摘 要：為明確引起廣西欽州市的廣西莪術(shù)葉枯病的病原菌，探究其生物學(xué)特性，并篩選出有效的防治藥劑。該研究利用常規(guī)組織分離法對感病葉片進(jìn)行病原分離，基于柯赫氏法則進(jìn)行致病性測定，并通過病原菌形態(tài)特征并結(jié)合其ITS、TUB基因序列聯(lián)合分析確定其分類地位，同時(shí)利用菌絲生長速率測定法研究病原菌的生物學(xué)特性及4種藥劑的敏感性。結(jié)果表明：（1）根據(jù)病原菌菌落、孢子形態(tài)等特征，以及多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析確定廣西莪術(shù)葉枯病病原菌為間座殼屬真菌菜豆間座殼。（2）最適于該病原菌生長的培養(yǎng)基是PDA，最佳碳源、氮源分別是葡萄糖和蛋白胨；25～28 ℃有利于菌絲生長，致死溫度為56 ℃；pH 5～7有利于菌絲生長；全光照有利于菌絲生長。（3）毒力測定結(jié)果表明，供試的4種藥劑對廣西莪術(shù)葉枯病菌均表現(xiàn)較強(qiáng)的抑制活性，其中250 g·L^-1吡唑醚菌酯EC和75%肟菌·戊唑醇WG的抑菌效果較好，EC₅₀值分別為0.055 0 μg·mL^-1和0.121 6 μg·mL^-1。綜上認(rèn)為，廣西莪術(shù)葉枯病菌為間座殼屬真菌菜豆間座殼，其菌絲生長受溫度、光照、pH、碳氮源條件影響明顯，250 g·L^-1吡唑醚菌酯EC和75%肟菌·戊唑醇WG可作為防治葉枯病的候選藥劑。該研究結(jié)果為廣西莪術(shù)葉枯病的有效防治提供了理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：廣西莪術(shù)，葉枯病，病原菌鑒定，生物學(xué)特性，藥劑篩選

中圖分類號：Q945.8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號：1000-3142（2025）02-0228-12

基金項(xiàng)目：廣西科技重大專項(xiàng)（桂科AA22096021）； 廣西中醫(yī)藥適宜技術(shù)開發(fā)與推廣項(xiàng)目（GZSY23-01）； 廣西中醫(yī)藥多學(xué)科交叉創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（GZKJ2305）； 廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（GXZYA20230012，GXZYA20230006）。

第一作者：宋利沙（1987—），博士，副研究員，主要從事藥用植物病蟲害防治研究，（E-mail）lishasong@126.com。

^*通信作者：張占江，博士，研究員，主要從事藥用植物保育與開發(fā)利用研究，（E-mail）zzj1811@163.com。

Identification，biological characteristics and indoor reagents screening of pathogen causing leaf blight of Curcuma kwangsiensis

SONG Lisha，JIANG Ni，QIU Zhuoqiu，ZHAN Xinjie，ZHANG Zhanjiang^*，WEI Shugen，SHI Lijun，LIN Wei，HUANG Qi，YAN Zhigang

（Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants，Key Laboratory of Guangxi for High-Quality

Formation and Utilization of Daodi Herbs，Nanning 530023，China）

Abstract：In order to identify the pathogen causing leaf blight of Curcuma kwangsiensis in Qinzhou City，Guangxi，and to explore its biological characteristics and to screen out effective reagents. In this study，pathogens were isolated from infected leaves by conventional tissue separation method，pathogenicity was determined based on Koch’s rule，and their classification status was determined by morphological characteristics of the pathogen combined with the analysis ITS and TUB gene sequences. At the same time，biological characteristics of the pathogen and sensitivities of four reagents were studied by mycelium growth rate measurement method. The results were as follows：（1） Diaporthe phaseolorum was identified as the pathogen causing leaf blight of Curcuma kwangsiensis in Guangxi based on the characteristics of pathogen colony，spore morphological characteristics and multi-gene phylogenetic analysis. （2） The most suitable medium for growth of the pathogen was PDA，and the best carbon and nitrogen sources were glucose and peptone，respectively. The temperature between 25 ℃ and 28 ℃ was favorable for mycelium growth，and the lethal temperature was 56 ℃. pH 5-7 was favorable for mycelial growth. Full light was favorable for mycelial growth. （3） The results of the virulence test showed that all the four fungicides tested showed strong inhibitory activity against C. kwangsiensis leaf blight. Among them，and 250 g·L^-1 pyraclostrobin EC and 75% oximme·pentazolol WG showed the best inhibitory effect，with EC₅₀ values of 0.055 0 μg·L^-1 and 0.121 6 μg·mL^-1，respectively. In conclusion，the pathogen of leaf blight of C. kwangsiensis belongs to Diaporthe phaseolorum. The mycelial growth of D. phaseolorum is significantly affected by temperature，light，pH，carbon and nitrogen source conditions，and 250 g·L^-1 pyraclostrobin EC and 75% oximme·pentazolol WG can be used as candidate reagents to control leaf blight. The results provide theoretical guidance for effective prevention and control of leaf blight of C. kwangsiensis in Guangxi.

Key words：Curcuma kwangsiensis，leaf blight，pathogen identification，biological characteristics，reagent screening

廣西莪術(shù)（Curcuma kwangsiensis），為姜科（Zingberaceae），姜黃屬（Curauma L.）植物，又稱“毛莪術(shù)”或“桂莪術(shù)”，與蓬莪術(shù)（C. phaeocaulis）、溫郁金 （C. wenyujin）同為中藥材莪術(shù)的基源植物（中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì)，1981；國家藥典委員會(huì)，2020）。中藥材莪術(shù)為歷版《中國藥典》收載品種，是廣西“桂十味”道地藥材，具有行氣破血、消積止痛、清心涼血等功效，現(xiàn)代研究表明莪術(shù)中含有揮發(fā)油類和姜黃素類活性化學(xué)成分，這兩類成分都具有抗腫瘤、抗凝血、抗血小板聚集等功效（李澤宇等，2021）。隨著莪術(shù)藥用功效的不斷挖掘和開發(fā)，藥材需求量不斷增加，廣西莪術(shù)種植面積也隨之在逐年擴(kuò)大，由2022年的2 333 hm²擴(kuò)大至2023年的3 333 hm²，主要分布在欽州市靈山縣、玉林市博白縣、賀州市八步區(qū)、南寧市隆安縣等多個(gè)市縣，其中欽州市靈山縣是廣西莪術(shù)道地核心產(chǎn)區(qū)，占全廣西種植面積的40%。

葉部病害是影響廣西莪術(shù)生長過程中的一類重要病害，2022—2023年廣西靈山縣陸屋鎮(zhèn)葉枯病較為嚴(yán)重，發(fā)病率為30%～50%，嚴(yán)重發(fā)生的地塊發(fā)病率高達(dá)80%。病害田間癥狀多表現(xiàn)為早期在葉尖、葉緣或葉中處出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)，隨著病原菌的不斷侵染，病斑逐漸向葉中脈擴(kuò)展，引起葉片大面積枯黃，后期整株萎蔫枯死，嚴(yán)重影響廣西莪術(shù)的栽培生產(chǎn)。關(guān)于廣西莪術(shù)病害的研究較少，僅見蔣妮等（2016）報(bào)道莖點(diǎn)霉屬真菌Phomopsis sp.引起廣西隆安縣栽培種植的廣西莪術(shù)葉斑病，與其癥狀相似但是不同，在田間容易混淆，葉斑病形成邊緣褐色、中間暗褐色并凹陷的“V”形大病斑，病斑上可見黑色小顆粒（分生孢子器）；王晗怡（2023）報(bào)道由間座殼屬真菌引起廣西莪術(shù)葉枯病病原菌發(fā)病癥狀與蔣妮等（2016）報(bào)道的相似，但其對該病原菌形態(tài)和分子鑒定結(jié)果與蔣妮等（2016）報(bào)道的不是同一種病原菌。此外，還有少量研究姜黃屬植物葉部病害的報(bào)道，如李珊珊（2021）報(bào)道由擬盤多毛孢屬Neopestalotiopsis asiatica真菌可引起蓬莪術(shù)葉枯病，并對該病原菌進(jìn)行了生物學(xué)特性和室內(nèi)藥劑篩選的研究；馮阿芳（2012）和馬瑞（2018）對溫郁金葉部病害進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由辣椒炭疽菌（Colletotrichum urcumaei）和郁金炭疽菌（C. curcumae）引起溫郁金的葉斑病，而張興國等（2005）僅描述了溫郁金炭疽病的發(fā)病癥狀和化學(xué)防治，沒有做詳細(xì)的研究。蓬莪術(shù)、溫郁金病原菌的鑒定均采用了目前常用的形態(tài)鑒定結(jié)合構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹的方法（多個(gè)序列），但目前廣西莪術(shù)僅通過ITS測序，鑒定到屬，未能明確種且病樣來源為廣西隆安縣，在核心產(chǎn)區(qū)靈山縣發(fā)生的廣西莪術(shù)葉枯病的致病菌、生物學(xué)特性和室內(nèi)藥劑的種類與前人報(bào)道的是否一致目前尚不清楚。

基于以上情況，對于廣西莪術(shù)主產(chǎn)區(qū)靈山的葉枯病病原菌是否與隆安地區(qū)的一致，以此為防治靶標(biāo)篩選出有效的防治藥劑，同時(shí)掌握病原菌生物學(xué)特性，對今后制定防治策略，實(shí)現(xiàn)病害的科學(xué)防治具有重要意義。為此，本研究通過常規(guī)組織分離法對廣西欽州市靈山縣的廣西莪術(shù)葉枯病病原菌進(jìn)行分離純化，并進(jìn)行致病性測定，再結(jié)合形態(tài)和多基因序列分析確定病原菌的分類地位，測定其生物學(xué)特性，并研究4種藥劑對致病菌的室內(nèi)抑制活性，以期為廣西莪術(shù)的田間防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

樣品來源：廣西莪術(shù)為一年生植物，3月份種植，病葉采集于2022年7月采集于廣西欽州靈山陸屋鎮(zhèn)（109°17′27.60″ E、22°24′59.36″ N）。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（potato sucrose agar，PSA）、燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基（oatmeal agar，OMA）、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（corn meal agar，CMA）、沙氏培養(yǎng)基（sabourauds agar，SDA），其主要配方參考曹秀秀（2021）中的方法。

供試化學(xué)藥劑：室內(nèi)抑菌試驗(yàn)的藥劑見表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離純化 參考方中達(dá)（1998）的常規(guī)組織法分離，取新鮮感病樣品的病健交界處，剪取5 mm × 5 mm大小的組織塊，用75%乙醇消毒30 s，2.5%的次氯酸鈉消毒3 min，無菌水沖洗3遍，晾干，然后轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，置于恒溫28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待長出菌落后，將新長出的菌絲尖端轉(zhuǎn)入新的PDA平板，純化于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d備用。

1.2.2 致病性測定試驗(yàn) 采用葉片離體試驗(yàn)進(jìn)行致病性測定。選取健康廣西莪術(shù)幼苗的葉片，先用自來水沖洗葉片表面的灰塵，晾干，再用75%乙醇進(jìn)行表面消毒，于葉片正面中部對稱的兩邊用無菌接種針形成傷口，在培養(yǎng)基上取直徑8 mm菌塊，菌絲朝向接種葉片傷口處，以PDA為對照，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每處理3次重復(fù)，每天觀察并記錄葉片發(fā)病情況。葉片發(fā)病后再次分離，并鑒定與接種用的菌株形態(tài)是否一致，完成柯赫氏法則驗(yàn)證（謝聯(lián)輝，2006）。

1.2.3 病原菌鑒定 參考方中達(dá)（1998）的方法記錄菌落形態(tài)，參考魏景超（1979）的方法和國際分類網(wǎng)站（http：//www.indexfungorum.org）進(jìn)行菌落形態(tài)初步鑒定。參考Kumar等（2016）的方法，利用MEGA 7.0的鄰位連接法構(gòu)建ITS rDNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定；采用MightyAmp DNA Polymerase Ver.3 （1.25 U/50 μL）試劑盒（Takara Bio Inc.，Japan，cat. no. R076A），利用核糖體DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS（ITS1/5′-TCCGTAGG

TGAACCTGCGG-3′、ITS4/5′-TCCTCCGCTTATTGAT

ATGC-3′）（White et al.，1990）、β-微管蛋白 TUB（T1/5′-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3′、Bt-2b/5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）（Dong et al.，2021）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，挑取培養(yǎng)內(nèi)生真菌的菌落作為模板直接用于PCR反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×MightyAmp Buffer 25 μL，10×Addtitive for High Specificity 5 μL，引物ITS1和ITS2（15 pmol）以及β-微管蛋白TUB（T1/Bt-2b）各1.5 μL，加ddH₂O定容至50 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸60 s，40個(gè)循環(huán)；最后68 ℃延伸10 min?？瞻讓φ諡閐dH₂O。利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，將有目的條帶的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，所得序列在NCBI GenBank進(jìn)行BLAST比對，下載鄰近屬種序列（表2），應(yīng)用MEGA 7.0軟件鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 病原菌的生物學(xué)特性 選用廣西莪術(shù)葉枯病病原菌進(jìn)行生物學(xué)特性試驗(yàn)，設(shè)置培養(yǎng)基、溫度、光照、pH值、碳源和氮源6個(gè)變量進(jìn)行生物學(xué)特性，參考曹秀秀（2021）和但雨柔等（2023）的設(shè)計(jì)，方法略有改進(jìn)。

1.2.4.1 不同培養(yǎng)基對病原菌生長的影響 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）、燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基（OMA）、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA）和沙氏培養(yǎng)基（SDA）。將廣西莪術(shù)病菌菌株組織塊（直徑為6 mm）接種于5種培養(yǎng)基的中央，每皿置放1個(gè)菌餅，每個(gè)處理重復(fù)3次，置于28 ℃的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5 d，采用十字交叉法測量菌落大小，找到最適培養(yǎng)基。

1.2.4.2 不同溫度、光照及pH值對病原菌生長的影響 在PDA培養(yǎng)基上接種廣西莪術(shù)病菌菌株組織塊（直徑為6 mm）分別置于5、10、15、20、25、28、30、35、40 ℃的培養(yǎng)箱里進(jìn)行黑暗培養(yǎng)；光照設(shè)置處理為L/D=24 h/0 h、L/D=0 h/24 h、L/D=12 h/12 h 3種，溫度設(shè)置為恒溫28 ℃；用濃度為1 mol·L^-1的HCl溶液和NaOH 溶液配制pH為2、3、4、5、6、7、8、9、10不同梯度的PDA培養(yǎng)基。各處理?xiàng)l件設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每日觀察，5 d后用十字交叉法測量菌落大小。

1.2.4.3 不同致死溫度對病原菌生長的影響 參考曹秀秀（2021）和但雨柔等（2023）的方法，研究病原菌菌落的致死溫度。

1.2.4.4 不同碳源、氮源對病原菌生長的影響

以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將2%添加量的葡萄糖替換為相同質(zhì)量的蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、甘露醇、肌醇作碳源；以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將0.3%添加量的硝酸鈉替換為相同質(zhì)量的硝酸鈉、硫酸銨、半胱氨酸、蛋白胨、硝酸鉀作為氮源。每皿放1個(gè)菌餅，每個(gè)處理3次重復(fù)，放置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5 d，觀察菌落的形態(tài)，采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.5 室內(nèi)藥劑篩選 采用菌絲生長速率法對廣西莪術(shù)葉枯病菌進(jìn)行毒力測定。將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，將菌餅（直徑為6 mm）按照供試藥劑母液設(shè)定的濃度比例加入到已融化冷卻至50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，混勻后倒入無菌培養(yǎng)皿中，制成含不同濃度藥劑的平板（以不加供試藥劑的PDA培養(yǎng)基作為空白對照），在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，采用十字交叉法測量菌落直徑做好記錄并計(jì)算抑菌率。供試藥劑濃度參照表1。

菌絲生長抑制率＝ ［（對照菌落直徑-菌餅直徑）-（處理菌落直徑-菌餅直徑）］/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

利用SPSS 19.0來計(jì)算EC₅₀值、斜率±標(biāo)準(zhǔn)誤差、卡方值、自由度和P值。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），選用LSD和Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行組間的多重比較，不同小寫字母表示差異顯著（Plt;0.05）。生物學(xué)特性的柱狀圖采用Origin 2018軟件進(jìn)行制圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣西莪術(shù)葉枯病癥狀及病原菌致病性測定

田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)廣西莪術(shù)葉枯病在老葉和嫩葉均可發(fā)病，一般從葉尖或葉緣開始發(fā)病，發(fā)病率30%～50%。癥狀早期表現(xiàn)為葉片出現(xiàn)淡黃色斑點(diǎn)，周圍有黃色暈圈，隨著病情的發(fā)展，病斑逐漸由葉緣向葉片內(nèi)部擴(kuò)展，嚴(yán)重時(shí)擴(kuò)展至整個(gè)葉片，導(dǎo)致整株葉片發(fā)黃枯萎（圖1：A、B）。

從采集的5張病葉樣品中共分離菌株8株菌株，菌落形態(tài)為白色絮狀，分離率最高，達(dá)到87.5%，將這8株都進(jìn)行刺傷接種，發(fā)現(xiàn)只有分離頻率最高的菌株E-10成功侵染，發(fā)病最快。將菌株E-10接種于健康的廣西莪術(shù)葉片上，48 h開始發(fā)病，病斑呈水漬狀，到接種4 d時(shí)病斑外圍有明顯的黃色暈圈，接種6 d后病斑完全黃化枯萎，與田間發(fā)病癥狀相似（圖1：C、D、E），對照葉片未見感病癥狀（圖1：F）。再次重新分離發(fā)病的葉片，得到的菌株與接種病菌一致，由此驗(yàn)證柯赫氏法則，確定廣西莪術(shù)病菌菌株E-10為致病菌。

2.2 病原菌的形態(tài)鑒定

由圖2：A、B可知，菌株E-10菌落正面為白色絮狀，菌落呈散射狀，菌落背面為米黃色無輪紋；在光學(xué)顯微鏡下觀察到α型孢子為長圓形（圖2：C），兩端較平，單胞，大小為（3.05～3.35）μm ×（0.81～1.16） μm，β型孢子為線型（圖2：D），一端呈彎鉤狀，較尖，另一端平而圓潤，大小為（16.87～24.98） μm ×（0.89 ～1.68） μm。根據(jù)上述形態(tài)特征，初步認(rèn)為病原菌E-10為間座殼屬真菌Diaporthe sp.。

2.3 病原菌的生物學(xué)特性

2.3.1 不同溫度對E-10病原菌菌絲生長的影響 由圖3：A可知，菌株E-10在10～35 ℃之間均能生長，適宜溫度范圍為25～30 ℃，在較低（5 ℃）和較高（40 ℃）溫度下菌絲不再生長，培養(yǎng)5 d后，在25 ℃和28 ℃下菌絲生長直徑較大，分別達(dá)8.50 cm和8.32 cm，這兩者溫度差異不顯著（Pgt;0.05），但與其他溫度處理差異顯著（Plt;0.05）；超過30 ℃時(shí)菌株E-10菌絲對溫度比較敏感。故E-10病原菌的菌絲生長最適溫度為25～28 ℃。

菌株E-10經(jīng)不同溫度處理20 min后，其菌落還能長出菌絲，然后把55 ℃加了2個(gè)梯度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)56 ℃時(shí)菌絲停止生長，故菌株E-10菌絲致死溫度為56 ℃下處理20 min。

2.3.2 不同光照對病原菌E-10的生長影響 由圖3：B可知，菌株E-10在L/D=24 h/0 h、L/D=12 h/12 h、L/D=0 h/24 h 3種條件下均能生長，并均有黃色色素產(chǎn)生，菌落直徑分別為8.35、6.2、4.97 cm，以L/D= 24 h/0 h條件下生長最佳，與L/D= 0 h/24 h條件下的菌絲生長有顯著性差異（Plt;0.05），說明菌絲生長對光照的要求比較高。

2.3.3 不同pH對病原菌E-10菌絲生長的影響 由圖3：C可知，病原菌E-10菌絲在pH 2～10均能生長，其中pH值為5、6、7時(shí)菌落直徑分別為5.85、5.83、7.58 cm，三者的菌落直徑差異不顯著（Pgt;0.05），但與其他pH條件存在顯著性差異（Plt;0.05），這說明該菌適宜在偏酸和中性環(huán)境生長。

2.3.4 不同培養(yǎng)基對病原菌E-10菌絲生長的影響 由圖3：D可知，病原菌E-10菌絲在5種培養(yǎng)基上均能生長，其中在PDA上生長最快，培養(yǎng)5 d菌落直徑為8.45 cm且菌絲濃密，其他依次為沙氏培養(yǎng)基（SDA）、蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA）、燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基（OMA），這5種培養(yǎng)基菌落直徑差異不顯著（Pgt;0.05）。故這5種培養(yǎng)基均適合E-10菌絲的生長。

2.3.5 不同碳氮源對病原菌E-10菌絲生長的影響 由圖3：E可知，病原菌E-10在供試的7種碳源培養(yǎng)基上菌絲均能生長，其中菌落直徑最大的是葡萄糖4.67 cm，與其他碳源有顯著性差異（Plt;0.05），其他依次為乳糖、麥芽糖、蔗糖、肌醇、甘露醇，最小的是可溶性淀粉，直徑為3.47 cm。

由圖3：F可知，在供試的6種氮源中，病原菌E-10對蛋白胨利用率最高，菌絲生長較好，氣生菌絲茂密，菌落直徑最大，為6.77 cm，與其他氮源存在顯著性差異（Plt;0.05）。對半胱氨酸不能利用，說明病原菌E-10不能在瓊脂培養(yǎng)基生長。綜上認(rèn)為，病原菌E-10碳氮源分別是葡萄糖和蛋白胨。

2.4 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

病原菌菌株E-10經(jīng)ITS和TUB基因序列測定，得到序列長度分別為547 bp和741 bp，經(jīng)BLAST比對，與間座殼屬的菜豆間座殼同源性很高，達(dá)99%。下載相關(guān)的參考序列，利用ITS和TUB序列聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，菌株E-10與間座殼屬的菜豆間座殼聚集在一個(gè)分支，支持率均達(dá)到99%。結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)特征和分子系統(tǒng)發(fā)育樹分析的結(jié)果，確定菌株E-10為間座殼屬真菌菜豆間座殼，其在GenBank登錄號分別是OK175678、OK326872。

2.5 病原菌室內(nèi)藥劑篩選

由表3可知，4種藥劑對廣西莪術(shù)葉枯病病原菌均有一定的抑制作用，其中250 g·L^-1吡唑醚菌酯EC和75%肟菌·戊唑醇WG的抑菌效果較好，EC₅₀值分別為0.055 0 μg·mL^-1和0.121 6 μg·mL^-1，1 bn·g^-1哈茨木霉菌SC和98%噁霉靈SP，EC₅₀值分別為1.998 6 μg·mL^-1和4.173 6 μg·mL^-1。綜上認(rèn)為，這4種藥劑均可考慮為田間防治廣西莪術(shù)葉枯病的候選藥劑。

3 討論與結(jié)論

間座殼屬（Diaporthe）真菌主要采取無性型和有性型雙重命名法，其無性型和有性型分別為擬莖點(diǎn)霉屬（Phomosis）和間座殼屬，自2011年在墨爾本的命名會(huì)議上，決定棄用雙命名系統(tǒng)，采用“一個(gè)真菌一個(gè)名稱”規(guī)則，該屬真菌被命名為間座殼屬（魏景超，1979），間座殼屬由于發(fā)表時(shí)間比擬莖點(diǎn)霉屬早而取得該屬命名上的優(yōu)先權(quán)，所以擬莖點(diǎn)霉屬這一名稱逐漸被棄用（Taylor，2011）。間座殼屬真菌可為害葉片、枝干和果實(shí)等部位發(fā)病，很少侵染根部，主要表現(xiàn)為壞死、葉片斑點(diǎn)、潰爛、萎蔫和枯死等癥狀，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失（Stantos amp; Phillips，2009; Manawasinghe et al.，2019；俞婷，2021；陳瑤等，2020）。本研究中的病原菌主要為害廣西莪術(shù)的葉片，呈現(xiàn)枯死癥狀，與前人研究的癥狀相似（蔣妮等，2016；李珊珊，2021；王晗怡，2023），但病原菌種類和生物學(xué)特性不同，可能由于采樣的時(shí)間、地點(diǎn)和環(huán)境不同導(dǎo)致結(jié)果也存在差異。本文通過柯赫氏法則驗(yàn)證了分離的菌株E-10對廣西莪術(shù)葉枯病的致病性，利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)（多基因序列ITS、TUB）鑒定，確定引起廣西莪術(shù)葉枯病的病原菌為間座殼屬真菌菜豆間座殼，其無性階段為擬莖點(diǎn)霉屬真菌Phomosis sp.，這個(gè)病原菌侵染廣西莪術(shù)葉片枯萎的研究是首次報(bào)道。

關(guān)于菜豆間座殼生物學(xué)特性的研究較少，主要集中在大豆莖部病害（沈浩，2015），藍(lán)莓座殼莖潰瘍病和獼猴桃黑點(diǎn)病也有人報(bào)道（李媛等，2017；Thomidis et al.，2019；王麗，2022），但研究較多的為其他間座殼屬真菌。如Diaporthe tulliensis可引起桐樹葉斑病、可可豆莢腐病和獼猴桃莖潰瘍病等植物病害，隨著種植規(guī)模的擴(kuò)大，其為害程度也有增大的趨勢（Bai et al.，2017；李澤宇等，2022; Serrato-Diaz et al.，2022）。間座殼屬真菌菌株不同，其生物學(xué)特性也不一致。陳瑤等（2020）和符致蕾等（2017）研究發(fā)現(xiàn)降香黃檀葉枯病菌（Phomopsis asparagi）和杧果枝枯病病原菌（P. mangiferae），最適宜的生長溫度為25～30 ℃，最適宜的pH分別為6和7，光照對這兩種病原菌的生長均沒有顯著影響，這一結(jié)果與本研究的生長溫度和pH范圍一致。顧立明等（2013）報(bào)道桃枝枯病病原菌（P. amygdali）適宜在PDA、PSA和燕麥培養(yǎng)基上生長，20～25 ℃適宜菌絲生長，最適碳氮源分別為蔗糖和硝酸鉀、丙氨酸，最適宜的pH值為6～7，與本文報(bào)道的pH范圍一致，與其他條件有一定的差異，這可能由于寄主和病原菌種類不同，所種植的地理位置和生境不同，導(dǎo)致生物學(xué)特性存在差異。同一病原真菌因面對不同植物和不同生境所表現(xiàn)出的生物學(xué)特性也存在著一定差異（何彩梅，2011）。P. eucommicola 是引起楊樹黑斑型潰瘍病和杜仲樹皮腐爛病的病原真菌，為害楊樹的病原菌最適的菌絲生長溫度為22 ℃，最適pH值為5.5，而此病原菌為害杜仲的最適菌絲生長溫度為30 ℃，最適pH值為7（鄭華英等，2011）。此外，相同病原菌在同一寄主上，其生物學(xué)特性也是不同，研究茄褐紋病菌P. vexans生物學(xué)特性發(fā)現(xiàn)，該菌生長最適溫度為25 ℃和28 ℃，最適pH值為6和7，全黑暗和自然光條件下菌絲生長速度都快，最佳碳源和氮源分別為麥芽糖、蔗糖和蛋白胨、硝酸鉀、硝酸鈉（馬珂，2005；葉瑩等，2021）。

本研究通過4種藥劑對廣西莪術(shù)葉枯病菌均表現(xiàn)較強(qiáng)的毒力，其中250 g·L^-1吡唑醚菌酯EC和75%肟菌·戊唑醇WG的抑菌效果較好，其次是1 bn·g^-1哈茨木霉菌SC和98%噁霉靈SP。吡唑醚菌酯和肟菌·戊唑醇是甲氧基丙烯酸酯類藥劑，通過抑制線粒體呼吸作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，具有很強(qiáng)的滲透性和內(nèi)吸傳導(dǎo)功能，對病害具有預(yù)防、保護(hù)、治療、鏟除等多種功能。75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑（WG）、32.5%苯甲·嘧菌酯懸浮劑（SC）等藥劑對太子參葉斑病的防效在80%以上（王懷震，2014）；97%嘧菌酯原藥對蓬莪術(shù)（Curcuma phaeocaulis）分生孢子萌發(fā)有較強(qiáng)抑制作用，EC₅₀值為0.027 7 μg·mL^-1（李珊珊，2021）；馬瑞（2018）測定10種殺菌劑對海南溫郁金（C. wenyujin）白絹病病原菌的室內(nèi)毒力，結(jié)果表明吡唑醚菌酯的抑菌效果較強(qiáng)，EC₅₀值小于1 μg·mL^-1（馬瑞，2018）；Tao等（2020）發(fā)現(xiàn)黃精葉枯病菌（Diaporthe eres）對咪鮮胺、戊唑醇和吡唑醚菌酯有較高的敏感性。以上結(jié)果與本研究結(jié)果較為一致，表明吡唑醚菌酯和戊唑醇類對廣西莪術(shù)葉枯病菌具有較好的敏感性，可為田間防治提供了技術(shù)支撐。此外，本文還發(fā)現(xiàn)生物源藥劑哈茨木霉菌對廣西莪術(shù)葉枯病間座殼屬病菌菜豆間座殼有較好的抑菌效果，為廣西莪術(shù)葉枯病的科學(xué)用藥提供理論支持。由于本試驗(yàn)結(jié)果在室內(nèi)條件完成，因此還需進(jìn)一步在田間試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）