濃度的培養(yǎng)基。經(jīng)過24 h的培養(yǎng)后收集細胞樣本，提取RNA，隨后采用實時熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）測定細胞內(nèi)HTNV-S基因的核酸水平。為量化EGCG的抗病毒效果，將未接受EGCG處理的細胞中HTNV-S基因的表達量設(shè)定為基準(zhǔn)值（100%），設(shè)置參數(shù)：感染率（R），并利用如下公式計算抑制率（Ir）。接著用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行數(shù)據(jù)分析擬合出抑制率曲線并計算出半數(shù)抑制濃度（IC50）。

Ir\"=\" （\"1－R\" ）×\"1\" 00%···················（2）

1.2.5 EGCG抗HTNV活性

為了全面評估EGCG在不同感染階段對HTNV的潛在影響，本研究設(shè)計了4組干預(yù)策略：第一組（Group 1）為全程加藥組，該組細胞在HTNV感染前1 h直至感染后24 h或48 h期間，持續(xù)接受100 μmol·L-1 EGCG的處理；第二組（Group 2）為預(yù)給藥組，此組細胞僅在病毒感染前1 h單獨接受100 μmol·L-1 EGCG的處理；第三組（Group 3）設(shè)定為即時干預(yù)組，細胞在HTNV感染后的0～2 h內(nèi)加入EGCG；第四組（Group 4）為延遲給藥組，該組在病毒感染后的2～24 h或2～48 h內(nèi)加入100 μmol·L-1 EGCG。同時，設(shè)立對照組（CK），對照組細胞在HTNV感染2 h后更換為常規(guī)細胞培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng)至24 h或48 h，以收集樣本進行后續(xù)的檢測與分析。EGCG干預(yù)處理方式見表1。

1.2.6 不同劑量EGCG對病毒的抑制作用

在HTNV感染A549細胞感染前1 h至感染后24 h分別加25、50、75、100 μmol·L-1的EGCG處理，對照組細胞感染HTNV 2 h后換液為細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h收樣進行后續(xù)檢測。

1.2.7 阻斷侵入試驗

根據(jù)病毒在4 ℃只吸附不入胞的特性進行EGCG不同時間段的干預(yù)，將培養(yǎng)板放置4 ℃冰箱預(yù)冷1 h，預(yù)冷后感染HTNV并于4 ℃培養(yǎng)2 h。2 h后轉(zhuǎn)到37 ℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)并換液。根據(jù)感染進程中的不同階段進行處理：吸附組于感染后0～2 h加藥處理，2 h后換2% FBS的DMEM培養(yǎng)基換液；入胞組于感染2 h后更換含藥物培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h，2 h后更換2% FBS的DMEM培養(yǎng)基換液；復(fù)制組于感染2 h后換2% FBS的DMEM培養(yǎng)基，待2 h后棄液加入藥物處理。各組于感染48 h后收集細胞及上清液用于后續(xù)檢測。

1.2.8 qRT-PCR檢測HTNV S mRNA表達

收取細胞樣本用E.Z.N.A. 總RNA試劑盒I（OMEGA BioTek）提取并測量總RNA濃度，從中取1 000 ng RNA進行反轉(zhuǎn)錄，并加入反轉(zhuǎn)錄所需無RNA酶水和10 μL 2×Hifair?Ⅲ SuperMix plus酶。設(shè)置25 ℃ 5 min、55 ℃ 15 min、85 ℃ 5 min的反轉(zhuǎn)錄程序得到cDNA，再用2×qPCR SmArt Mix（SYBR Green）進行qRT-PCR，檢測HTNV S基因和內(nèi)參基因18 S，HTNV S基因的上下游引物序列分別為：5'-CGGGACGACAAAGGATGT-3'、5'-GAGCCTGGAGACCATCTG-3'。內(nèi)參基因18 S基因的上下游引物序列分別為：5'-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3'、5'-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3'。采用 法計算HTNV S mRNA表達水平。

1.2.9 Western blot法檢測HTNV NP表達

收取A549細胞樣本，用帶有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液在冰上裂解30 min。用細胞刮板掛取細胞，在4 ℃條件下，離心取上清液。用試劑盒進行BCA定量。隨后制備20 μg蛋白樣進行蛋白質(zhì)印記檢測。電泳條件：80 V、2 h；電轉(zhuǎn)：230 mA、1.5 h。將PVDF膜放入含有5%脫脂牛奶的容器中，在室溫下密封1 h后進行IA8和GAPDH抗體（濃度分別為1∶1 000和1∶5 000）4 ℃孵育過夜，第二天TBST洗膜3次后，用抗鼠紅外二抗進一步孵育1 h，隨后使用Odyssey紅外掃描儀掃描膜并處理數(shù)據(jù)。

1.2.10 免疫熒光技術(shù)檢測HTNV NP表達

首先以4%多聚甲醛在室溫下固定A549細胞15 min，隨后進行細胞膜通透性處理，采用0.5% Triton X-100孵育10 min。封閉步驟使用3% BSA溶液，持續(xù)2 h。之后，樣本在4 ℃條件下與1A8抗體共同孵育過夜，每次操作前均用DPBS洗滌3次以確保無殘留。隨后，利用Alexa 488標(biāo)記的羊抗鼠抗體進行2 h的熒光標(biāo)記，用Hoechst 33258進行細胞核染色。最后，通過OLYMPUS IX71熒光顯微鏡捕獲并記錄圖像。

1.2.11 病毒滴度的斑塊形成試驗評估

收集A549細胞培養(yǎng)上清，部分樣本進行10倍稀釋。使用100 μL的原液及稀釋液分別感染Vero E6細胞，每組設(shè)置4個重復(fù)孔。在37 ℃下感染2 h后，更換為含有1.6%羧甲基纖維素和2% FBS的DMEM覆蓋液，繼續(xù)在孵箱中培養(yǎng)6 d。隨后，移除覆蓋液，樣本在室溫下經(jīng)4%多聚甲醛固定20 min，0.5% Triton X-100透膜處理15 min，并以0.3% BSA封閉1 h。接著，在4 ℃下與1A8抗體孵育過夜，隨后使用HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h，每次操作前均用DPBS清洗3次。避光條件下加入TMB顯色液，37 ℃下染色20 min，待斑點形成后甩干培養(yǎng)板，掃描并計數(shù)斑點。設(shè)置如下參數(shù)：斑點數(shù)（S）、病毒稀釋倍數(shù)（D）、病毒接種體積（U），并利用如下公式計算病毒滴度（Vt）。

\"Vt=\"" \"S×D\" /\"U\" ·······························（3）

1.2.12 EGCG與病毒蛋白相互作用的分子對接預(yù)測

從PDB數(shù)據(jù)庫（Protein data bank）中檢索并下載HTNV的Gn（PDB ID：6Y6P）和GC（PDB ID：5LJY）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)文件，并去除不需要的輔因子、離子、加氫，存為PDBQT格式。同時，在PubChem數(shù)據(jù)庫中檢索EGCG（PubChem CID：65064）并獲取其結(jié)構(gòu)文件。利用Autodock vina軟件進行半柔性對接分析，設(shè)置對接參數(shù)進行對接：（1）導(dǎo)入處理好的大分子受體：Grid、Macromoecule、open（蛋白PDBQT文件）。（2）導(dǎo)入小分子配體：Grid、Set Map Typesgrid、open ligand、小分子PDBQT文件。（3）設(shè)置對接盒子：對接盒子包裹受體后，應(yīng)把配體拉出。File、Choose saving current。（4）設(shè)置對接vina參數(shù)：Docking、Output、Vina.config、調(diào)整受體、配體、輸出文件名等信息、保存文件。（5）運行vina：Run、Run AutoDock Vina、選中生成的config文件、運行。（6）查看對接結(jié)果，預(yù)測EGCG與HTNV特定蛋白之間的潛在相互作用。

1.2.13 EGCG對感染病毒裸鼠保護試驗

BALB/c-Nude雌性裸鼠32只（SPF級，體質(zhì)量18～22 g、4～6周齡），購自成都藥康公司，動物實驗福利與倫理（受理）證明編號為20230911。動物試驗經(jīng)中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗委員會批準(zhǔn)，飼養(yǎng)于中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)微生物與病原生物學(xué)教研室動物實驗中心。動物房溫度（25±1） ℃，相對濕度40%～70%，光照時間12 h晝夜交替，定期對飼養(yǎng)籠具進行清洗和消毒，自由供給飲用水和基礎(chǔ)飼料，飼料主要營養(yǎng)成分：粗蛋白24.3%、粗灰粉8.6%、粗脂肪7.5%、粗纖維3.5%、鈣1.2%、磷0.7%，含水量7.5%。根據(jù)試驗要求將BALB/c-Nude裸鼠隨機分為4組（每組8只）：對照組、EGCG低劑量組（12.5 mg·kg-1）、EGCG中劑量組（25.0 mg·kg-1）、EGCG高劑量組（50.0 mg·kg-1）。每只小鼠進行連續(xù)兩天肌肉注射HTNV（3×105 PFU·mL-1）700 μL，對照組在攻毒前2 h給予200 μL的0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃，EGCG高中低劑量組在感染病毒前2 h給予200 μL相應(yīng)劑量的EGCG，持續(xù)灌胃7 d。同時每隔2 d記錄裸鼠體重及生存率。

1.2.14 統(tǒng)計學(xué)分析

試驗數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism 8.0.2軟件進行統(tǒng)計分析和圖表繪制。組間差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行評估，P＜0.05被視為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性，表明差異具有意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG抗HTNV活性

在HTNV易感細胞A549中，利用CCK-8試劑檢測EGCG的安全使用劑量。結(jié)果表明，100 μmol·L-1 EGCG處理的A549細胞與不添加EGCG處理的細胞存活率無顯著差異，且對A549細胞的CC50為163.5 μmol·L-1，因此后續(xù)試驗選擇100 μmol·L-1為EGCG的最大安全濃度（圖1A）。進一步，在A549細胞感染HTNV，選用100 μmol·L-1 EGCG進行全程干預(yù)處理。結(jié)果表明，EGCG對HTNV有抑制作用，且其IC50為52.58 μmol·L-1（圖1B）。

2.2 EGCG在不同感染階段對HTNV的抑制作用

進一步明確EGCG抗HTNV的作用階段，在A549細胞上進行時間添加試驗，通過檢測HTNV蛋白表達水平、核酸表達水平評價EGCG對HTNV的抑制效果。HTNV感染時間及100 μmol·L-1的EGCG作用時間如圖2A所示，結(jié)果表明第一組（全程：感染前1 h至感染后24 h或48 h）的EGCG處理在24 h和48 h下均能顯著降低HTNV RNA水平、蛋白質(zhì)水平，說明感染全程進行EGCG處理對HTNV有明顯抑制作用。第二組（感染前EGCG預(yù)處理）、第三組（感染期間即感染后0～2 h EGCG處理）、第四組（感染后EGCG處理）組相比于對照組（感染組）在24 h和48 h下HTNV RNA水平、蛋白質(zhì)水平有不同程度的降低（圖2B、圖2C）。提示在24 h和48 h下EGCG在HTNV的不同生命周期中，即入胞、入胞后復(fù)制階段均能不同程度的發(fā)揮抗病毒作用，且全程EGCG處理下抑制HTNV效果最為顯著。

2.3 不同劑量EGCG對病毒的抑制作用

將EGCG分為25、50、75、100 μmol·L-1濃度組，按照上述感染全程給予EGCG的處理方式，對照組為A549細胞感染HTNV后不經(jīng)EGCG處理（0 μmol·L-1）。結(jié)果表明，與對照組相比，隨著EGCG濃度的提高，病毒蛋白質(zhì)表達水平降低（圖3A、圖3D），且經(jīng)過100 μmol·L-1 EGCG處理后蛋白表達水平顯著降低（P＜0.001）。mRNA表達水平（圖3B）及子代病毒滴度降低（圖3C），且與對照組相比25、50、75、100 μmol·L-1 EGCG處理后mRNA表達水平顯著降低（P＜0.001），50、75、100 μmol·L-1 EGCG處理后子代病毒滴度降低（P＜0.05）。不同濃度EGCG均抑制HTNV，且濃度越高抑制HTNV效果越顯著，即EGCG對HTNV的抑制作用呈濃度依賴性。

2.4 4 ℃阻斷侵入試驗

為進一步明確藥物阻斷病毒入胞的具體步驟，進行4 ℃阻斷侵入試驗，感染方式及藥物處理方式如圖4A。在4 ℃時，病毒只能吸附在細胞上而不能進入細胞。因此通過設(shè)計4 ℃感染組、抑制吸附組（在4 ℃感染HTNV期間，加入EGCG處理），抑制內(nèi)化組（4 ℃感染后，37 ℃培養(yǎng)時，EGCG處理2 h），抑制復(fù)制組（4 ℃感染，再經(jīng)37 ℃培養(yǎng)2 h后，加入EGCG處理），待48 h收樣通過免疫印記、免疫熒光、qRT-PCR、酶聯(lián)斑塊形成試驗分別檢測HTNV的核衣殼蛋白表達水平、HTNV-S核酸表達水平、子代病毒滴度水平。結(jié)果表明，相比于對照組，抑制吸附組HTNV NP顯著降低（P＜0.05，圖4B、4E），吸附組、入胞組、復(fù)制組的HTNV S mRNA表達水平降低（P＜0.01，圖4C），HTNV子代病毒滴度降低（圖4D）。

2.5 EGCG體內(nèi)抗HTNV效果

選用裸鼠為HTNV感染模型，連續(xù)2 d肌肉注射HTNV（3×105 PFU·mL-1）700 μL，試驗組進行高中低不同劑量（50.0、25.0、12.5 mg·kg-1）的EGCG在感染前2 h進行灌胃給藥，持續(xù)7 d。攻毒小鼠的體重及生存率結(jié)果顯示，對照組小鼠感染HTNV后小鼠體重逐漸降低，且在感染后第18天出現(xiàn)發(fā)病癥狀并陸續(xù)死亡。與對照組相比，EGCG高劑量組治療延緩小鼠發(fā)病且病死率明顯降低，死亡時間延緩至27 d。中劑量和低劑量組治療減緩了小鼠的死亡時間，中劑量組死亡時間延緩至23 d，低劑量組死亡時間延緩至21 d。EGCG治療有效減少死亡數(shù)量，35 d時對照組僅有1只小鼠存活，低劑量組有4只小鼠存活，中劑量和高劑量組各有6只小鼠存活。且相比于對照組EGCG治療能減少體重下降幅度（圖5）。綜上所述，EGCG在感染HTNV小鼠體內(nèi)也有較好的保護效果。

2.6 EGCG與HTNV蛋白的相互作用

分子對接結(jié)果顯示，EGCG可與HTNV的Gn、Gc相互作用，結(jié)合能分別為﹣9.0 kcal·mol-1和﹣7.1 kcal·mol-1。EGCG與Gn的TYRA：201、LYSA：93、GLU A：99形成3個氫鍵。EGCG與Gc的THRA：83、HIS H：53、SER H：56、TYR H：52、SER L：94、TYR A：135、LYS A：82形成氫鍵。根據(jù)上述結(jié)果推斷，EGCG可能通過與Gn、Gc結(jié)合阻斷病毒吸附到細胞上從而發(fā)揮抗HTNV作用（圖6）。

3 討論

HTNV感染引起的HFRS不僅會導(dǎo)致腎臟血管通透性增加引發(fā)出血，還會導(dǎo)致肺功能損傷，具有流行廣、病情急、病死率高的特點。我國是HTNV發(fā)病率最高的國家，然而目前使用的治療方法僅限于支持性治療[15]。在感染早期使用廣譜抗病毒藥物利巴韋林可改善HFRS病癥[16-17]，但利巴韋林存在許多副作用，比如耐藥性。研究報道利巴韋林耐藥的部分CVA6天然復(fù)制保真度較高，在利巴韋林“誘變”作用下不易產(chǎn)生“致命突變”，進而表現(xiàn)出一定的耐藥及毒力減弱[18]；此外，還能引起溶血性貧血和生殖毒性。研究報道，口服治療后最初1～2周內(nèi)出現(xiàn)血紅蛋白下降，其中約10%的患者可能伴隨心肺方面副作用[19]。因此亟需特異性抗HTNV且毒副作用小的藥物。

既往研究報道，EGCG（C22H18O11）作為一種天然化合物，具有高效、廣譜的抗病毒特性?？梢酝ㄟ^多種途徑抑制病毒生命周期的若干階段，表現(xiàn)出獨特的抗病毒活性。在抗人類免疫缺陷病毒（Human immunodificiency virus，HIV）的研究中，EGCG能抑制HIV包膜蛋白gp120與靶細胞受體CD40結(jié)合[20]。在抗乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）的研究中，未使用EGCG時，3種細胞中RXRa的表達量無明顯差異，而FXRa在L02、HepG2、HepG2.2.15中的表達量逐漸增加，說明HBV基因組的存在上調(diào)了FXRa的表達。因此，EGCG可能通過降低RXRa和FXRa的表達來抑制HBV的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制過程[21]。在抗新型冠狀病毒（Corona virus disease 2019，COVID-19）的研究中，冠狀病毒需要3cl蛋白酶來切割其多蛋白，以使單個蛋白質(zhì)發(fā)揮功能。EGCG和茶黃素對SARS-CoV-2 3CL-蛋白酶的抑制作用呈劑量依賴性[22]。本研究試驗結(jié)果顯示，EGCG在A549細胞體系中展現(xiàn)出低細胞毒性及顯著的抗病毒活性。進一步分析表明，EGCG對HTNV的抑制強度與其濃度呈正相關(guān)，即隨著EGCG濃度的逐步提升，其對HTNV的抑制效果也顯著增強，呈現(xiàn)出一種濃度依賴性的抑制模式。根據(jù)病毒的生命周期主要分為吸附、侵入、脫衣殼、生物合成、裝配與釋放6個步驟。進一步探索EGCG發(fā)揮抗病毒作用針對于感染過程中的哪一具體步驟，本研究發(fā)現(xiàn)，在病毒感染初期入胞階段（感染后0～2 h）EGCG有效發(fā)揮抗HTNV作用。而病毒入胞階段又可分為吸附和侵入兩部分，利用4 ℃阻斷侵入試驗進一步檢測抗病毒作用。結(jié)果表明，EGCG有效抑制病毒吸附，而不阻斷病毒侵入。

HTNV的基因組由3個節(jié)段構(gòu)成，分別是L、M及S節(jié)段。L節(jié)段負責(zé)編碼RNA依賴性的RNA聚合酶（簡稱RdRp），在病毒復(fù)制過程中起著核心作用；M節(jié)段則編碼包膜糖蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物進一步細分為Gn和Gc兩種糖蛋白，對于病毒的包膜形成及宿主細胞識別至關(guān)重要；而S節(jié)段編碼核衣殼蛋白（NP），是病毒基因組包裹的核心結(jié)構(gòu)，對于病毒的穩(wěn)定性和感染性具有重要影響。既往研究表明，負鏈RNA病毒多數(shù)依賴基質(zhì)蛋白（Matrix proteins）的動態(tài)出芽特性，利用基質(zhì)蛋白內(nèi)一系列特定的保守功能域，與宿主細胞內(nèi)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運機制（即內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復(fù)合體 Endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）緊密結(jié)合，以促成病毒出芽小泡的高效形成與精確剪切釋放。值得注意的是，Gn蛋白因其獨特的鋅指結(jié)構(gòu)域及與核糖核蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）的結(jié)合位點，可能扮演了與基質(zhì)蛋白相似的重要角色，在HTNV的生命周期中，Gn或能承擔(dān)類似基質(zhì)蛋白的功能，促進病毒的出芽[23]。本研究通過EGCG與Gn、Gc進行分子對接，結(jié)果表明，EGCG與Gn、Gc相互作用的結(jié)合能分別為﹣9.0、﹣7.1 kcal·mol-1。結(jié)合能的值越小越好，EGCG與Gn的結(jié)合潛能高于Gc。提示EGCG與Gn結(jié)合使Gn鋅指結(jié)構(gòu)和RNP結(jié)合位點失活，阻斷其發(fā)揮類似基質(zhì)蛋白的功能。既往研究表明，在固有免疫應(yīng)答中，在探討線粒體自噬機制時，由Gn觸發(fā)的過程能有效通過降解線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS），進而抑制I型干擾素（IFN）的應(yīng)答反應(yīng)。值得注意的是，NP蛋白作為一種競爭性因子，與Gn爭奪與自噬相關(guān)蛋白LC3B的結(jié)合位點。此互作不僅削弱了Gn在促進自噬體形成方面的作用，還通過LC3B與SNAP29的相互關(guān)聯(lián)，阻斷了自噬體與溶酶體的融合進程。綜上所述，NP蛋白通過這一系列復(fù)雜的相互作用，干擾了Gn介導(dǎo)的線粒體自噬降解途徑[24]。分子對接結(jié)果提示EGCG干預(yù)使Gn誘導(dǎo)的線粒體自噬通過降解MAVS抑制IFN限制解除，固有免疫增強。既往研究表明，Gn和Gc糖蛋白異源二聚體可能與特定的細胞表面蛋白β3整合素相互作用，促進hcp致病漢坦病毒進入細胞[25]。分子對接結(jié)果提示EGCG與Gn、Gc結(jié)合，不能結(jié)合細胞表面蛋白β3整合素，進而病毒無法進入細胞。

EGCG作為兒茶素的單體之一，主要源自綠茶。既往研究報道，以每天4杯的頻率飲用綠茶4個月可以減少尿液中8-羥基脫氧鳥苷的含量[26]。在飲用10杯150 mL的綠茶后，對結(jié)直腸腺瘤起到預(yù)防作用[27]。口服補充EGCG可以促進肺癌細胞線粒體中活性氧的產(chǎn)生[28]。EGCG以最佳濃度應(yīng)用于口腔和喉嚨洗滌配方中，可能有助于減少COVID-19患者唾液腺中的病毒載量[11]。EGCG與流感血凝素（HA）抗原的共同給藥誘導(dǎo)了高水平的中和抗體[29]。應(yīng)用廣泛交叉中和單克隆抗體（AR4A）和EGCG預(yù)防HCV感染[2]。綜上，EGCG具有潛在的化學(xué)預(yù)防特性，具有廣譜的抗炎、抗癌作用，在臨床上有較好的發(fā)展?jié)摿?。同時，在抗病毒感染中，其預(yù)防作用成為抗致病病毒新策略的潛在應(yīng)用。

綜上所述，本研究為探究EGCG對HTNV的抑制效應(yīng)，構(gòu)建了HTNV的體內(nèi)外感染模型，經(jīng)過體外試驗驗證，EGCG展現(xiàn)出對HTNV顯著的抑制效果，且這種抑制作用定位于病毒的吸附過程。體內(nèi)試驗表明，給予EGCG有效提升攻毒裸鼠的生存率，延緩攻毒后小鼠體重的降低。深入剖析其機制，初步推斷EGCG可能通過與HTNV的糖蛋白Gn及Gc發(fā)生特異性相互作用，有效阻斷了病毒顆粒與宿主細胞表面的結(jié)合位點，進而實現(xiàn)了對HTNV感染的有效抵抗。這一過程揭示了EGCG在抗病毒策略中的潛在應(yīng)用價值。

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