徐　瑩　劉太國　何月秋　陳萬權(quán)

摘要綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)來源于海洋生物水母(Aequorea victoria)，gfp基因作為報告基因已被廣泛地應用于絲狀真菌生物學研究中。gfp基因通過與目標基因融合，可進行真菌的蛋白質(zhì)及細胞器定位、細胞動力學、突變體致病力檢測、生態(tài)學行為以及與其他生物互作等研究。

關(guān)鍵詞綠色熒光蛋白(GFP)；絲狀真菌；報告基因

中圖分類號S 432.44；Q 816

綠色熒光蛋白(green fluoreseent protein，GFP)來源于海洋生物水母(Aequorea victoria)，由于其具有穩(wěn)定、直觀、操作方便的熒光性質(zhì)和不需添加外源底物就可以在活細胞中直接檢測等無可比擬的優(yōu)點，以gfp基因作為報告基因已經(jīng)廣泛地應用于絲狀真菌分子生物學研究中。玉米黑粉菌(Usti－lago maydis)是第一個成功應用GFP的絲狀真菌，隨后作為報告基因gfp應用于構(gòu)巢曲霉(As-pergillus nidulans)和出芽短梗霉(Aureobasidi-um pullulans)。酵母是gfp基因在真菌中應用較多的真菌之一。目前，gfp已在12個屬16個種的絲狀真菌中表達，包括炭疽菌屬(Colletotri—chum)、球腔菌屬(Mycosphaerella)、大角間座殼屬(Magnaporthe)、旋孢腔菌屬(Cochliobo-lus)、木霉屬(Trichoderma)、柄孢殼菌屬(Podospora)、核盤菌屬(Sclerotinia)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、曲霉屬(Aspergil－lus)和疫霉屬(Phytophthora)。本文對GFP發(fā)光特性、發(fā)光機制、應用特點及其在絲狀真菌生物學方面的應用進行了回顧與展望。

1GFP的發(fā)光特性與機制

GFP是從水母分離出的一種天然熒光蛋白，由238個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，其熒光發(fā)射峰在509nm，最大激發(fā)波長為395nm，并在470nm處有一肩峰，GFP的化學性質(zhì)相當穩(wěn)定，其變性需在90℃或pH<4.0或pH>12.0的條件下用6 mol/L鹽酸胍處理。GFP的熒光發(fā)光機制尚不十分清楚，Morise等人曾提出一個能量傳遞模式圖來解釋水母的發(fā)光機制，但并未獲得認同。Chattoaj等對GFP進行了光譜分析，結(jié)合前人工作提出GFP有兩個明顯的吸收帶，對應于GFP的兩種不同構(gòu)象的基態(tài)A和B?；鶓B(tài)A對應于395nm的吸收峰，基態(tài)B對應于475 nm的吸收峰，基態(tài)A占優(yōu)勢，基態(tài)B的分子數(shù)量約是基態(tài)A的1/6，兩種基態(tài)間能緩慢地轉(zhuǎn)換，但激發(fā)態(tài)A之間的轉(zhuǎn)換很快且發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移，A快速高效地衰變至另一激發(fā)態(tài)，應該存在一個中間過度態(tài)I，質(zhì)子轉(zhuǎn)移使A轉(zhuǎn)變成I，I回遷到基態(tài)I時產(chǎn)生發(fā)射峰504nm的熒光，構(gòu)象改變使I轉(zhuǎn)變成B，由B到B發(fā)射熒光而不發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移。目前，對于GFP的作用機理較為認同的僅僅是：GFP是生物發(fā)光過程中的能量受體，并且是最終的發(fā)光體，不同的生物發(fā)光機制各不相同，不同的突變體發(fā)光機制也有很大差異。

2GFP的應用特點

GFP作為備受青睞的標記基因，在短短幾年時間內(nèi)便得以廣泛應用，其原因在于它具有以下優(yōu)點：

2.1易于檢測、無毒害、可進行活細胞定時定位觀察

GFP熒光反應不需要外加底物和輔助因子，只需紫外光或藍光激發(fā)，即可發(fā)出綠色熒光，用熒光顯微鏡甚至肉眼就可以觀察到，且靈敏度高，對于單細胞水平的表達也可識別。從目前的研究結(jié)果來看，GFP對生活的細胞基本無毒害，對目的基因的功能也沒有影響，轉(zhuǎn)化后細胞仍可連續(xù)傳代。對活細胞中蛋白的功能研究，更能接近自然真實的狀態(tài)。通過GFP可實時觀察到外界信號刺激下，目的蛋白的變化過程，借助于近來廣泛使用的激光掃描共聚焦顯微鏡，結(jié)合強大的計算機軟件，可進行三維顯示。

2.2熒光穩(wěn)定

GFP對光漂白有較強的耐受性，能耐受長時間的光照；GFP在pH7～12范圍內(nèi)也能正常發(fā)光；對高溫(70℃)、堿性、除垢劑、鹽、有機溶劑等都有較強抗性。

2.3通用性

表現(xiàn)在GFP的表達幾乎不受種屬范圍的限制，在微生物、植物、動物中都獲得了成功的表達；其次是GFP沒有細胞種類和位置上的限制，在各個部位都可以表達發(fā)出熒光。

2.4易于構(gòu)建載體

由于GFP分子量較小，僅為27～30ku，編碼GFP的基因序列也很短，為2.6kb，所以很方便地同其他序列一起構(gòu)建多種質(zhì)粒，而不至于使質(zhì)粒過大影響轉(zhuǎn)化頻率。

2.5易于得到突變體

GFP中氨基酸的替換可產(chǎn)生不同光譜特性的突變體，且增強了熒光強度，適合在不同物種中專性表達。

3GFP在絲狀真菌研究中的應用

3.1 GFP作為報告基因

GFP作為報告基因所表現(xiàn)出的特性尤為突出。通過GFP可探測基因表達和蛋白定位，并可在單個生物體中持續(xù)顯影成像，而用其他報告基因標記蛋白，只能短時間觀察，并且每個數(shù)據(jù)點都來源于不同的個體。GFP體內(nèi)探測不需要其他作用物，也不需要將其固定在某個組織上，因此，GFP成為人們深入了解轉(zhuǎn)化以及基因表達的有效工具。此外，在所有的培養(yǎng)物中使用熒光計可輕松量化gfP基因表達，或使用共聚焦顯微鏡在單個細胞內(nèi)、亞細胞成分內(nèi)量化gfp基因表達。通過觀察附著胞的形成過程，就可在共聚焦顯微鏡下觀察到稻瘟病菌中EGFP1與鈣調(diào)蛋白基因融合后的表達，這就表明CAMmg(稻瘟病菌鈣調(diào)蛋白)的表達需要分生孢子表面附著。通過增加植物表面蠟的含量可以阻止附著胞的侵入。在稻瘟病菌中，將SGFP與mpg1基因的增強子融合在一起來研究真菌疏水蛋白的功能關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)分生孢子中的熒光蛋白并沒有遷移到菌絲，表明mgp1的表達受到分生孢子生長的限制。在玉米真菌病原體中，SGFP與受碳源調(diào)節(jié)的Crg1增強子融合，用樹膠醛糖誘導病菌使產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子，并且SGFP所發(fā)出的熒光不干擾Crg1的Northern印跡分析。為了證明在一些個體中，SGFP能夠非常穩(wěn)定的量化Crgl的表達，并且SG-FP很可聚集，因此要在其他的轉(zhuǎn)化子中降低熒光量。編碼多聚半乳糖醛內(nèi)切酶的clpg2與SGFP融合，可在分生孢子萌芽以及形成附著孢的早期階段用熒光顯微鏡觀察，然后使用反轉(zhuǎn)錄PCR確定此基因表達的類型。

gfp基因表達后發(fā)生融合從而估測基因的表達和蛋白質(zhì)定位也成功應用到真菌當中。玉米真菌病

原體的KIN2蛋白與SGFP融合產(chǎn)生一個功能融合蛋白，事實上融合蛋白中的GFP和其他蛋白的結(jié)構(gòu)域都能同時發(fā)揮作用這就能夠在不同的生理環(huán)境中準確的研究細胞中的蛋白。2008年，Soo Chan Lee等將GFP用于細胞定位方面的研究。通過構(gòu)建參與泡囊組裝以及運輸?shù)囊活愔匾鞍譇rfA與sGFP的質(zhì)粒來標記ArfA，在熒光顯微鏡下觀察，ArfA定位在高爾基體內(nèi)。并進一步用高爾基體運輸抑制劑布雷菲(爾)德菌素處理，觀察GFP后發(fā)現(xiàn)ArfA擴散到泡液中并堆積在亞細胞室內(nèi)，表明ArfA定位并工作于高爾基體網(wǎng)絡中。

GFP在體外致病基因表達中的研究也有應用，2005年，B.Clayton使用GFP作為ALS啟動子活性的報告者，并通過流動細胞計數(shù)的方法度量所培養(yǎng)的白色念珠菌(Candida albicans)細胞中產(chǎn)生的熒光信號，使體外構(gòu)建報告菌株研究ALS基因表達成為可能。

3.2 GFP在細胞動力學中的應用

GFP被廣泛地用于絲狀真菌細胞亞結(jié)構(gòu)的研究，并具獨特的效果。例如，絲狀真菌的細胞核在生成后要運動很長一段距離才能到達菌絲頂端，經(jīng)過用GFP標記了一個核定位信號的構(gòu)巢曲霉，其細胞核區(qū)會發(fā)出明亮的熒光，從而可用于觀察細胞核的遷移和孢子萌發(fā)過程中有絲分裂的情況。用此方法觀察到了一些有趣的現(xiàn)象，例如同一菌絲中的細胞核并不是同時分裂，而是由頂端往下存在一個時間梯度，因此推測有絲分裂的時間差由一種可擴散的因子控制。最近Steid1等又報道了利用GFP對核定位進行研究的最新進展。構(gòu)巢曲霉的Ua-pC蛋白是一種高親和力、中等容量的尿酸黃嘌呤的運輸載體，Valdez-Taubas等用UapC與GFP融合的方法，對細胞內(nèi)吞作用的發(fā)生及液泡中溶酶體和內(nèi)體的功能進行了有意義的探索。Golvesin是一種在盤基網(wǎng)柄菌屬(Dictyostelium)細胞中與高爾基體膜及高爾基分泌小泡的膜有關(guān)的蛋白質(zhì)，為了對高爾基體進行活細胞內(nèi)的功能研究，Natalie等用GFP與Golvesin的C-末端及N-末端分別進行融合，并借助特異性抗體及其他標記來定位GFP與Golvesin融合蛋白，試驗結(jié)果顯示GFP融合或非GFP融合蛋白的定位相同，GFP堵塞C-末端會導致此蛋白滯留于高爾基體內(nèi)，表明自由的C-末端是Golvesin從高爾基體轉(zhuǎn)移到細胞其他部分所必需的，并且用此方法還精確地測算出高爾基體潴泡上的小管的伸出速率可達3～4μm/s。在有絲分裂過程中，融合蛋白一直保留在高爾基小泡中，因此可以觀察到在胞質(zhì)分割時高爾基體的解體與重建。

GFP還可以用來標記有絲分裂過程中的重要反應酶，從而研究此酶在有絲分裂過程中可能發(fā)揮的作用。利用GFP標記PLKA，進行活體監(jiān)測明確了活體細胞中PLKA的超量表達與定位決定著PLKA的功能，PLKA的超量表達可以促使菌絲形成，但是阻礙細胞間期的核分裂。

3.3 GFP在突變體致病力檢測中的應用

近年來，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)取得了引人注目的成就。T-DNA和轉(zhuǎn)座子作為植物基因的插入突變已廣泛應用于基因的標簽和分離中，從而成為發(fā)現(xiàn)新基因非常有效的手段。但是，在將轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)進目標菌，篩選致病力增強或減弱菌株時卻遇到了耗時量大，不易觀察到微觀侵染與擴展的難題，但gfp基因的應用解決了這一難題，人們可以將gfp基因轉(zhuǎn)化受體菌，與野生型菌進行比較來直觀觀察菌株的致病力。2005年，Ben MBarek等(私人交流)將含有mimp1轉(zhuǎn)座子的pNm1H181質(zhì)粒和含有選擇標記的pHE06質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化小麥禾谷鐮刀菌(Fusari-um graminearum)，可獲得突變體，但突變體在進行鑒定時有一定困難，無法觀察到在寄主體內(nèi)的擴展狀況，劉太國等(私人交流)再將含有g(shù)fp基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到含有以上兩個質(zhì)粒的受體菌中，獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化GFP的轉(zhuǎn)基因菌株，篩選出的突變體在致病性測定時可直接在熒光顯微鏡下觀察菌絲的生長與擴展狀況。

2007年，Iori Imazaki等將GFP應用到尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)菌株中，用來觀察Fow2基因突變體菌株的致病性。將GFP轉(zhuǎn)入F.oxyspo—rum的野生型菌株和突變體菌株中，進而在熒光顯微鏡下觀察用GFP標記的野生型菌株和突變體菌株的侵染行為，發(fā)現(xiàn)突變體菌株喪失侵染根部并定殖植物組織的能力，從而得到無致病力突變菌株。

3.4 GFP在蛋白質(zhì)表達中的應用

GFP在研究絲狀真菌分泌型蛋白的過程中發(fā)揮了重要作用。黑曲霉(Aspergillus niger)用于生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)，但產(chǎn)量普遍低于產(chǎn)生同源蛋白質(zhì)的菌株。盡管有證據(jù)表明絲狀真菌蛋白的分泌機制與其他的真核細胞類似，即分泌蛋白集中在菌絲頂端，但卻少有闡述。通過將sgfp整合到黑曲霉葡萄糖化酶的啟動子區(qū)域，使得綠色熒光蛋白與葡萄糖化酶融合，第一次可以在單菌絲水平觀察到黑曲霉體內(nèi)葡萄糖化酶的分泌情況。

GFP技術(shù)成功地應用于葡糖糖化酶的定量以研究絲狀真菌的菌絲形態(tài)對于蛋白分泌的影響。2005年，M.Talabardon等將載有pgpdAGLAGFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進黑曲霉，使得菌株能夠編碼GLA—GFP(葡糖糖化酶一綠色熒光蛋白)融合蛋白。用3種不同的培養(yǎng)方式得到載有pgpdAGLAGFP質(zhì)粒的黑曲霉不同的菌絲形態(tài)(游離細胞培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)纖維床、靜態(tài)纖維床)，結(jié)果表明，融合蛋白的表達依賴于真菌的形態(tài)。

3.5GFP在真菌與其他生物間相互作用以及在真菌環(huán)境生態(tài)學中的應用

2004年，Lu Zexun等利用GFP標記技術(shù)研究了不同真菌間的相互作用。他們通過共聚焦掃描顯微鏡和熒光立體顯微鏡監(jiān)測標記gfp的生防菌株木霉菌(Trichoderma atroviride)與土壤傳播的植物病原物在共培養(yǎng)物或黃瓜種子上的互作，在原位水平上明確了兩者的互作關(guān)系。真菌寄生菌絲沿著病原菌菌絲生長，然后卷曲，形成類似于鉤狀的特殊結(jié)構(gòu)。

2008年，K.Rajasekaran等利用GFP標記技術(shù)研究真菌侵染棉花種子及定殖。將轉(zhuǎn)入了綠色熒光蛋白標記的曲霉菌(菌株70)接種到棉花種子中，利用綠色熒光蛋白標記監(jiān)測真菌的生長、侵染途徑、定殖以及黃曲霉毒素的產(chǎn)生。分別測量接種后種子的重量，結(jié)果表明重量的減少值相似，即GFP標記菌株與野生型菌株在致病力上沒有明顯差別。同時利用菌株產(chǎn)生的綠色熒光[GFP發(fā)射的熒光強度是藍綠黃(BGYF)熒光的10倍]能夠鑒定、監(jiān)測被黃曲霉菌侵占的特殊植物組織，在接種72h內(nèi)就能觀察到真菌侵占了內(nèi)種皮和子葉。

4展望

目前，已經(jīng)獲得了酵母(Saccharomyces cerevi-

siae)的基因組全序列，而其他的一些絲狀真菌的基因組，包括構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、鏈孢霉(Neurospora CraSSa)(http：//gene.genetics.uga.edu/)、異旋孢腔菌(Cochliobolus heterostro—phus)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、疫霉菌(Phytophthora spp.)和稻瘟病菌(Magnaporthegrzsea)也已完成測序(http：//WWW.broad.mit.edu/annotation/fgi/)。那么這些真菌中每個基因的啟動子的序列也都將被確定。隨著微矩陣技術(shù)、數(shù)字圖像技術(shù)、生物信息學技術(shù)的飛速發(fā)展和日趨完善，能夠?qū)喖毎?、單個細胞、整個有機體或單微矩陣的復雜熒光圖片進行高通量的檢測、儲存和顯示。因此，GFP技術(shù)與這些技術(shù)結(jié)合起來將對未來的真菌生物學產(chǎn)生深遠影響。

目前，微矩陣技術(shù)可以同時分析一個環(huán)境的群體中上百個基因的表達，然而，這需要對有機物或特定組織在不同時間點進行RNA提取和cDNA的合成。對任何一個基因的功能分析都不僅包括何種環(huán)境因素刺激該基因表達，而且包括在哪種組織、哪個時間段產(chǎn)生及其產(chǎn)生的蛋白產(chǎn)物的亞細胞的位置和編碼該基因表型的等位基因。以gfp為報告基因的轉(zhuǎn)座子、啟動子庫、PCR為目的模塊等解決了上述問題，且已在酵母和細菌中應用。真菌基因組學及改進的轉(zhuǎn)化技術(shù)、高同源重組率、PCR和真菌轉(zhuǎn)座子的鑒定使得已在細菌和酵母中成功應用的基因組研究在絲狀真菌中成為可能，這些發(fā)展可以大量地進行真菌基因功能分析，而對于許多絲狀真菌，低轉(zhuǎn)化率制約了這一途徑。

在復雜環(huán)境中能夠高通量篩選大量通過基因組方法產(chǎn)生的突變真菌是從未遇到的挑戰(zhàn)。在細菌系統(tǒng)中，Sternberg等發(fā)明了一種決定細菌在通流室分布和生長的技術(shù)，該技術(shù)將編碼不穩(wěn)定的GFP蛋白的gfp基因與rRNA融合，從而可以實時觀測細菌在復雜菌落中的生長和分布，這種發(fā)明也可以應用到真菌系統(tǒng)中。許多研究人員利用GFP標記的真菌來研究真菌在自然系統(tǒng)中的分布，改造真菌所在的復雜環(huán)境，無論是在實驗室或是封閉的溫室內(nèi)，仍存在一些挑戰(zhàn)。由于許多絲狀真菌可以產(chǎn)生大量的易于擴散的孢子，且這些孢子在空氣中易于積累到高濃度，因此操作這些基因改造過的真菌需在封閉的環(huán)境內(nèi)，這些微生物進入環(huán)境所帶來的生態(tài)影響尚需評估，特別是那些未知的選擇基因必須要慎重考慮。雖然自轉(zhuǎn)化生物中消除選擇標記的技術(shù)已經(jīng)成熟，但尚缺乏關(guān)于轉(zhuǎn)化真菌釋放到環(huán)境中真菌相關(guān)的適合度、病害流行學及可能引起的生態(tài)影響的研究。目前美國農(nóng)業(yè)部已經(jīng)同意釋放基因改造過的真菌，關(guān)于釋放的條件及其相關(guān)的環(huán)境評估報告可在相關(guān)網(wǎng)址http：//www.nbiap.vt.edu/cfdocs/fieldtestsl.cfm中找到。

總之，在獲取大量真菌基因組信息的同時，GFP也在分子工程改造、熒光探測和圖像分析上取得了相當大的發(fā)展，綜合利用這些技術(shù)和信息會給真菌生物學帶來光明的前景。