不同時機哈氏育陰湯干預(yù)對POI大鼠卵巢功能損傷的影響

摘要：目的以“哈氏育陰湯”對VCD誘導(dǎo)的POI大鼠模型進行干預(yù)，探討不同時機中藥干預(yù)對POI大鼠卵巢功能的調(diào)控作用。方法將有規(guī)則動情周期的56只SD雌性大鼠，隨機分為空白組、模型組、西藥組、中藥預(yù)防組（高低劑量組）、中藥干預(yù)組（高低劑量組），每組8只。除空白組外的6組以VCD造模，其中中藥預(yù)防組造模完成前1周及造模結(jié)束后4周每日中藥灌胃，共5周；中藥干預(yù)組造模結(jié)束后每日中藥灌胃，共4周；西藥組造模結(jié)束后每日以結(jié)合雌激素灌胃，共4周；空白組和模型組同等劑量的生理鹽水灌胃，共４周。給藥結(jié)束后取材，檢測血清性激素水平及顆粒細胞凋亡相關(guān)蛋白表達情況。結(jié)果“哈氏育陰湯”可通過調(diào)控細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達，對性腺起保護作用。并且中藥高劑量預(yù)防組療效優(yōu)于西藥對照藥物。結(jié)論不同時機的干預(yù)，在保護POI大鼠卵巢功能方面具有效應(yīng)差。

關(guān)鍵詞：卵巢功能損傷；哈氏育陰湯；VCD

中圖分類號：R711.75文獻標(biāo)志碼：A文章編號：1007-2349（2025）03-0085-06

隨著腫瘤及各類慢性病年輕化趨勢，使女性在育齡期更易發(fā)生卵巢早衰、絕經(jīng)和圍絕經(jīng)期提前、卵巢內(nèi)分泌功能紊亂和不孕等情況［1］。此外，由于年齡相關(guān)的生育力下降以及社會、環(huán)境污染等原因?qū)е碌呐月殉补δ軗p傷，也會加劇生育力保存的迫切需求。

早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是指女性在40歲之前出現(xiàn)卵巢功能下降，并且以月經(jīng)及性激素變化為主要特征的內(nèi)分泌疾病。若不及時治療，會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、心血管疾病、老年性癡呆等疾病的提前發(fā)生，嚴(yán)重會影響患者的身心健康［2］。目前本病的治療主要采用激素補充療法或誘導(dǎo)排卵等［3］西醫(yī)治療，但不僅服藥時間長、停藥后易復(fù)發(fā)，且存在無法重建患者卵巢功能等局限性。因此，尋找更安全有效的替代療法已成為該研究領(lǐng)域的熱點問題。

“哈氏育陰湯”為天津哈氏婦科流派治療卵巢功能減退經(jīng)驗方，前期臨床研究顯示，在改善臨床癥狀方面療效顯著。因此，本研究擬通過構(gòu)建去氧乙烯基環(huán)己烯（4-Vinylcyclohexene Diepoxide，VCD）誘導(dǎo)的大鼠卵巢功能損傷模型，觀察不同時機“哈氏育陰湯”干預(yù)對POI大鼠卵巢功能的影響，探討其可能的差異化保護機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物SPF級8周齡雌性SD大鼠60只，體質(zhì)量在（220±20）g之間，均購自北京華阜康生物科技股份有限公司（許可證號：SCXK（京）2019-0008）。在適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后，每日行陰道脫落細胞學(xué)涂片并顯微鏡觀察連續(xù)10天，選取56只動情周期規(guī)律的SD雌性大鼠進入實驗。本實驗通過易生源基本科技（天津）有限公司實驗動物倫理委員會審查，倫理審查批件批號YSY-DWLL-2022322。

1.1.2藥物及配制VCD（廠家：上海麥克林生化科技有限公司，貨號：V820469-100mL），芝麻香油（廠家：河北紅猴王食用油調(diào)料有限公司，貨號：SC10213092200209），大鼠每日腹腔注射劑量參照Muhammad等報道方法［4、5］VCD160mg/kg，即每次注射VCD溶液5mL/kg（VCD溶液配置比例為0.15mL VCD與4.85mL芝麻油混合）。哈氏育陰湯：北沙參20 g，醋龜板14 g先煎、女貞子14 g，當(dāng)歸10 g，熟地黃20 g，酒萸肉14 g，桑葚20 g，菟絲子20 g，枸杞子14 g，酒蓯蓉10 g，玉竹14 g，白芍10 g，香附10 g，購自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房。根據(jù)“人和動物間按體表面積折算的等效計量比率表”，配成低濃度（含生藥量0.9 g/mL）和高濃度（含生藥量3.6 g/mL），相當(dāng)于臨床等效劑量的1/2倍、2倍，配制好的中藥液于4℃冰箱內(nèi)儲存?zhèn)溆谩＝Y(jié)合雌激素片（廠家：新疆新姿源生物制藥有限公司，規(guī)格：625μg，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20090172）用蒸餾水溶解藥片，配成含結(jié)合雌激素0.0075mg/mL的藥液，4℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3主要試劑促卵泡生成素（FSH）測定試劑盒（廠家：北京美聯(lián)泰科生物技術(shù)有限公司，批號230811）、黃體生成素（LH）測定試劑盒（廠家：北京美聯(lián)泰科生物技術(shù)有限公司，批號230811）、雌二醇（E2）測定試劑盒（廠家：北京美聯(lián)泰科生物技術(shù)有限公司，批號230811）、BCL-2 antibody（廠家：武漢三鷹，貨號26593-1-AP，批號00118140），BAX antibody（廠家：武漢博士德，貨號BM3964，批號BST1759364）。

1.1.4主要儀器全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（廠家：北京美聯(lián)泰科生物技術(shù)有限公司，型號MS-Fast）、全景掃描儀（廠家：3DHISTECH，型號3DHISTECH P250 FLASH）、正置光學(xué)顯微鏡（廠家：OLYMPUS，型號OLYMPUS CKX43-LP）等。

1.2方法

1.2.1模型制備及分組56只大鼠隨機選取48只每日腹腔注射VCD160mg/kg，復(fù)制POI大鼠病理模型；其余8只作為空白組腹腔注射等量生理鹽水，均注射15天。造模結(jié)束24h后，每只大鼠每日均在同一時間（上午8：00）進行陰道脫落細胞學(xué)檢查，連續(xù)10天用顯微鏡觀察大鼠陰道脫落細胞形態(tài)、種類及分布，并記錄動情周期的變化。動情周期紊亂則判定造模成功。

1.2.2給藥用隨機數(shù)字表法將造模成功的48只大鼠分為模型組、西藥組、中藥預(yù)防組（設(shè)高、低劑量組），中藥干預(yù)組（設(shè)高、低劑量組），每組8只。空白組和模型組同等劑量的生理鹽水灌胃，每日１次，共４周；西藥組以結(jié)合雌激素0.075mg/kg灌胃，每日1次，共4周；中藥預(yù)防組以哈氏育陰湯高劑量（36 g/kg）、低劑量（9 g/kg）灌胃，在造模中1周（第9天至第15天）及造模結(jié)束后4周，每日1次，共干預(yù)5周。中藥干預(yù)組以哈氏育陰湯高劑量（36 g/kg）、低劑量（9 g/kg）灌胃，造模結(jié)束后開始干預(yù)，每日1次，共4周。

1.2.3取材實驗結(jié)束當(dāng)日，所有大鼠禁食水。次日早8：00開始麻醉、取材。各組大鼠腹主動脈取血4～5 mL保存至采血管中。采血完成后，迅速摘取雙側(cè)卵巢、子宮，剝離周圍的筋膜及脂肪，稱取濕重并記錄。將每只大鼠左側(cè)卵巢，存放于4％多聚甲醛固定液中，右側(cè)卵巢放置液氮中快速冷凍后再轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.3指標(biāo)檢測及方法

1.3.1卵巢子宮指數(shù)計算方法：卵巢指數(shù)=卵巢總濕重（mg）/體重（g）×100%；子宮指數(shù)=子宮總濕重（mg）/體重（g）×100%。

1.3.2血清性激素水平檢測采用全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測大鼠血清FSH、LH、E2水平。

1.3.3卵巢形態(tài)學(xué)觀察將卵巢組織進行石蠟包埋，行組織切片和HE染色，顯微鏡下觀察卵巢組織變化。并根據(jù)卵泡結(jié)構(gòu)及大小對卵泡分級，分級標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)參考文獻［6］：原始卵泡（p rimordial follicles）；初級生長卵泡（p rimary follicles）；次級生長卵泡（secondary follicles）；成熟卵泡（mature follicles）；閉鎖卵泡（atretic follicles）。

1.3.4免疫組織化學(xué)染色采用免疫組織化學(xué)技術(shù)（IHC）檢測卵巢組織中細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的陽性表達情況。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法運用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料滿足正態(tài)分布時，采用單因素方差分析，兩兩比較時，若方差齊采用LSD法；若方差不齊采用Dunnett’sT3法分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。若Plt;0.05，則認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1模型評價給予VCD腹腔注射的48只大鼠動情周期均出現(xiàn)不同程度的紊亂，多表現(xiàn)為動情間期，其中有44只大鼠在連續(xù)給藥后出現(xiàn)無規(guī)律動情周期變化，但西藥組1只，中藥高劑量干預(yù)組1只，中藥高、低劑量預(yù)防組各1只，共有４只大鼠仍可觀察到類似規(guī)律動情周期的變化。在實驗過程中模型組２只，中藥高劑量預(yù)防組，中藥高、低劑量干預(yù)組，西藥組各有1只大鼠死亡。

2.2卵巢、子宮指數(shù)比較與空白組相比，模型組體質(zhì)量和臟器指數(shù)均下降（Plt;0.05）；與模型組相比，西藥組、中藥高劑量組和中藥低劑量預(yù)防組的體質(zhì)量及臟器指數(shù)均上升（Plt;0.05），而中藥低劑量干預(yù)組體質(zhì)量及臟器指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）；與西藥組相比，中藥低劑量組臟器指數(shù)均降低（Plt;0.05），而中藥高劑量干預(yù)組體質(zhì)量及臟器指數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05），中藥高劑量預(yù)防組的體質(zhì)量及臟器指數(shù)均上升（Plt;0.05）；與中藥低劑量組相比，中藥高劑量組的體質(zhì)量及臟器指數(shù)均升高（Plt;0.05），見表1。

2.3性激素水平比較與空白組相比，模型組FSH和LH升高，E2降低（Plt;0.05），這些結(jié)果表明模型組大鼠的卵巢功能下降，造模成功；與模型組比較，西藥組、中藥高劑量組、中藥低劑量預(yù)防組FSH和LH降低，E2上升（Plt;0.05），中藥低劑量干預(yù)組FSH、LH差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）；與西藥組相比，中藥低劑量干預(yù)組FSH升高，E2降低（Plt;0.05），LH無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05），中藥高劑量干預(yù)組FSH、LH和E2 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05），中藥高劑量預(yù)防組E2上升（Plt;0.05）；與中藥低劑量組相比，中藥高劑量組FSH、LH降低，E2升高（Plt;0.05），見表2。

2.4卵巢組織形態(tài)學(xué)比較空白組大鼠卵巢中各級卵泡形態(tài)和數(shù)量正常，顆粒細胞排列緊密有序。模型組大鼠各級卵泡減少，閉鎖卵泡增加，顆粒細胞排列疏松。與模型組相比，西藥組、中藥高劑量組大鼠卵巢內(nèi)各級卵泡數(shù)量有所增加，卵巢萎縮的情況得到了一定程度的改善，且中藥高劑量預(yù)防組更為明顯，見圖1。

2.5卵巢組織中Bcl-2、Bax蛋白表達的比較與空白組相比，模型組Bcl-2表達降低，Bax表達增加（Plt;0.05）；與模型組相比，西藥組、中藥高劑量組、中藥低劑量預(yù)防組Bcl-2表達增加，Bax表達降低（Plt;0.05），而中藥低劑量干預(yù)組Bcl-2和Bax表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）；與西藥組相比，中藥低劑量干預(yù)組Bcl-2表達降低，Bax表達增加（Plt;0.05），而中藥高劑量干預(yù)組Bcl-2和Bax表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05），中藥高劑量預(yù)防組Bcl-2表達增加（Plt;0.05）；與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組Bcl-2表達更高，Bax表達更低（Plt;0.05），見表3、圖2。

3討論

POI是一種常見的生殖內(nèi)分泌疾病，指女性在40歲以前卵巢功能提前衰退，主要表現(xiàn)為月經(jīng)不規(guī)律和激素水平異常變化，以及常伴有圍色經(jīng)期癥狀［7］。近年來隨著環(huán)境污染的加重、社會生存壓力的加大、生育年齡的推遲、帶瘤生存期的延長等因素，POI發(fā)病率呈明顯上升趨勢［8］。POI高度異質(zhì)、病因混雜，且發(fā)病隱匿，早期生化異常期并無癥狀，然而一旦進入臨床期，卵巢功能已降低或喪失，治療相對困難，沒有恢復(fù)卵巢功能及提高卵子質(zhì)量的有效方法［9］。因此，POI疾病形成前的早期預(yù)防和治療顯得尤為重要［10］。

早發(fā)性卵巢功能不全，在中醫(yī)學(xué)屬于經(jīng)水早斷諸證范疇［11］，發(fā)病主要源于腎虛，同時伴有心、肝、脾等功能異常，且“血瘀”貫穿其疾病整個生理病理過程。相關(guān)中醫(yī)證候分析的研究也表明，POI主要分為肝腎兩虛、脾腎兩虛和腎虛血瘀，其中肝腎兩虛占據(jù)較大比例［12］。因此，腎虛不僅是經(jīng)水早斷諸證內(nèi)分泌失調(diào)的病變基礎(chǔ)，也是經(jīng)水早斷諸證引發(fā)諸病，及其轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵因素。臨床研究顯示［13-15］，補腎方可改善POI患者的月經(jīng)情況和相關(guān)癥狀，調(diào)節(jié)其性激素水平，提高患者卵巢功能，還可通過調(diào)節(jié)各種細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)肽、激素，改善內(nèi)環(huán)境而降低慢性病發(fā)生。

本研究的干預(yù)藥“哈氏育陰湯”是哈氏婦科流派治療DOR、POI、POF等卵巢功能減退的經(jīng)驗方。哈氏婦科在治療POI時［16］，重視滋陰養(yǎng)血調(diào)經(jīng)之理念，并提出“調(diào)經(jīng)養(yǎng)血莫如滋水養(yǎng)火”的治療原則，由此，左歸丸合一貫煎加減化裁而成“哈氏育陰湯”。該方在臨床上具有滋補肝腎、育陰養(yǎng)血之良好功效。

本實驗研究表明，VCD160mg/kg腹腔注射可以成功復(fù)制卵巢損傷模型，且造模時間短、成本低。文獻報道中，VCD160mg/kg/d的劑量，連續(xù)腹腔注射15天造模方法是目前應(yīng)用最多的一種方案［17-18］。VCD 作為環(huán)境污染物，可通過加速卵泡閉鎖選擇性地破壞大鼠和小鼠的竇前卵泡［19］，較好地模擬自然狀態(tài)下卵巢功能衰竭的進程［20］。造模中和造模結(jié)束后不同時機的中藥干預(yù)，以及中藥高、低不同劑量的給藥方案，在大鼠卵巢子宮指數(shù)，血清性激素水平，卵巢組織形態(tài)學(xué)比較，卵巢組織凋亡相關(guān)蛋白表達方面，顯示出療效差異。如從量效關(guān)系上，中藥高劑量的療效不管是在預(yù)防組還是干預(yù)組均優(yōu)于低劑量的療效，且中藥高劑量預(yù)防組中其效果更為顯著；干預(yù)時機上，中藥預(yù)防組療效優(yōu)于干預(yù)組，且在部分指標(biāo)的測定中藥高劑量預(yù)防組療效甚至優(yōu)于陽性對照組。因此，相比造模后中藥干預(yù)，造模中開始中藥干預(yù)其保護效應(yīng)更明顯。這可能是由于卵巢未損傷前中藥干預(yù)能夠抑制原始卵泡發(fā)育，減輕VCD特異性損傷，從而發(fā)揮保護卵巢功能的作用。此外，性激素水平的比較中，中藥高劑量預(yù)防組及西藥組可明顯提高E2水平，降低FSH與LH水平。這說明“哈氏育陰湯”具有雌激素樣作用，因此經(jīng)過治療后大鼠低雌激素水平得到改善，下丘腦-垂體-性腺軸得到調(diào)整。細胞凋亡的機制是由Bc1-2家族嚴(yán)密調(diào)控的，Bcl-2/Bax的比例決定了細胞在受到凋亡信號刺激時是否發(fā)生凋亡［21］。西藥組及中藥高劑量組的Bc1-2蛋白表達上升，Bax蛋白表達下降，提示顆粒細胞凋亡的發(fā)生低于模型組，這對卵泡的發(fā)育有著積極地作用。

綜上，“哈氏育陰湯”可通過調(diào)控細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達，對POI大鼠性腺起保護作用，并且不同時機干預(yù)，在保護POI大鼠卵巢功能方面具有效應(yīng)差，且先于疾病的預(yù)防性干預(yù)優(yōu)于疾病發(fā)生后的治療。卵巢功能減退是長期漸進的過程，及時使用保護性措施阻止或延緩卵巢功能不全的進程，對保護女性生育能力具有重要意義。

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