廣西生姜鐮刀菌枯萎病病原菌的分離鑒定

摘要：為確定引起廣西生姜鐮刀菌枯萎病的病原菌種類，研究采集了廣西生姜主產(chǎn)區(qū)疑似鐮刀菌枯萎病的生姜病株，采用組織分離法分離純化獲得16株病原菌菌株，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和TEF-1α序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，并接種3株典型菌株的分生孢子懸浮液進(jìn)行致病性測(cè)定。結(jié)果表明：16株菌株均與尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）聚為一支，經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證，明確了尖孢鐮刀菌是引起廣西生姜鐮刀菌枯萎病的主要病原菌。

關(guān)鍵詞：生姜鐮刀菌枯萎??；病原菌鑒定；尖孢鐮刀菌

中圖分類號(hào)：S436.32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2025）02-0054-05

Isolation and Identification of the Pathogen Causing Ginger Fusarium Wilt in Guangxi

YANG Wei-chao1，2，LI Xiao-li1，WEN Jun-li3，HUANG Hao3，ZHOU Sheng-mao3，YUAN Gao-qing1

（1. College of Agriculture， Guangxi University， Nanning 530004， PRC; 2. Lechang Branch， Guangdong Tobacco Shaoguan City Co.， Ltd.， Lechang 512200， PRC; 3. Vegetable Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， PRC）

Abstract： This study aims to identify the pathogen causing ginger Fusarium wilt in Guangxi. The plant samples with suspected ginger Fusarium wilt were collected from main ginger-producing areas in Guangxi. A total of 16 pathogen strains were isolated by the tissue culture method and identified by morphological observation and TEF-1α sequence analysis. The pathogenicity of three typical strains was determined by inoculating the conidial suspensions. The results showed that all the 16 isolates were clustered with Fusarium oxysporum in the phylogenetic tree and their pathogenicity was confirmed according to Koch's postulates. In conclusion， F. oxysporum was the main pathogen causing ginger Fusarium wilt in Guangxi.

Key words： ginger Fusarium wilt; pathogen identification; Fusarium oxysporum

生姜（Zingiber officinale Rosc.）為姜科姜屬草本植物，是中國重要的經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)地主要分布于山東、四川、云南、廣西等省份。其中廣西生姜的種植面積和年產(chǎn)量均位居全國第三，且呈現(xiàn)逐年增長的趨勢(shì)，生姜已成為廣西的優(yōu)勢(shì)特色農(nóng)作物之一[1]。近年來中國生姜種植面積不斷擴(kuò)大，且長期采用無性繁殖和重茬種植，導(dǎo)致卵菌、真菌、細(xì)菌和線蟲等多種土傳病原物連年累積，不同土傳病害頻發(fā)，其中由鐮刀菌屬（Fusarium）真菌引起的枯萎病是生姜主要土傳病害之一。鐮刀菌主要是從植物塊莖或莖基部的自然孔口或傷口侵入寄主植物，破壞根莖部或維管束組織，嚴(yán)重影響植物對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收，最終導(dǎo)致植物枯萎死亡。枯萎病一般造成生姜減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)50%以上，甚至絕產(chǎn)[2]。1930年生姜枯萎病首次記錄于澳大利亞昆士蘭州，1942年調(diào)查顯示致病微生物為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）[3]。據(jù)研究，尖孢鐮刀菌、尖孢鐮刀菌姜專化型（F. oxysporum f. sp. zingiberi）、輪枝鐮刀菌（F. verticillioides）和腐皮鐮刀菌（F. solani）等均可侵染生姜引發(fā)枯萎病[4-7]。

筆者對(duì)廣西生姜病害種類進(jìn)行調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)進(jìn)入5月份高溫高濕天氣后，田間生姜陸續(xù)出現(xiàn)全株萎蔫現(xiàn)象，其中大部分為青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的生姜青枯病[8]，一部分疑似為鐮刀菌引起的生姜枯萎病。雖然國內(nèi)外已有一些對(duì)鐮刀菌引發(fā)的生姜枯萎病的研究報(bào)道[2-7，9-13]，但是關(guān)于廣西生姜枯萎病危害情況及病原菌種類的研究報(bào)道仍然較少。因此，本研究采集廣西生姜主產(chǎn)區(qū)疑似鐮刀菌枯萎病的生姜病株，采用組織分離法分離病原菌，通過形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定和柯赫氏法則確定病原菌種類，以期為當(dāng)?shù)厣牭毒菸〖捌渌羵鞑『Φ脑\斷與防治提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 田間調(diào)查與采樣

采樣于2023年5—12月（生姜土傳病害主要發(fā)生時(shí)期）在廣西南寧市、賀州市、梧州市、桂林市、玉林市和百色市等生姜種植基地進(jìn)行，采用平行跳躍法取樣調(diào)查，每個(gè)調(diào)查點(diǎn)取2～5塊田，仔細(xì)觀察并記錄發(fā)病生姜植株癥狀特點(diǎn)，參考潘汝浩等[2]的方法對(duì)病株進(jìn)行分級(jí)，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)。采集疑似生姜鐮刀菌枯萎病病株的姜塊和莖基部組織，帶回實(shí)驗(yàn)室開展后續(xù)研究。

1.2 病原菌的分離純化及形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)于有子實(shí)體產(chǎn)生的病組織，直接挑取子實(shí)體制片鏡檢；對(duì)于無子實(shí)體產(chǎn)生的病組織，取病健交界處組織在顯微鏡下觀察有無噴菌現(xiàn)象。選擇產(chǎn)生鐮刀菌霉層的病組織和無明顯噴菌現(xiàn)象的病組織，采用組織分離法分離病原菌[14]。具體操作步驟如下：取姜塊病健交界處大小為0.3 cm×0.5 cm的組織，置于75%酒精中消毒30 s，轉(zhuǎn)入5.5%次氯酸鈉溶液中消毒30 s，經(jīng)無菌水漂洗3次后，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，28℃下恒溫培養(yǎng)3 d。

待培養(yǎng)基上長出菌絲后，在顯微鏡下用滅菌鑷子挑取單菌落邊緣菌絲尖端于PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)1～

2次，觀察記錄菌落、厚垣孢子、產(chǎn)孢細(xì)胞和分生孢子的特征，并隨機(jī)選取50個(gè)分生孢子測(cè)量其大小。

1.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

收集病原菌的菌絲體，按照Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒說明書的方法提取其DNA。使用鐮刀菌屬通用引物TEF-1αF（5'-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3'）和TEF-1αR（5'-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3'）對(duì)轉(zhuǎn)錄延伸因子-1α（TEF-1α）進(jìn)行PCR擴(kuò)增[15]。PCR擴(kuò)增體系（25.0 μL）：2×Taq PCR"MasterMix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板DNA"1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。取5.0 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，110 V電壓下電泳25 min，將瓊脂糖凝膠置于掃描儀中觀察并拍照記錄。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送置生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。在NCBI數(shù)據(jù)庫中對(duì)序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定其同源性；利用ClustalW將比對(duì)序列對(duì)準(zhǔn)，使用MEGA 6.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定分離所得菌株的分類地位。

1.4 病原菌的致病性測(cè)定

為驗(yàn)證分離所得菌株的的致病性，根據(jù)鑒定結(jié)果選擇3株代表性菌株，采用刺傷生姜莖基部再接種

分生孢子懸浮液的方法對(duì)生姜植株進(jìn)行有傷接種[14]。用打孔器打取菌餅置于馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）中，于28℃、220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d，用血球計(jì)數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，用無菌水將孢子懸浮液濃度稀釋為1×106個(gè)/mL。選取培養(yǎng)了50 d且長勢(shì)一致的健康生姜幼苗，使用牙簽刺傷生姜莖基部，接種10 mL孢子懸浮液，以接種相同體積相同濃度的PDB培養(yǎng)液為對(duì)照，每個(gè)處理10株姜苗。把接種后的生姜置于（28±5）℃的溫室大棚中，觀察并記錄發(fā)病情況。待接種后的植株出現(xiàn)明顯發(fā)病癥狀后，從姜塊或莖基部病健交界處取樣，并按照組織分離法對(duì)病原菌再次進(jìn)行分離鑒定，以完成柯赫氏法則的驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀特點(diǎn)

在桂林市灌陽縣和靈川縣、玉林市博白縣以及南寧市邕寧區(qū)4個(gè)生姜種植區(qū)采集樣品時(shí)，觀察到田間生姜植株從下到上葉片邊緣發(fā)黃卷曲，有的整株黃化萎蔫，逐步枯死；地下部分生姜塊莖表皮褐變，有的產(chǎn)生白色霉層，剖開塊莖維管束發(fā)現(xiàn)褐變；病株無明顯惡臭（圖1）。田間有明顯發(fā)病中心，發(fā)病率為5%～18%，病情指數(shù)為3.00～11.33。

2.2 病原菌分離結(jié)果及形態(tài)特征

挑取霉層在光學(xué)顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)有大量鐮刀菌屬真菌的小型分生孢子；取植株病健交界處組織鏡檢，無明顯噴菌現(xiàn)象；據(jù)此初步推測(cè)病害為生姜鐮刀菌枯萎病。從病害標(biāo)樣中共分離獲得16株病原菌菌株。將菌株置于PDA培養(yǎng)基上28℃黑暗條件下培養(yǎng)，菌株生長4 d后，菌落直徑為4.5 cm；生長7 d后，菌落基本布滿直徑9 cm的平板。由圖2可知，菌落前期呈白色，后期產(chǎn)生紫色色素，氣生菌絲呈絨狀；小型分生孢子數(shù)量眾多，形狀多為卵圓形或腎形，有時(shí)呈假頭狀著生在產(chǎn)孢細(xì)胞上，大小為（5.0～12.6）μm×（2.5～3.6）μm；產(chǎn)孢細(xì)胞短，單瓶梗，在菌絲上分散生長，在分生孢子座上多分枝成叢；典型大型分生孢子未見產(chǎn)生；厚垣孢子呈球形，單生或?qū)ι?。以上形態(tài)特征與鐮刀菌屬真菌相符[16]。

2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

經(jīng)測(cè)序可知，16株鐮刀菌屬菌株的TEF-1α序列長度約為650 bp（NCBI登錄號(hào)：PP941939-PP941954）。Blastn比對(duì)結(jié)果顯示，這些菌株與Fusarium oxysporum"FOEP 42.1300 （NCBI登錄號(hào)為OR965935）的相似度達(dá)到了100%。采用鄰接法進(jìn)行1 000次重復(fù)，通過Bootstraps檢驗(yàn)后建立系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖3可知，16株菌株與尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）以99%的支持率聚在一起。

2.4 病原菌的致病性測(cè)定結(jié)果

在生姜植株莖基部分別接種3株菌株的孢子懸浮液，由圖4可知，接種7 d后，接種部位出現(xiàn)褐變并逐漸向周圍蔓延，葉片邊緣發(fā)黃卷曲，隨后表現(xiàn)為整葉失綠、黃化；接種10 d后，發(fā)病嚴(yán)重的生姜地上部分枯萎，莖稈內(nèi)維管束發(fā)生褐變；接種20 d

后，地下部分腐爛變褐，最終整株倒伏枯死。對(duì)照組生姜未發(fā)病。取發(fā)病生姜塊莖病健交界處組織，按照組織分離法重新分離，得到的菌株與接種菌株一致，說明以上菌株對(duì)生姜具有致病性。結(jié)合形態(tài)特征和分子序列鑒定，確定尖孢鐮刀菌是引起廣西生姜枯萎病的主要病原菌。

3 討論與結(jié)論

長期以來，多種土傳病害嚴(yán)重威脅了廣西生姜的生產(chǎn)，降低了產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量。這些病害田間為害癥狀相似，病原種類復(fù)雜，包括青枯雷爾氏菌、腸桿菌（Enterobacter spp.）、果膠桿菌（Pectobacterium spp.）、腐霉菌（Pythium spp.）和鐮刀菌（Fusarium spp.）等，均可造成生姜根莖腐爛、全株枯死[17]。因此，明確不同產(chǎn)區(qū)病原菌種類對(duì)有效控制當(dāng)?shù)厣『哂兄匾饬x。

本研究從廣西4個(gè)生姜產(chǎn)區(qū)的枯萎病病株中分離純化得到16株鐮刀菌菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)特征觀察、分子生物學(xué)鑒定和致病性測(cè)定，發(fā)現(xiàn)目前廣西生姜鐮刀菌枯萎病的致病菌主要為尖孢鐮刀菌，但是否存在其他鐮刀菌種類還有待深入調(diào)查研究。

鐮刀菌是重要的植物土傳病原菌，由鐮刀菌屬真菌侵染所致的生姜枯萎病分布較為廣泛，不同生姜種植區(qū)鐮刀菌種類有所不同。國外報(bào)道的鐮刀菌有尖孢鐮刀菌姜?；秃洼喼︾牭毒鶾3-5]；在國內(nèi)，有研究表明山東省平度市和安丘市的生姜枯萎病病原菌為尖孢鐮刀菌[2，6]，湖北生姜枯萎病的病原菌為腐皮鐮刀菌[15]，重慶市榮昌區(qū)和浙江省江山市生姜枯萎病的病原菌為禾谷鐮刀菌（F. graminearum）[18-19]。其中尖孢鐮刀菌被列為世界十大植物病原真菌之一，有些種類具有寄主特異性，可根據(jù)寄主專化性分為不

同?；途辏壳耙延?00多個(gè)?；捅粓?bào)道[20-21]。明確病原菌種下分化可以更好地指導(dǎo)抗病育種和病害防控，本研究因缺乏不同?；偷木曜鳛閰⒄?，所以未能進(jìn)一步開展病原菌的?；丸b定。目前大部分報(bào)道僅對(duì)尖孢鐮刀菌鑒定到種，因此今后應(yīng)加大對(duì)生姜枯萎病病原菌種下分化的研究。

本研究在進(jìn)行病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定時(shí)，未在PDA培養(yǎng)基上觀察到典型的大型分生孢子，這可能是不同菌株的差異導(dǎo)致的。鐮刀菌屬因形態(tài)復(fù)雜而難以單純通過形態(tài)學(xué)觀察鑒定到種，通常需要結(jié)合分子鑒定確定其分類地位。相較于ITS序列，TEF-1α序列在遺傳水平上具有良好的穩(wěn)定性和多樣性，對(duì)鐮刀菌屬下種間的分辨力更高，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于鐮刀菌的分類鑒定[22-23]。因此本研究在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步結(jié)合TEF-1α序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，將廣西生姜鐮刀菌枯萎病病原菌鑒定為尖孢鐮刀菌。研究結(jié)果可為當(dāng)?shù)厣羵鞑『Φ谋O(jiān)測(cè)預(yù)警和生姜枯萎病的防控提供理論依據(jù)，促進(jìn)當(dāng)?shù)厣a(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

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（責(zé)任編輯：王婷）