BCSG1甲基化狀態(tài)與乳腺癌的相關(guān)性

吳劍秋， 張莉莉， 馬大偉

乳腺癌特異基因(breast cancer specific gene 1,BCSG1)又名SNCG(γ-synuclein gene)，是1997年用cDNA 直接測序法發(fā)現(xiàn)的乳腺癌相關(guān)基因[1-4]。已有的研究表明BCSG1在正常乳腺組織中低表達, 在乳腺癌組織中高表達，在乳腺癌的預(yù)后判斷和抗腫瘤藥物篩選中有重要作用[ 5-8]。Pan等[9-12]首先報道 BCSG1第一外顯子區(qū)域CpG島甲基化狀態(tài)在基因的表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用，其在正常乳腺組織中呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，而在乳腺癌組織中呈現(xiàn)高去甲基化狀態(tài)，同時其異常去甲基化是其在乳腺癌中異常高表達的重要機制之一。但DNA甲基化可受遺傳背景、環(huán)境因素等諸多因素的影響，在不同種族人群中，同一基因的甲基化狀態(tài)及其在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用可能存在較大差異[13-16]。關(guān)于中國人群乳腺癌患者中BCSG1甲基化與乳腺癌的關(guān)系，目前尚無定論。本研究擬通過一定樣本量的觀察，探討在中國人群乳腺癌患者中，BCSG1甲基化在乳腺癌發(fā)病及良性增生或纖維腺瘤中的作用。探討位于BCSG1第一外顯子區(qū)域CpG島甲基化狀態(tài)與臨床病理特征的關(guān)系以及BCSG1甲基化作為乳腺癌分子標志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 研究材料

江蘇省腫瘤醫(yī)院2007—2008年經(jīng)手術(shù)切除的具有完整臨床病理資料的乳腺組織標本，獲取新鮮標本后迅速凍存于液氮，然后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱中保存。其中乳腺癌及對應(yīng)的癌旁組織82例，良性病變組織78例。82例乳腺癌患者，年齡28～75歲，平均年齡56.7歲。其中浸潤性導(dǎo)管癌75例，浸潤性小葉癌2例，其他5例。

1.2 研究方法

1.2.1 組織標本的基因組DNA 采用組織DNA提取試劑盒提取基因組DNA(德國Qiagen)。具體操作按試劑盒說明書進行。 DNA/RNA微量定量儀測定所提基因組DNA濃度及OD260/OD280。

1.2.2 基因組DNA亞硫酸氫鹽修飾 采用DNA Cp G島甲基化修飾試劑盒(Cp Genome DNA Modification Kit，Chemicon公司，S7820)對DNA樣品進行亞硫酸氫鈉修飾。具體操作按試劑盒說明書進行。取1.0 μg DNA 樣品溶于100 μL H2O 中，加入7.0 μL 3M NaOH，50℃溫育10 min。加入550 μL新鮮配制的DNA 修飾試劑Ⅰ，振搖后于50℃避光溫育4～16 h。然后進行脫鹽、去磺基、二次脫鹽，最后用25 μL的TE緩沖液將DNA 洗脫下來。

1.2.3 PCR擴增 設(shè)計兩對引物，去甲基化特異性引物簡稱為U(unmethylation)，甲基化特異性引物簡稱為M(methylation)。見表1。

表1 BCSG1基因甲基化特異PCR引物序列

每個PCR反應(yīng)體積為25 μL，內(nèi)含：1.5 mmol/L的MgCl2，200 μmol/L的dNTPs，200 nmol/L的引物，經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的DNA樣品1 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 15 min，95℃ 40秒，52℃或60℃ 40秒，72℃40秒，共40個循環(huán)，最后72℃ 10 min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物分析 取8 μL PCR產(chǎn)物于2.0%的瓊脂糖凝膠中，100 V電泳約30 min。于凝膠成像系統(tǒng)中進行成像分析。

1.2.5 甲基化狀態(tài)判定標準 每個樣本都用兩對引物(U和M)進行MSP擴增，同批修飾處理的基因組CG位點全去甲基化和全甲基化的DNA(Chemicon公司)，分別作為去甲基化和甲基化引物的陽性對照，二者分別只能由去甲基化引物和甲基化引物擴增出相應(yīng)大小的條帶；陰性對照采用加ddH2O而不加模板的PCR體系，見圖1。若該基因發(fā)生了甲基化，則用甲基化特異性引物可擴增出相應(yīng)大小的條帶，用M表示；若為去甲基化，則用去甲基化特異性引物可擴增出相應(yīng)大小的條帶，用U表示；若該基因發(fā)生了部分甲基化，則甲基化和去甲基化特異性引物均可擴增出相應(yīng)大小的條帶。見圖2。

圖1 MSP檢測BCSG1甲基化狀態(tài)的對照體系；U-DNA：基因組CG位點全去甲基化DNA；M-DNA：基因組CG位點全甲基化DNA；U：去甲基化特異性引物；M：甲基化特異性引物

圖2 MSP檢測石蠟包埋乳腺組織BCSG1甲基化狀態(tài)

1.2.6 PCR產(chǎn)物測序 為驗證MSP的特異性，隨機選取PCR產(chǎn)物送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用EpiInfo 6軟件，采用兩樣本率的χ2檢驗或者Fisher′s確切概率法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中BCSG1甲基化狀態(tài)檢測結(jié)果

本組研究中所有組織標本中均檢測到去甲基化狀態(tài)的存在，其中在82例乳腺癌和相應(yīng)癌旁組織中分別有27例(32.9%)和15例(18.3%)檢測到純合性去甲基化，78例乳腺良性病變組織25例(32.1%)檢測到純合性去甲基化；82例乳腺癌和相應(yīng)癌旁組織分別有55例(67.1%)和67例(81.7%)檢測到甲基化，78例乳腺良性病變組織53例(67.9%)檢測到甲基化，均為雜合型甲基化；BCSG1的完全去甲基化狀態(tài)在乳腺癌旁組織與癌組織(χ2=4.61，P<0.05)、癌旁組織與良性病變組織間(χ2=4.04，P<0.05)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2～4。

表2 各種乳腺組織中BCSG1的甲基化狀態(tài)

表3 乳腺癌組織與癌旁組織中BCSG1的甲基化狀態(tài)

表4 乳腺良性病變組織與癌旁組織中BCSG1的甲基化狀態(tài)

2.2 BCSG1甲基化狀態(tài)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

統(tǒng)計結(jié)果顯示，BCSG1甲基化狀態(tài)與乳腺癌患者年齡，腫瘤大小，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況，組織學(xué)類型，病理分級之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表5。

表5 BCSG1甲基化狀態(tài)與臨床資料間的關(guān)系

3 討論

BCSG1第一外顯子區(qū)域的CpG島的甲基化狀態(tài)是影響其轉(zhuǎn)錄的主要機制之一，而BCSG1甲基化則有可能成為乳腺癌的標志物。然而，DNA甲基化可受遺傳背景、環(huán)境因素等諸多因素的影響，在不同種族人群中，同一基因的甲基化狀態(tài)及其在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用可能存在較大差異。Gupta等[12-16]的研究就表明，GSTP1，CD44和E-Cadherin等基因的甲基化狀態(tài)在不同種族人群中存在較大差異。本文研究了乳腺癌患者BCSG1甲基化及其與臨床資料的關(guān)系并得到如下結(jié)果：(1)乳腺癌、癌旁組織以及乳腺良性病變組織中BCSG1第一外顯子區(qū)域CpG島的甲基化狀態(tài)均存在去甲基化；(2)其甲基化狀態(tài)與臨床指標之間無顯著關(guān)聯(lián)。已有報道顯示[8]，乳腺癌組織中BCSG1的甲基化頻率比乳腺癌旁組織和良性病變組織低，而我們的研究結(jié)果顯示，不僅在癌旁組織，良性病變組織中BCSG1的甲基化頻率亦低于乳腺癌旁組織,提示BCSG1的去甲基化在腫瘤發(fā)生進程中所起的作用。與國外報道[11-12]不同 ，在中國人群正常組織中，我們也檢測到BCSG1的去甲基化狀態(tài)，這一結(jié)果提示我們將甲基化狀態(tài)用作腫瘤標志物時需考慮遺傳背景及種族間的差異。

綜上所述，我們的結(jié)果顯示在中國人群乳腺癌患者中，BCSG1具有獨特的甲基化狀態(tài)和表達模式，這一結(jié)果提示BCSG1的甲基化狀態(tài)及其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用可能因種族和遺傳背景的不同而不同。而BCSG1是否能用作乳腺癌輔助診斷和預(yù)后判斷的分子標志物還需要在不同種族、不同遺傳背景的人群中進行大規(guī)模樣本的研究。

[1] Ji H, Liu YE, Jia T, et al. Identification of a breast cancer-specific gene, BCSG1, by direct differential cDNA sequencing[J]. Cancer Res，1997,57(4): 759-764.

[2] Lavedan C, Leroy E, Dehejia A, et al.Identification, localization and characterization of the human γ-synuclein gene[J]. Hum Genet，1998, 103(1): 106-112.

[3] Ninkina NN, Alimova-Kost MV, Paterson JWE, et al.Organization, expression and polymorphism of the human persyn gene[J]. Hum Mol Genet，1998, 7(9): 1417-1424.

[4] Clayton DF, George JM.The synucleins: a family of proteins involved in synaptic function, plasticity, neurodegeneration and disease[J]. Trends Neurosci, 1998, 21(6): 249-254.

[5] Bruening W, Giasson BI, Klein-Szanto AJ, et al. Synucleins are expressed in the majority of breast and ovarian carcinomas and in preneoplastic lesions of the ovary[J]. Cancer, 2000,88(9): 2154-2163.

[6] Wu K, Quan Z, Weng Z,et al.Expression of neuronal protein synuclein gamma gene as a novel marker for breast cancer prognosis[J]. Breast Cancer Res Treat, 2007, 101(3): 259-267.

[7] Jia T, Liu YE, Liu J, Shi YE. Stimulation of breast cancer invasion and metastasis by synuclein γ[J]. Cancer Res, 1999,59(3): 742-747.

[8] Liu J, Spence MJ, Zhang YL, et al. Transcriptional suppression of synuclein γ(SNCG) expression in human breast cancer cells by the growth inhibitory cytokine oncostatin M[J]. Breast Cancer Res Treat，2000, 62(2): 99-107.

[9] Pan ZZ, Bruening W, Giasson BI, et al.γ-Synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating MAPK pathways[J]. J Biol Chem, 2002, 277(38): 35050-35060.

[10] Inaba S, Li C, Shi YE,et al.Synuclein gamma inhibits the mitotic checkpoint function and promotes chromosomal instability of breast cancer cells[J]. Breast Cancer Res Treat ,2005, 94(1): 25-35.

[11] Lu A, Gupta A, Li C, et al. Molecular mechanisms for aberrant expression of the human breast cancer specific gene 1 in breast cancer cells: control of transcription by DNA methylation and intronic sequences[J]. Oncogene, 2001, 20(37): 5173-5185.

[12] Gupta A, Godwin AK, Vanderveer L,et al. Hypomethylation of the synucleinγ gene CpG island promotes its aberrant expression in breast carcinoma and ovarian carcinoma[J]. Cancer Res ,2003, 63(3): 664-673.

[13] Ushijima T. Detection and interpretation of altered methylation patterns in cancer cells[J]. Nature Reviews Cancer, 2005, 5(3): 223-231.

[14] Feinberg AP. Phenotypic plasticity and the epigenetics of human disease[J]. Nature, 2007, 447(7143): 433-440.

[15] Enokida H, Shiina H, Urakami S, et al. Ethnic group-related differences in CpG hypermethylation of the GSTP1 gene promoter among African-American, Caucasian and Asian patients with prostate cancer[J]. Int J Cancer, 2005, 116(2): 174-181.

[16] Woodson K, Hayes R, Wideroff L, et al. Hypermethylation of GSTP1, CD44, and E-Cadherin genes in prostate cancer among US blacks and whites[J]. Prostate, 2003, 55(3): 199-205.