響應(yīng)面法優(yōu)化桑葚果渣花青素提取工藝及成分分析

摘要：為充分利用桑葚果渣中的花青素，在超聲輔助酶提取條件下，以桑葚果渣為原料，探索了料液比、酶用量、超聲時(shí)間和超聲溫度4個(gè)單因素對(duì)桑葚果渣花青素提取量的影響，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲輔助酶提取花青素工藝，進(jìn)一步使用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-MS）對(duì)提取液進(jìn)行了花青素成分確定。結(jié)果表明，花青素最佳提取條件為料液比1∶20、酶用量0.3%、超聲時(shí)間1.7 h、超聲溫度 55 ℃，此時(shí)桑葚果渣花青素提取量可達(dá)7.071 2 mg/g。提取液中可檢測(cè)到10種花青素，主要為矢車菊素-3-O-蕓香糖苷（44.56%）、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷-葡萄糖苷（25.84%）、矢車菊素-3-O-木糖苷（18.41%）和矢車菊素-3，5-O-二葡萄糖苷（7.34%）。該試驗(yàn)結(jié)果可為桑葚果渣利用和花青素產(chǎn)品生產(chǎn)提供思路和參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：桑葚；花青素；超聲輔助酶提取；響應(yīng)面優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TS201.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1000-9973（2025）03-0206-06

Optimization of Extraction Process of Anthocyanins from Mulberry Pomace

by Response Surface Method and Analysis of Their Components

LIN Ying¹， ZHAO Shu-tian¹， XIONG Ling¹， DING Bo¹，

DENG Zhao¹， WU Lang²， ZHANG Wen-xue^1，3*

（1.College of Biomass Science and Engineering， Sichuan University， Chengdu 610065， China;

2.Panzhihua Sixi Agricultural Development Co.， Ltd.， Panzhihua 617000， China;

3.School of Liquor-Brewing Engineering， Sichuan University Jinjiang

College， Meishan 620860， China）

Abstract： In order to make full use of anthocyanins in mulberry pomace，under the extraction conditions of ultrasonic-assisted enzyme， with mulberry pomace as the raw material， the effects of four single factors such as solid-liquid ratio， enzyme dosage， ultrasonic time and ultrasonic temperature on the extraction amount of anthocyanins from mulberry pomace are investigated. Response surface method is used to optimize the extraction process of anthocyanins with ultrasonic-assisted enzyme， and the anthocyanin components of the extraction solution are determined by UPLC-MS.The results show that the optimal extraction conditions are as follows： the solid-liquid ratio is 1∶20， the enzyme dosage is 0.3%， the ultrasonic time is 1.7 h and the ultrasonic temperature is 55 ℃. At this time， the extraction amount of anthocyanins from mulberry pomace could reach 7.071 2 mg/g. A total of 10 kinds of anthocyanins are detected in the extraction solution， mainly are cyanidin-3-O-rutinoside （44.56%）， cyanidin-3-O-rutinoside-glucoside （25.84%）， cyanidin-3-O-xyloside （18.41%） and cyanidin-3，5-O-diglucoside （7.34%）. The results can provide ideas and references for the utilization of mulberry pomace and the production of anthocyanin products.

Key words： mulberry; anthocyanin; ultrasonic-assisted enzyme extraction; response surface optimization

收稿日期：2024-08-16

基金項(xiàng)目：四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2021YFN0012）

作者簡(jiǎn)介：林穎（2000—），女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)健康。

*通信作者：張文學(xué)（1963—），男，教授，博士，研究方向：發(fā)酵工程。

桑（桑葚）為?？疲∕oraceae）桑屬（Morus alba）的熟果，也被稱為桑椹、烏桑、桑果等，含有氨基酸、花青素、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有祛濕、補(bǔ)血、抗氧化等功能，也是我國(guó)頒布的“藥食同源”水果之一^[1-2]。桑葚在我國(guó)分布范圍廣、種植面積大，加工產(chǎn)品主要為桑葚果酒、桑葚果汁和桑葚果醬，總體利用率較低^[3-5]。在桑葚產(chǎn)品加工過(guò)程中，果渣常被丟棄或僅用作動(dòng)物飼料，資源浪費(fèi)較嚴(yán)重。桑葚果渣是生物活性物質(zhì)的良好來(lái)源，可作為加工新食品、藥品和化妝品的原材料，進(jìn)而延長(zhǎng)桑葚的產(chǎn)業(yè)鏈，提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值^[6]。花青素是一種水溶性天然色素，屬于多酚類物質(zhì)，具有抗癌、抗氧化和改善慢性疾病等特性^[7]。桑葚果渣中含有大量花青素^[8]，為提高其回收率可將其用于制作天然色素產(chǎn)品或功能性食品。

現(xiàn)有的提取技術(shù)包括傳統(tǒng)溶劑萃取^[9]、超聲輔助萃取^[10]、微波輔助萃取^[11]、酶輔助萃取^[12]等。但上述方法存在儀器設(shè)備費(fèi)用高、耗時(shí)長(zhǎng)、提取量低、有機(jī)溶劑殘留等問(wèn)題^[13]。超聲輔助酶法提取花青素較單一提取法提取率高，此法是利用超聲和酶解共同作用，將細(xì)胞壁徹底破碎，從而增加有效成分的滲出，且此法研究前景廣闊、操作簡(jiǎn)便、技術(shù)投資少、加工成本低，適宜工廠生產(chǎn)^[14]。

因此，本研究旨在以桑葚果渣為原料，利用響應(yīng)面法對(duì)超聲輔助酶提取桑葚果渣花青素的工藝進(jìn)行研究，并借助UPLC-MS對(duì)提取液進(jìn)行花青素成分確定，為桑葚果渣利用和花青素產(chǎn)品生產(chǎn)提供了思路和參考依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

桑葚（云桑2號(hào)）：購(gòu)于四川省攀枝花市。

1.2試劑

果膠酶：山東隆科特酶制劑有限公司；濃鹽酸、無(wú)水乙醇、氯化鉀、檸檬酸、醋酸鈉（均為分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司；甲醇（色譜純）：德國(guó)默克公司；花青素標(biāo)準(zhǔn)品（純度gt;99%）：上海玉博生物科技有限公司。

1.3主要儀器與設(shè)備

BenchTop冷凍干燥機(jī)美國(guó)VirTis公司；HH-S6恒溫水浴鍋群安科學(xué)儀器（浙江）有限公司；TGL16M高速離心機(jī)長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；DS/RE-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀鄭州東晟儀器設(shè)備有限公司；721紫外色譜儀上海佑科儀器儀表有限公司；1050紫外可見近紅外分光光度計(jì) 珀金埃爾默股份有限公司；L-UC-6L超聲波清洗機(jī)北京蘭杰柯科技有限公司；Q-Trap 6500+超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司；WH-2渦旋儀上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.4方法

1.4.1原料預(yù)處理

取新鮮的桑葚榨汁，將過(guò)濾后的果渣于－20 ℃冷凍，待用。

1.4.2桑葚果渣花青素最大吸收波長(zhǎng)的確定

取冷凍保藏的桑葚果渣，冷凍干燥。稱取1.0 g桑葚果渣，加入50 mL體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液（含1%檸檬酸），水?。?0 ℃，2 h）。再經(jīng)高速離心機(jī)離心（5 000 r/min，10 min），上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，用純水定容至250 mL，得桑葚果渣花青素提取液。在400～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)提取液進(jìn)行紫外吸收掃描，確定桑葚果渣花青素的最大吸收波長(zhǎng)λmax^[15]。

1.4.3花青素含量測(cè)定

根據(jù)欒琳琳^[16]的方法并稍作修改，配制一定體積的氯化鉀（pH 1.0）和醋酸鈉（pH 4.5）緩沖液，用移液槍準(zhǔn)確移取1 mL桑葚果渣花青素提取液，用蒸餾水定容至10 mL，取1 mL稀釋后的溶液兩份，分別加入4 mL氯化鉀（pH 1.0）和醋酸鈉（pH 4.5）緩沖液，常溫下避光放置 30 min，以蒸餾水作為空白，在波長(zhǎng)λ的最大吸收點(diǎn)和 700 nm 處，分別對(duì)吸光度進(jìn)行3次測(cè)量，并取其平均值，計(jì)算公式如下：

A=（Aλmax－A700 nm）pH 1.0－（Aλmax－A700 nm）pH 4.5。（1）

花青素提取量（mg/g）=A×MW×DF×Vε×L×M。（2）

式中：MW為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷分子量，449.2 g/mol；DF為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；ε為摩爾消光系數(shù)，26 900 L/（mol·cm）;L為光程，1 cm；M為原料質(zhì)量，g。

1.4.4超聲輔助酶提取桑葚果渣花青素單因素試驗(yàn)

以桑葚果渣提取液的花青素含量為指標(biāo)，分別考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）、酶用量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、超聲時(shí)間（1，2，3，4，5 h）、超聲溫度（15，30，45，60，75 ℃）4個(gè)因素對(duì)桑葚果渣花青素提取量的影響。

1.4.5響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，選擇料液比、超聲時(shí)間和超聲溫度3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

1.4.6UPLC-MS 法確定花青素種類

樣品預(yù)處理：移取50 μL桑葚果渣花青素提取液，將其溶解在950 μL（含0.1%鹽酸）的甲醇-水中，搖勻5 min，在12 000 r/min條件下超聲處理5 min，然后在12 000 r/min條件下離心處理3 min，再利用0.22 μm的微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，待用。

液相條件：采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱進(jìn)行分析，色譜條件：A相為高純水添加0.1%甲酸，B相為甲醇添加0.1%甲酸；柱溫為40 ℃；流速為0.35 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL。流動(dòng)相梯度洗脫設(shè)置：在0.00 min開始時(shí)，B相為5%，在6.00 min時(shí)線性上升至50%，在12.00 min時(shí)線性上升至95%，并維持2 min；在14.00 min時(shí)線性下降至5%，并平衡2 min。

質(zhì)譜條件：在正離子模式下質(zhì)譜電壓5 500 V，氣簾氣（curtain gas，CUR）氣壓35 psi，電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）溫度550 ℃。Q-Trap 6500+系統(tǒng)采用最優(yōu)的去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）配置，以實(shí)現(xiàn)對(duì)各離子的掃描檢測(cè)^[17]。

根據(jù)靶向代謝組學(xué)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析，配制不同濃度的花青素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量分析。

1.4.7數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均取平行試驗(yàn)3次后的平均值，采用SPSS軟件處理數(shù)據(jù)，Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken組合試驗(yàn)，Origin 2023軟件繪圖和處理圖片。

2結(jié)果與分析

2.1桑葚果渣花青素最大吸收波長(zhǎng)

采用紫外可見近紅外分光光度計(jì)掃描桑葚果渣花青素提取液在400～600 nm范圍內(nèi)的紫外吸收，結(jié)果見圖1。確定其花青素最大吸收波長(zhǎng)為511 nm。

2.2超聲輔助酶提取桑葚果渣花青素單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1料液比在提取花青素中的作用

由圖2可知，在試驗(yàn)探究的料液比條件下，花青素提取量隨著料液比的減小而升高，隨后基本保持穩(wěn)定。當(dāng)料液比為1∶10和1∶15 時(shí)，可能是由于提取溶劑量較少，花青素還未完全溶出就已達(dá)到飽和，導(dǎo)致花青素提取不完全；當(dāng)料液比為1∶20 時(shí)，花青素提取量為6.68 mg/g，提取量達(dá)到最大，花青素是一種水溶性色素，此時(shí)花青素較充分地溶解在水中；隨著料液比的繼續(xù)減小，花青素提取量變化較小，此時(shí)花青素已完全溶出，溶劑的量增加，花青素提取量基本保持不變。因此，選擇料液比1∶20為宜。

2.2.2酶用量在提取花青素中的作用

果膠酶具有高效性、專一性等特點(diǎn)，能夠破壞植物細(xì)胞壁，將細(xì)胞壁的成分進(jìn)行降解或水解，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流出，提高提取率^[18]。由圖3可知，隨著果膠酶用量的增加，花青素提取量總體呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)酶用量為0.1%和0.2%時(shí)，可能是由于果膠酶未能完全降解桑葚果渣細(xì)胞壁，導(dǎo)致花青素提取不完全；當(dāng)酶用量為0.3%時(shí)，花青素提取量達(dá)到最大，為6.35 mg/g，此時(shí)適量的果膠酶可有效地降解細(xì)胞壁中的果膠等物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)花青素釋放^[19]；當(dāng)酶用量為0.4%和0.5%時(shí)，花青素提取量變化很小，可能是因?yàn)榈孜镆呀?jīng)被果膠酶全部降解，有效成分完全溶出，繼續(xù)增加酶用量并不會(huì)導(dǎo)致花青素提取量進(jìn)一步增大^[18]。因此，選擇0.3%果膠酶為宜。

2.2.3超聲時(shí)間在提取花青素中的作用

合理的超聲時(shí)間能夠確保物質(zhì)與提取劑充分接觸。由圖4可知，隨著超聲時(shí)間的增加，花青素提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在0～2 h時(shí)，花青素提取量隨著超聲時(shí)間的增加而增大；在2 h時(shí)，花青素提取量達(dá)到最大，為5.59 mg/g，可能是由于超聲時(shí)間的增加促進(jìn)了物質(zhì)與溶劑之間的充分接觸，在水溶劑中形成大量氣泡，氣泡迅速內(nèi)爆致使細(xì)胞壁破裂，促進(jìn)了花青素的外滲^[20]；繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間，花青素提取量呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，可能是由于反應(yīng)體系內(nèi)溫度升高，導(dǎo)致提取的花青素在高溫下降解。因此，選擇超聲時(shí)間2 h為宜。

2.2.4超聲溫度在提取花青素中的作用

由圖5可知，在特定的超聲溫度條件下，花青素提取量隨著超聲溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)。在15～45 ℃范圍內(nèi)，隨著超聲溫度的升高，花青素的提取率呈上升趨勢(shì)，這與超聲溫度升高密切相關(guān)，分子熱運(yùn)動(dòng)加速，利于花青素溶解在溶劑中；在45 ℃時(shí)，花青素提取量達(dá)到最大，為4.9 mg/g，這可能是由于溫度升高，有利于加快酶促反應(yīng)的進(jìn)行，較快破壞桑葚果渣細(xì)胞壁，從而使花青素能夠被充分提取^[18]；在45～75 ℃時(shí)，花青素提取量下降，可能是由于花青素具有熱敏感性，在高溫下耐熱性差，易發(fā)生降解。因此，選擇超聲溫度45 ℃為宜。

2.3響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，酶用量在0.2%～0.4%時(shí)對(duì)花青素提取量的影響非常小，因此固定酶用量為0.3%。以花青素提取量為指標(biāo)，使用Design-Expert 8.0.6 軟件，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)桑葚果渣花青素的超聲輔助酶法萃取條件進(jìn)行優(yōu)化研究，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

對(duì)表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合得到回歸方程：Y=6.40+0.29A+0.089B+0.52C－0.094AB+0.030AC－0.11BC－0.28A²－0.060B²－0.33C²。

回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。

對(duì)表3中回歸方程進(jìn)行方差分析，發(fā)現(xiàn)回歸模型的P值為0.000 1（Plt;0.01），表明此回歸模型達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)的P值為0.840 2（Pgt;0.05），表明此模型在整個(gè)回歸區(qū)域的擬合度好。方差分析結(jié)果顯示，該方法具有良好的擬合效果，檢驗(yàn)誤差較小，可以解釋98.71%的響應(yīng)值變化。一次項(xiàng)A、B、C均達(dá)到極顯著水平（Plt;0.01），表明料液比、超聲時(shí)間和超聲溫度對(duì)桑葚果渣花青素的提取量有極顯著影響。交互項(xiàng)AB有顯著影響（Plt;0.05），BC有極顯著影響（Plt;0.01），二次項(xiàng)A2和C2有極顯著影響（Plt;0.01），AC和B2的影響不顯著（Pgt;0.05），表明因變量與響應(yīng)值并非單純的線性關(guān)系。由F值可知，各因素對(duì)桑葚果渣花青素的提取效果由強(qiáng)到弱為超聲溫度gt;料液比gt;超聲時(shí)間。

此回歸模型獲得的響應(yīng)面圖和等高線圖見圖6～圖8。

結(jié)合軟件計(jì)算回歸模型可以預(yù)測(cè)出當(dāng)料液比（A）為1∶22.78、超聲時(shí)間（B）為1.67 h、超聲溫度（C）為56.89 ℃時(shí)，桑葚果渣花青素提取量為 6.699 8 mg/g。

為驗(yàn)證該工藝的可靠性，同時(shí)兼顧成本、測(cè)試的可操作性和設(shè)備的限制，將上述桑葚果渣花青素的萃取工藝優(yōu)化為料液比1∶20、超聲時(shí)間1.7 h、超聲溫度55 ℃，共進(jìn)行3組試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示獲得的花青素提取量為7.071 2 mg/g，與預(yù)測(cè)值6.699 8 mg/g相近，驗(yàn)證了該工藝的可靠性，說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的桑葚果渣花青素提取工藝條件具有實(shí)用意義和價(jià)值，可結(jié)合實(shí)際對(duì)桑葚果渣花青素進(jìn)行提取。

2.4桑葚果渣提取液花青素UPLC-MS分析

桑葚果渣提取液花青素UPLC-MS結(jié)果見表4。

根據(jù)靶向代謝組學(xué)，從桑葚果渣提取液中確定花青素共有10種類型，都為矢車菊素。桑葚果渣提取液中花青素主要以花色苷形式存在^[21]，其主要的花青素為矢車菊素-3-O-蕓香糖苷（44.56%）、矢車菊素-3-O-蕓香糖苷-葡萄糖苷（25.84%）、矢車菊素-3-O-木糖苷（18.41%）和矢車菊素-3，5-O-二葡萄糖苷（7.34%）。欒琳琳^[16]、Zou等^[22]、Zhang等^[23]從貴州十大桑葚品種、廣州桑葚品種、江蘇桑葚品種等果渣提取液中分別檢測(cè)到6，8，2種花青素，其中均只有1種（矢車菊素-3-O-蕓香糖苷）與本研究相同，桑葚果渣花青素種類的不同可能與桑葚品種和種植地區(qū)有關(guān)，其花青素生物合成途徑不同，形成不同結(jié)構(gòu)的花青素^[7]。

3結(jié)論

為了提高桑葚果渣花青素的提取量，本研究采用響應(yīng)面法對(duì)超聲輔助酶法提取桑葚果渣花青素的條件進(jìn)行了系統(tǒng)研究。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明，料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度3個(gè)因素對(duì)桑葚果渣花青素提取量的影響顯著，影響大小順序?yàn)槌暅囟萭t;料液比gt;超聲時(shí)間。同時(shí)兼顧成本、測(cè)試的可操作性和設(shè)備的限制等，將最佳提取工藝調(diào)整為料液比1∶20、酶用量0.3%、超聲時(shí)間1.7 h、超聲溫度 55 ℃。經(jīng)驗(yàn)證，桑葚果渣花青素提取量為7.071 2 mg/g，與預(yù)測(cè)值6.699 8 mg/g基本相符，可結(jié)合實(shí)際對(duì)桑葚果渣花青素進(jìn)行提取。UPLC-MS結(jié)果顯示，桑葚果渣提取液中花青素種類共有10種，其中矢車菊素-3-O-蕓香糖苷占比最大。本試驗(yàn)為桑葚果渣的開發(fā)利用及工業(yè)化生產(chǎn)相關(guān)花青素產(chǎn)品提供了參考依據(jù)。

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