豌豆蛋白-黃原膠高內(nèi)相乳液的制備及性質(zhì)研究

摘要：以豌豆為原料，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)豌豆蛋白提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)的提取條件為pH 10、料液比1∶8、提取時(shí)間2.5 h、提取溫度40 ℃，在此條件下豌豆蛋白的提取率最高，為69.83%。為提高豌豆蛋白的乳化性質(zhì)，利用黃原膠對(duì)豌豆蛋白進(jìn)行物理修飾，制備高內(nèi)相乳液。通過(guò)測(cè)定豌豆蛋白-黃原膠高內(nèi)相乳液的微觀結(jié)構(gòu)、粒徑、流變特性和穩(wěn)定性，探究不同豌豆蛋白濃度和不同油相添加量對(duì)豌豆蛋白-黃原膠高內(nèi)相乳液性質(zhì)的影響。結(jié)果表明，當(dāng)豌豆蛋白濃度為3%、油相添加量為78%時(shí)，表現(xiàn)出典型的凝膠行為，乳液粒徑最小，為（0.856±0.06） μm；熱處理后乳液粒徑變化較小，為（4.35±0.23） μm；凍融處理后，凍融穩(wěn)定率為（89.34±0.69）%。

關(guān)鍵詞：豌豆蛋白；提取；高內(nèi)相乳液；穩(wěn)定性

中圖分類號(hào)：TS252.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1000-9973（2025）03-0212-07

Preparation of Pea Protein-Xanthan Gum High Internal Phase Emulsion

and Study on Its Properties

WU Shu-qing¹， RU Jia-yi¹， JIANG Xiao-hang¹， BIE Yu-tong¹， SU Zhong-jun²，

LI Bo-sheng²， WANG Bo-ying²， WANG Shun-yu^2*

（1.College of Food Science and Engineering， Changchun University， Changchun 130022，

China; 2.Zhejiang Liziyuan Food Co.， Ltd.， Jinhua 321031， China）

Abstract： With pea as the raw material， the extraction process parameters of pea protein are optimized by single factor test and orthogonal test， and the optimal extraction conditions are obtained as follows： pH is 10， solid-liquid ratio is 1∶8， extraction time is 2.5 h， and extraction temperature is 40 ℃. Under these conditions， the extraction rate of pea protein is the highest of 69.83%. In order to improve the emulsification properties of pea protein， xanthan gum is used to physically modify pea protein， and high internal phase emulsion is prepared. By measuring the microstructure， particle size， rheological properties and stability of pea protein-xanthan gum high internal phase emulsion， the effects of different pea protein concentrations and different oil phase addition amount on the properties of pea protein-xanthan gum high internal phase emulsion are investigated. The results show that when pea protein concentration is 3% and the addition amount of oil phase is 78%， the gel behavior is typical， and the particle size of" emulsion is the smallest of （0.856±0.06） μm. After heat treatment， the particle size of the emulsion changes little， which is （4.35±0.23） μm. After freeze-thaw treatment， the freeze-thaw stability rate is （89.34±0.69）%.

Key words： pea protein; extraction; high internal phase emulsion; stability

收稿日期：2024-10-14

基金項(xiàng)目：2022年企事業(yè)單位委托科技項(xiàng)目（2023220008000017）

作者簡(jiǎn)介：吳淑清（1969—），女，教授，碩士生導(dǎo)師，碩士，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)、農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。

*通信作者：王順余（1985—），男，高級(jí)工程師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：食品研發(fā)、食品工藝設(shè)計(jì)、食品生產(chǎn)管理等。

豌豆屬于豆類植物，是我國(guó)除大豆外第二大豆類，富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、維生素、膳食纖維等，具有一定的開(kāi)發(fā)利用潛能^[1]。豌豆蛋白是全價(jià)的植物蛋白，含有各種必需氨基酸，且具有致敏性低^[2]、不含乳糖和膽固醇等優(yōu)點(diǎn)，可用于改善人類營(yíng)養(yǎng)、開(kāi)發(fā)功能性食品^[3-4]。目前，豌豆蛋白的研究主要集中在乳液和凝膠等方面^[5-6]，但豌豆蛋白表面疏水性強(qiáng)且電荷量較少，導(dǎo)致其溶解性和乳化性較差。

黃原膠是一種微生物多糖，具有穩(wěn)定性高、黏彈性好等優(yōu)點(diǎn)^[7]，兼具親油性與親水性，在水溶液中溶解后會(huì)形成一種較穩(wěn)定的水油動(dòng)態(tài)平衡系統(tǒng)^[8]。高內(nèi)相乳液是一種內(nèi)部油相體積分?jǐn)?shù)≥74%的乳液體系^[9-10]，因其膠體中界面張力較小，能夠抑制液滴的合并和沉淀，從而制備出穩(wěn)定性較高的乳液^[11]。

綜上所述，本研究采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)豌豆蛋白提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并制備豌豆蛋白-黃原膠高內(nèi)相乳液，為提高高內(nèi)相乳液的穩(wěn)定性和應(yīng)用潛力提供了一定的理論參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

豌豆、玉米油：市售；牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；石油醚、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；磷酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；黃原膠：山東齊魯生物科技集團(tuán)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

VaCo 5冷凍干燥機(jī)德國(guó)Zirbus公司；3K-15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Sigma公司；UV-2700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)日本島津公司；PHS-3C pH計(jì)上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；Winner 2000ZD激光粒度分析儀英國(guó)馬爾文公司；XK-DL004熒光顯微鏡深圳市西尼科光學(xué)儀器有限公司；核磁共振成像分析儀蘇州紐邁分析儀器股份有限公司；RSO流變儀美國(guó)Brookfield公司；FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)常州市萬(wàn)合儀器制造有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1豌豆蛋白的提取

1.3.1.1豌豆蛋白的預(yù)處理

將豌豆進(jìn)行粉碎處理，過(guò)60目篩后加入石油醚脫脂，攪拌1 h后放入通風(fēng)櫥中過(guò)夜，抽濾后將豌豆粉放入通風(fēng)櫥12 h，確保殘留的石油醚全部揮發(fā)，然后置于干燥環(huán)境下備用。

1.3.1.2豌豆蛋白的提取

采用羅婷婷等^[12]的方法并稍作修改。將預(yù)處理后的豌豆粉加水溶解，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液至適宜pH，在適當(dāng)溫度下提取一定時(shí)間后，以8 000 r/min離心10 min保留上清液，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至4.5，以8 000 r/min離心10 min保留沉淀，用去離子水洗出沉淀，調(diào)節(jié)pH至中性，冷凍干燥后得到蛋白粉。

1.3.1.3蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用SN/T 3926—2014中考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以蒸餾水為對(duì)照，在595 nm處測(cè)其吸光度，橫坐標(biāo)為蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），縱坐標(biāo)為吸光度，繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程y=1.775 7x+0.097 6（R²=0.993）。

1.3.1.4豌豆蛋白提取率的計(jì)算

豌豆蛋白提取率計(jì)算公式如下^[13]：

豌豆蛋白提取率（%）=提取液中蛋白質(zhì)含量（g）樣品中蛋白質(zhì)含量（g）×100%。

1.3.1.5單因素試驗(yàn)

以pH、料液比、提取時(shí)間、提取溫度為考察因素，蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，研究pH（7，8，9，10，11）、料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14）、提取時(shí)間（1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h）、提取溫度（20，30，40，50，60 ℃）對(duì)蛋白提取率的影響。

1.3.1.6正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

1.3.2豌豆蛋白-黃原膠高內(nèi)相乳液的制備

配制豌豆蛋白（1%、2%、3%、4%、5%）和黃原膠（0.6%）溶液，在1 000 r/min下攪拌2 h后，將豌豆蛋白溶液與黃原膠溶液按1∶1混合，在室溫下攪拌3 h使其充分水合。將上述得到的不同豌豆蛋白濃度的復(fù)合溶液與玉米油（74%、76%、78%、80%、82%）混合，隨后使用FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)在16 000 r/min下剪切1 min。

1.3.2.1乳液形貌觀察

a.乳液外觀形態(tài)

將配制好的乳液進(jìn)行拍照，觀察其外觀。

b.乳液微觀形態(tài)

使用熒光顯微鏡對(duì)高內(nèi)相乳液進(jìn)行微觀形貌觀察，吸取10 μL乳液滴于載玻片上，緩慢蓋上蓋玻片避免氣泡產(chǎn)生。固定至載物臺(tái)上后，用100×倍率觀察不同高內(nèi)相乳液的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并拍照保存。

1.3.2.2乳液內(nèi)部成像

使用紐邁低場(chǎng)核磁共振成像軟件，采用SE序列，利用標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行參數(shù)校正，然后將盛有5 mL乳液樣品的玻璃瓶置于成像線圈中待測(cè)。

1.3.2.3粒徑測(cè)定

采用激光粒度分析儀對(duì)高內(nèi)相乳液樣品進(jìn)行粒徑檢測(cè)，測(cè)定前加入蒸餾水對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋，混勻。參數(shù)如下：油相折射指數(shù)為1.449，油相吸收指數(shù)為0.010，水相折射指數(shù)為1.330^[14]。每個(gè)樣品檢測(cè)3次，結(jié)果取平均值。

1.3.2.4乳液流變特性分析

剪切速率-表觀黏度曲線：使用流變儀測(cè)定乳液的表觀黏度，剪切速率設(shè)為0.1～200 s^-1。溫度為25 ℃，誤差不超過(guò)0.1 ℃，取2 mL左右的乳液上樣至夾具間隙。

頻率-模量曲線：掃描頻率范圍設(shè)為 0.1～10 Hz，應(yīng)變?chǔ)霉潭ㄔ?.5%。

應(yīng)力-模量曲線：應(yīng)力范圍設(shè)為 0.1～100 Pa，掃描頻率固定在1.0 Hz，所有樣品均平行測(cè)量3次^[15]。

1.3.2.5乳液穩(wěn)定性試驗(yàn)

a.熱穩(wěn)定性

將制備好的乳液封裝于10 mL試劑瓶中，90 ℃水浴加熱60 min，冷卻至室溫后稀釋100倍，利用激光粒度分析儀測(cè)定乳液粒徑。

b.凍融穩(wěn)定性

參照Lu等^[16]的方法并稍作修改。測(cè)量冷凍前高內(nèi)相乳液的質(zhì)量，記為m0，經(jīng)過(guò)3次反復(fù)凍融后，離心（5 000 r/min）10 min分離油相和水相，去除上層游離油后再次稱重，記為m1。凍融穩(wěn)定性（FS）公式如下：

FS（%）=（100-m0-m1r0×m0）×100%。

式中：m0為乳液初始樣品質(zhì)量（g）；m1為去除游離油后的樣品質(zhì)量（g）；r0為乳液中油的初始比例（%）。

1.4數(shù)據(jù)處理

各試驗(yàn)重復(fù)3次，使用 IBM SPSS Statisics 26 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析；使用Origin 2021軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

pH、料液比、提取時(shí)間、提取溫度4個(gè)因素對(duì)豌豆蛋白提取率的影響見(jiàn)圖1。

由圖1中A可知，當(dāng)pH為9時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最大值（66.13±0.83）%，過(guò)高的pH會(huì)使蛋白內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性^[17]。由圖1中B可知，溶劑比例過(guò)低時(shí)，原料不易分散，蛋白部分溶出，料液黏度增大，不利于操作^[18]，過(guò)高的溶劑比例也不利于豌豆蛋白的溶出。當(dāng)料液比為1∶10時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最大值（66.53±0.63）%。由圖1中C可知，隨著提取時(shí)間的增加，豌豆蛋白提取率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，這是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，有其他物質(zhì)溶出，導(dǎo)致蛋白的得率和純度下降^[19]。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到2.0 h時(shí)，蛋白提取率最高，為（66.41±0.72）%。由圖1中D可知，當(dāng)提取溫度低于40 ℃時(shí)，豌豆蛋白提取率隨著溫度的升高而升高，當(dāng)提取溫度高于40 ℃時(shí)，溶液中蛋白質(zhì)發(fā)生變性，從而導(dǎo)致溶液中蛋白含量急速下降^[20]。當(dāng)提取溫度為40 ℃時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最大值（66.27±0.48）%。

2.2正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，以獲取豌豆蛋白的最佳提取工藝。

由表2可知，影響豌豆蛋白提取率的因素主次順序?yàn)榱弦罕龋緋H＞提取溫度＞提取時(shí)間，最佳組合為A3B1C3D2，與表2中序號(hào)7相同，無(wú)需驗(yàn)證試驗(yàn)。即pH 10、料液比1∶8、提取時(shí)間2.5 h、提取溫度40 ℃時(shí)豌豆蛋白提取率最高，為69.83%。

2.3乳液形貌觀察

不同豌豆蛋白濃度和不同油相添加量下乳液的外觀、微觀形態(tài)和內(nèi)部成像見(jiàn)圖2。

由圖2中A可知，乳液顏色均為乳白色，分布均勻，未出現(xiàn)分層。從顯微鏡中觀察微觀形態(tài)可看到，隨著豌豆蛋白濃度的增加，乳液液滴分布逐漸均一且致密，形狀呈球形。由圖2中B可知，當(dāng)油相添加量大于78%時(shí)，乳液外觀出現(xiàn)小氣泡，這是因?yàn)橛拖嗵砑恿窟^(guò)大導(dǎo)致油相不能被完全包裹。由顯微鏡觀察可看到，當(dāng)油相添加量達(dá)到78%時(shí)，乳液液滴致密且均一。在偽彩色圖像中，紅色區(qū)域表示水分含量較高，藍(lán)色區(qū)域表示水分含量較低^[21]。由偽彩色圖像可知，乳液內(nèi)部呈均勻的橙黃色或橙紅色，說(shuō)明水相作為連續(xù)相較好地覆蓋了分散相，當(dāng)豌豆蛋白濃度大于3%、油相添加量大于78%時(shí)，乳液液滴較松散，聚集程度有所下降，說(shuō)明過(guò)多添加蛋白和油相不利于乳液的穩(wěn)定性。

2.4乳液粒徑分析

不同豌豆蛋白濃度和不同油相添加量對(duì)乳液粒徑的影響見(jiàn)圖3。

粒徑可以判斷顆粒物質(zhì)的粗細(xì)程度，反映其均勻性。由圖3中A可知，隨著豌豆蛋白濃度的增加，乳液粒徑逐漸減小，這是因?yàn)樵谌橐褐苽溥^(guò)程中有更多的蛋白與油滴結(jié)合，從而避免液滴聚集形成大油滴^[22]。當(dāng)豌豆蛋白濃度達(dá)到3%時(shí)，繼續(xù)增加蛋白濃度，粒徑無(wú)明顯變化。由圖3中B可知，當(dāng)油相添加量為78%時(shí)，乳液粒徑達(dá)到最小，過(guò)高或過(guò)低的油相添加量均會(huì)導(dǎo)致連續(xù)相不能較好地包裹住分散相，乳液粒徑增大。因此，當(dāng)豌豆蛋白濃度為3%、油相添加量為78%時(shí)，乳液粒徑最小，為（0.856±0.06） μm。

2.5乳液表觀黏度

不同豌豆蛋白濃度和油相添加量對(duì)乳液表觀黏度的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，隨著剪切速率的逐漸增加，乳液的黏度呈下降趨勢(shì)。由圖4中A可知，當(dāng)豌豆蛋白濃度達(dá)到3%時(shí)，繼續(xù)增加蛋白濃度，乳液的黏度未發(fā)生明顯變化。影響?zhàn)ざ鹊暮诵囊蛩厥且后w分子間的作用力，當(dāng)豌豆蛋白濃度為3%時(shí)，液體分子間的作用力達(dá)到平衡，繼續(xù)增加蛋白濃度不會(huì)提高乳液的黏度^[23]。由圖4中B可知，油相添加量越大，乳液的黏度越高，這是因?yàn)橛衩子捅旧砭邆湟欢ǖ酿ざ?，隨著油相添加量的增加，乳液的黏度也隨之增加^[24]。

2.6乳液流變特性

不同豌豆蛋白濃度和油相添加量對(duì)乳液流變特性的影響見(jiàn)圖5。

由圖5可知，經(jīng)測(cè)試，所有乳液樣品都發(fā)生剪切稀化，說(shuō)明這些乳液體系都是非牛頓流體。G′反映彈性特性，G″反映黏度特性，乳液的損耗模量（G″）始終低于儲(chǔ)能模量（G′），說(shuō)明乳液以彈性為主^[25]。由圖5中A可知，當(dāng)豌豆蛋白濃度為3%時(shí)，乳液的G′與G″最高，可增加乳液的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，彈性最好。由圖5中B可知，當(dāng)油相添加量為78%時(shí)，在測(cè)試頻率范圍（0.1～10 rad/s）內(nèi)表現(xiàn)出典型的凝膠行為，說(shuō)明蛋白-多糖復(fù)合物在連續(xù)相中形成了網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，且復(fù)合物緊密包裹著油滴，使油滴之間的相互作用增強(qiáng)^[26]。

2.7乳液的穩(wěn)定性

不同豌豆蛋白濃度和油相添加量對(duì)乳液熱穩(wěn)定性和凍融穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖6和圖7。

由圖6中A和圖7中A可知，加熱60 min后，所有乳液的平均粒徑顯著增加（Plt;0.05），這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)發(fā)生變性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)疏水氨基酸暴露，促進(jìn)了乳液體系的聚集、絮凝和相分離^[27]。然而，與其他蛋白濃度和油相添加量相比，當(dāng)豌豆蛋白濃度為3%、油相添加量為78%時(shí)，高內(nèi)相乳液的平均粒徑保持相對(duì)穩(wěn)定，僅為（4.35±0.23） μm。由圖6中B和圖7中B可知，當(dāng)豌豆蛋白濃度為3%、油相添加量為78%時(shí)，乳液表現(xiàn)出優(yōu)異的凍融穩(wěn)定性，有效防止油析出。此時(shí)，乳液的凍融穩(wěn)定率為（89.34±0.69）%。

3結(jié)論

該研究采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)豌豆蛋白提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并制備豌豆蛋白-黃原膠高內(nèi)相乳液。結(jié)果表明，豌豆蛋白最優(yōu)提取條件為pH 10、料液比1∶8、提取時(shí)間2.5 h、提取溫度40 ℃，在此條件下豌豆蛋白提取率為69.83%。當(dāng)豌豆蛋白濃度為3%、油相添加量為78%時(shí)，表現(xiàn)出典型的凝膠行為，乳液粒徑最小，為（0.856±0.06） μm；熱處理后乳液粒徑變化較小，為（4.35±0.23） μm；凍融穩(wěn)定率為（89.34±0.69）%。

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