吳麗娟　黃小民　何煜舟　汪云開

【摘要】目的探討丹參注射液對“二次打擊”急性肺損傷(ALI)大鼠的干預(yù)作用及可能的機(jī)制。方法Wister大鼠30只，隨機(jī)分為正常對照組、模型組、丹參干預(yù)組。采用“二次打擊”法復(fù)制大鼠急性肺損傷模型：以油酸(OA)0.2 ml／kg從尾靜脈注入，4 h后，脂多糖(LPS)2 mg／kg從另一尾靜脈注入。顯微鏡下觀察病理，測肺濕／干比重(W／D)，測定支氣管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量及中性粒細(xì)胞比例，計算肺通透指數(shù)(LPI)以評價肺損傷程度。免疫組化法檢測肺組織Fas，F(xiàn)asL蛋白表達(dá)，原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測肺組織細(xì)胞凋亡。結(jié)果“二次打擊”法可成功復(fù)制出急性肺損傷大鼠模型。實(shí)驗中丹參干預(yù)組大鼠肺組織大體及病理損傷程度均明顯輕于模型組，同時W／D，及BALF中中性粒細(xì)胞比例，肺通透指數(shù)亦較模型組明顯減輕。免疫組化結(jié)果顯示模型組Fas，F(xiàn)asL的表達(dá)明顯高于其余兩組(P＜0.01)，TUNEL示模型組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于其余兩組(P＜0.01)。Fas，F(xiàn)asL蛋白表達(dá)強(qiáng)度與凋亡指數(shù)呈正相關(guān)。結(jié)論丹參注射液對“二次打擊”所致急性肺損傷有保護(hù)作用。其機(jī)制可能與Fas，F(xiàn)asL表達(dá)減少，抑制肺組織細(xì)胞凋亡有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】二次打擊；急性肺損傷；丹參；細(xì)胞凋亡；FasFasL

急性肺損傷(ALI)是呼吸系統(tǒng)常見的急重癥之一，有較高的病死率。它是機(jī)體遭受嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克、酸中毒等各種因素打擊，出現(xiàn)的以彌漫性肺泡毛細(xì)血管膜損傷導(dǎo)致的肺水腫和微肺不張為病理特征的一種肺部炎癥和通透性增加的綜合征，目前認(rèn)為是機(jī)體過度炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞廣泛破壞的結(jié)果。而細(xì)胞凋亡在這一過程中起了重要的作用。本實(shí)驗通過“二次打擊”造成大鼠ALl模型，觀察大鼠肺組織細(xì)胞凋亡與Fas，F(xiàn)asL蛋白的表達(dá)變化，探討丹參注射液對ALl大鼠的保護(hù)作用。

1材料與方法

1．1材料

Wister大鼠30只，雌性，體重(180±10)g(浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心提供)。油酸(OA)，化學(xué)純，購自華東醫(yī)藥公司，生產(chǎn)批號20060215。脂多糖(LPS)為美國Sigma公司產(chǎn)品。丹參注射液，規(guī)格10 ml，每10 ml含生藥7.5 g，正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號20060820。細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒(In Situ CellApoptosis Detection Kit I，POD)為德國ROCHE公司產(chǎn)品。兔抗鼠Fas多克隆抗體，兔抗鼠FasL多克隆抗體，免疫組化SAC試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。蛋白定量試劑盒(考馬斯亮藍(lán)法)為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1．2方法

1．2．1分組將健康雌性Wister大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、丹參干預(yù)組，每組10只。

1．2．2大鼠急性肺損傷模型的建立模型組以30 g／L戊巴比妥40 mg／kg腹腔麻醉OA 0.2 ml／kg從尾靜脈注入，4 h后，LPS 2 mg／kg從另一尾靜脈注入。正常對照組分別以同等劑量生理鹽水代替OA和LPS，丹參干預(yù)組在給予OA前1 h，腹腔注射給予丹參注射液12 ml／kg。各組動物在第二次打擊后2 h處死。

1．2．3觀察指標(biāo)

1．2．3．1肺組織損傷指標(biāo)的測定將動物剖腹，下腔靜脈取血處死大鼠。留取抗凝血以待測血漿蛋白含量。開胸，暴露氣管，通過氣管上端的小切口插入灌胃針結(jié)扎固定，用絲線結(jié)扎右肺，分別用3ml生理鹽水灌洗左肺3次，合并3次收集到的支氣管肺泡灌洗液(BALF)，回收率80％～90％。BALF經(jīng)雙層紗布過濾，以3000 r／min離心10 min，取上清液-20℃凍存待測蛋白含量，取沉淀細(xì)胞懸液一滴于玻片上行Wright染色，計數(shù)200個細(xì)胞得出中性粒細(xì)胞的百分比?？捡R斯亮藍(lán)法測定BALF中蛋白含量，全自動生化分析儀測定血漿蛋白含量，計算肺通透指數(shù)(LPI=BALF蛋白／血漿蛋白)。肺門處結(jié)扎去下右肺，取右上肺用濾紙吸血，稱濕重后，置烤箱中(80℃，48 h)烤至恒重，稱干重，計算肺濕／干比重。

1．2．3．2肺組織學(xué)檢查右下葉經(jīng)40 g／L多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，蘇木精－伊紅(HE)染色，光鏡下進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1．2．3．3肺組織細(xì)胞凋亡原位檢測采用TUNEL法，按照細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒(in situ CellDeath Detection Kit，POD)提供方法進(jìn)行。計算5個高倍視野(×400)下的凋亡細(xì)胞數(shù)，凋亡指數(shù)以凋亡細(xì)胞／100個細(xì)胞表示。

1．2．3．4肺組織細(xì)胞的Fas、FasL蛋白的免疫組化染色步驟參照試劑盒推薦方法進(jìn)行。陰性對照采用0.01 mmol／L PBS代替一抗。結(jié)果判斷：每張切片選取5個具有代表性的視野，計數(shù)其中陽性細(xì)胞數(shù)，結(jié)果取5個視野的平均值。

1．3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。雙變量相關(guān)分析采用Bivariate過程的Pearson等級相關(guān)法分析。

2結(jié)果

2．1病理組織學(xué)觀察

正常對照組大鼠肺表面呈淡紅色，光鏡下可見組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔內(nèi)無滲出物，間質(zhì)無明顯炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁無增厚，而模型組大鼠肺表面呈暗紅色，伴明顯滲出，光鏡下肺泡壁增厚，間質(zhì)彌漫性出血，并有大量炎性細(xì)胞浸潤，可見局灶性肺不張、肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺氣腫形成。應(yīng)用丹參干預(yù)后，損傷大鼠肺表面滲出不明顯，光鏡下肺泡壁的增厚較模型組明顯減輕，間質(zhì)僅見少量炎性細(xì)胞浸潤。

2．2肺損傷指標(biāo)的變化

二次打擊后，模型組BALF中性粒細(xì)胞比例、肺通透指數(shù)及肺濕／干比重均明顯高于正常對照組(P＜0.01)，表明二次打擊法成功復(fù)制急性肺損傷模型。丹干預(yù)組與模型組相比，BALF中性粒細(xì)胞比例、肺通透指數(shù)及肺濕／干比重均明顯下降(P＜0.01)，可見丹參注射液可減輕急性肺損傷的程度。

2．3TUNEL法檢測肺組織細(xì)胞凋亡

TUNEL染色陽性以肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞為主，凋亡細(xì)胞核呈棕色，核固縮，個別細(xì)胞可見凋亡小體。模型組凋亡指數(shù)明顯高于正常對照組(P＜0.01)，丹參干預(yù)組凋亡指數(shù)與模型組比較則明顯下降(P＜0.01)，與正常對較組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2．4肺組織Fas，F(xiàn)asL蛋白表達(dá)

Fas，F(xiàn)asL陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞漿和細(xì)胞膜棕黃色染色，主要分布于支氣管黏膜上皮，肺泡上皮，及部分炎性細(xì)胞。正常對照組可見少量陽性表

達(dá)，模型組Fas FasL蛋白明顯上調(diào)，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，丹參干預(yù)組陽性表達(dá)較模型組明顯減少(P＜0.01)。

2．5相關(guān)性分析

將3組大鼠的肺組織細(xì)胞凋亡率與Fas，F(xiàn)asL蛋白表達(dá)作相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者有顯著的正相關(guān)性(r=0.849，0.853，P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3討論

ALl是目前臨床危重癥研究的熱點(diǎn)之一，但是其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，使得模擬ALl的誘發(fā)因素、發(fā)病過程等顯得很困難。既往的研究多集中于內(nèi)毒素、機(jī)械通氣損傷、油酸、缺血一再灌注、氣體吸入等所誘導(dǎo)的模型，與臨床上ALI的發(fā)病過程有一定差距。本實(shí)驗采用“OA＋LPS”二次打擊法復(fù)制ALl模型。所謂二次打擊，第一次打擊(嚴(yán)重感染或創(chuàng)傷等)激發(fā)引起機(jī)體SIRS，在此基礎(chǔ)上第二次打擊(創(chuàng)傷后感染，不恰當(dāng)復(fù)蘇等)引發(fā)SIRS失控導(dǎo)致ALI。本模型更好的模擬了臨床ALI發(fā)展的病理生理過程。本實(shí)驗采用OA致傷后4 h，以小劑量LPS實(shí)施第二次打擊，2 h后出現(xiàn)BALF中中性粒細(xì)胞比例增加，肺濕／干比重，肺通透指數(shù)增高，肺組織病理可見肺泡壁增厚，腔內(nèi)見滲出、出血等，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，表現(xiàn)為肺組織急性損傷，成功地復(fù)制了“二次打擊”急性肺損傷模型。

本實(shí)驗采用TUNEL法檢測肺組織細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)模型組凋亡指數(shù)明顯增高，表明細(xì)胞凋亡在“二次打擊”急性肺損傷中起一定作用，其機(jī)制可能有：通過肺泡上皮和血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮-上皮屏障通透性增加，液體、蛋白等滲漏到肺泡間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)，導(dǎo)致氣體交換障礙；通過巨噬細(xì)胞的凋亡，使其吞噬能力下降，使得凋亡的中性粒細(xì)胞無法被及時吞噬清除，其有毒內(nèi)容物釋放進(jìn)一步損害肺泡壁等。

Fas，F(xiàn)asL系統(tǒng)是細(xì)胞凋亡的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Fas是一種細(xì)胞表面受體，為Ⅰ型跨膜蛋白，與腫瘤因子壞死受體和神經(jīng)因子生長受體高度同源，F(xiàn)asL是Fas的天然配體，屬Ⅱ型跨膜蛋白，F(xiàn)asL與Fas結(jié)合后啟動凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)模型組Fas，F(xiàn)asL蛋白表達(dá)明顯高于正常對照組和丹參干預(yù)組(P＜0.01)，并且Fas，F(xiàn)asL蛋白表達(dá)強(qiáng)度與凋亡指數(shù)呈正相關(guān)。提示Fas，F(xiàn)asL活化可能是“二次打擊”ALl的發(fā)生機(jī)制之一。

丹參是傳統(tǒng)的中草藥，祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為丹參具有活血化瘀的作用。其主要成分為丹參酮和丹參素，研究表明其具有抗氧化、清除氧自由基、改善微循環(huán)、拮抗鈣離子及抗炎等多種作用。本實(shí)驗顯示“二次打擊”ALI大鼠采用丹參干預(yù)后，肺系數(shù)、肺通透指數(shù)，BALF中中性粒細(xì)胞比例等反映肺損傷的指標(biāo)較模型組明顯改善，證明丹參對ALI大鼠具有一定的保護(hù)作用。同時，丹參干預(yù)組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡明顯受抑制，F(xiàn)as，F(xiàn)asL蛋白的表達(dá)也下調(diào)，提示丹參對ALl大鼠的保護(hù)作用可能與Fas，F(xiàn)asL下調(diào)，抑制肺組織細(xì)胞凋亡有關(guān)。Morimoto等的研究表明活性氧可能對Fas，F(xiàn)asL系統(tǒng)的表達(dá)有上調(diào)作用，給予抗氧化劑可阻斷其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。筆者推測丹參對Fas，F(xiàn)asL表達(dá)影響可能與其抗氧化，清除氧自由基的作用有關(guān)，但具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。