余文林　畢　媛　程　　飚　李　勤　楊傳紅　劉宏偉　曾　東

[摘要]目的：探討結(jié)締組織生長因子（CTGF）在植皮術(shù)后殘余創(chuàng)面中的表達情況及可能的意義。方法：應(yīng)用免疫組化（IHC）和半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測創(chuàng)面組織中CTGF蛋白和mRNA的表達。結(jié)果：CTGF蛋白及mRNA在殘余創(chuàng)面組織中高度表達，CTGF陽性顆粒面密度及mRNA指數(shù)分別為（0.512±0.054）和（0.91±0.23），與正常皮膚組織比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；殘余創(chuàng)面修復(fù)后，CTGF的表達下降到正常皮膚的水平。結(jié)論：CTGF可能在殘余創(chuàng)面愈合的過程中發(fā)揮重要的促進作用。

[關(guān)鍵詞]殘余創(chuàng)面；結(jié)締組織生長因子；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)；免疫組化

[中圖分類號]R622Q 813.1[文獻標識碼]A[文章編號]1008-6455（2009）02-0194-03

Expression and effectiveness of connective tissue growth factor in residual wound

after skin grafting

YU Wenlin, BI Yuan, CHENG Biao, LI Qin, YANG Chuan-hong, LIU Hong-wei, ZENG Dong

（*Department of Plastic surgery, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Region, Guangzhou 510010, Guangdong, China）

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of connective tissue growth factor(CTGF) in residual wound tissue after skin grafting.MethodsThe CTGF protein and mRNA were detected in residual wound tissue by immunohistochemistry and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) respectively.ResultsCompared with normal skin tissue, CTGF protein and mRNA were over-expressed in residual wound tissue. The area density value and mRNA index of CTGF were （0.512±0.054） and （0.91±0.23） respectively, which were significantly higher than that of normal skin tissue (P<0.01).As the wounds repaired, the expression of CTGF mRNA and protein reduced to normal level.ConclusionIt is suggested that CTGF play an important role during the healing process of residual wound tissue.

Keywords:residual wound;connective tissue growth factor;reverse transcription polymerase chain; immunohistochemistry

不論是燒傷后切、削痂植皮，肉芽創(chuàng)面植皮，還是瘢痕切除后植皮，都可能因為皮片不完全存活而遺留殘余創(chuàng)面。在這種創(chuàng)面愈合過程中，可能有多種生長因子參與并發(fā)揮作用，如TGF、EGF、FGF、IGF等[1]。結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor， CTGF)有促進成纖維細胞增殖，細胞外基質(zhì)沉積的作用[2]。正常皮膚組織極少表達CTGF，但皮膚創(chuàng)傷或炎癥可誘導CTGF呈強表達[3]，說明CTGF可能在創(chuàng)面愈合的過程中起到重要作用。我們通過檢測CTGF在植皮術(shù)后殘余創(chuàng)面組織中的表達情況，試圖揭示CTGF在創(chuàng)面愈合過程中的作用。

1材料和方法

1.1標本來源：實驗標本分為植皮術(shù)后殘余創(chuàng)面組、創(chuàng)面愈合組和正常皮膚組織組。所有標本均來源于我科因植皮術(shù)后有殘余創(chuàng)面需行再次植皮整復(fù)手術(shù)的患者，共10例，年齡17～47歲。再次植皮整復(fù)手術(shù)時間為首次術(shù)后10-20d，殘余創(chuàng)面組標本于再次整復(fù)時切取，創(chuàng)面愈合組標本于再次植皮愈合3個月后切取，正常皮膚組于再次植皮時在取皮區(qū)切取。殘余創(chuàng)面局部無感染，均未進行過任何藥物治療，亦無傳染、免疫、遺傳和皮膚等疾病。標本切取時均征得患者同意。所有標本均分為兩份，一份大小約1mm×3mm，置入4%中性甲醛中固定；另一份約0.2～0.3kg放入無RNA酶的專用離心管中，立即置入液氮中冷凍保存。

1.2 主要試劑：CTGF羊抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔抗羊即用型SABC免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自邁新公司。Trizol液及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國promega公司，Taq酶和DNA分子標準均購自TaKaRa公司。

1.3方法

1.3.1HE染色：按常規(guī)方法進行。

1.3.2 免疫組織化學染色：按照即用型SABC免疫組化染色說明書進行，兔血清封閉，微波抗原修復(fù)，山羊抗人CTGF多克隆抗體稀釋度為1:200，DAB顯色，PBS代替一抗作為空白對照。半數(shù)切片不經(jīng)蘇木素復(fù)染，留作圖像分析，其余切片經(jīng)蘇木素復(fù)染。用圖像分析系統(tǒng)在20倍物鏡下每張切片自表皮層向真皮層按系統(tǒng)抽樣法隨機抽取5個視野，測定陽性顆粒的總面積，然后計算出面密度。

1.3.3 RT-PCR檢測CTGF mRNA表達：標本各取100mg組織，置于研缽的液氮中研磨，收集并用1ml Trizol液裂解組織，氯仿、異丙醇提取總RNA，用紫外分光光度計測定RNA樣品純度（A260/A280為1.8～2.0），反轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)按試劑盒說明書進行。CTGF上游引物：5'-AACTATGATTAGAGCCAACTGCCTG-3'，下游引物：5'-TCATGCCATGTCTCCGTACATCTTC-3'，產(chǎn)物475bp，退火溫度55℃。以管家基因GAPDH為內(nèi)參照，上游引物：5'-GGTCGGAGTCAACGG ATTTGGTCG-3'，下游引物：5'-CCTCCGACGCCTGCTTCACCAC-3'，產(chǎn)物788bp，退火溫度54.5℃。PCR擴增條件為94℃預(yù)變性5min，接著30個擴增循環(huán)：94℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，然后72℃延伸10min，總體積為30μl。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳后，用Bio-RAD凝膠掃描儀分析DNA電泳條帶的光密度值，并計算mRNA指數(shù)（RI）=CTGF mRNA RT-PCR產(chǎn)物光密度值/GAPDH mRNA RT-PCR產(chǎn)物光密度值，以RI作為組織中CTGF mRNA的相對含量。

1.4統(tǒng)計學處理：實驗所得數(shù)據(jù)用SPSS 10.0軟件進行分析，以均數(shù)±標準差（x±s）表示。兩樣本比較用t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1HE染色：與正常皮膚組織相比，創(chuàng)面淺層膠原纖維呈玻璃樣變，其深層毛細血管增生、輕度擴張充血，成纖維細胞數(shù)目增多，排列紊亂，并有中性粒細胞和大量淋巴細胞浸潤，混雜有少數(shù)巨噬細胞，尤以毛囊、汗腺等附屬器附近最為顯著。殘存的皮膚附件上皮細胞縱向增殖，繼而呈舌狀向創(chuàng)面爬行、覆蓋，創(chuàng)緣的成纖維細胞和內(nèi)皮細胞亦顯示增生活躍。

2.2免疫組織化學染色：CTGF蛋白染色陽性信號為棕黃色顆粒，定位于細胞漿，空白對照無棕黃色著色。創(chuàng)面淺層大量成纖維細胞內(nèi)有顯著的陽性信號，部分內(nèi)皮細胞和深層成纖維細胞中有少量陽性信號，毛根鞘細胞、毛球基質(zhì)細胞和皮脂腺細胞中均可見陽性信號（圖1A）。創(chuàng)緣表皮基底細胞和大部分角質(zhì)形成細胞亦可見陽性信號，創(chuàng)緣真皮層中可見大量彌漫性分布的有陽性信號的成纖維細胞，著色較深，排列紊亂（圖1B）。正常皮膚真皮層中CTGF蛋白表達陽性的成纖維細胞明顯減少，著色亦較淺，排列較規(guī)則。創(chuàng)面愈合組僅真皮層部分成纖維細胞可見少量陽性信號。兩組CTGF蛋白陽性顆粒分布面密度見表1、圖2。創(chuàng)面CTGF表達明顯高于創(chuàng)面愈合組及正常皮膚（P<0.01）。

2.3 CTGF mRNA表達：管家基因GAPDH在三組組織標本中的轉(zhuǎn)錄水平較為恒定，可作為CTGF PCR產(chǎn)物的相對定量標準。兩組標本經(jīng)RT-PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)電泳分離并在紫外燈下觀察，可見在788bp及475bp位置上各出現(xiàn)一特異性條帶，與預(yù)期擴增片段長度相符，提示為特異性的CTGF和GAPDH cDNA。CTGF和GAPDH mRNA的RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖3，兩組的RI值見表1、圖2。創(chuàng)面組的RI值與創(chuàng)面愈合組及正常皮膚組織組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），CTGF mRNA在創(chuàng)面組織中存在強表達；創(chuàng)面愈合組與正常皮膚組相比無統(tǒng)計學意義（P>0.05）

3討論

創(chuàng)面愈合是一個由多種細胞、生長因子和細胞外基質(zhì)之間相互作用的復(fù)雜的病理生理過程。盡管創(chuàng)面愈合的過程表現(xiàn)為炎性細胞浸潤，修復(fù)細胞遷移、增殖和細胞外基質(zhì)合成等一系列以細胞活動為主的變化，但實質(zhì)上是多種生長因子和細胞因子對上述細胞功能活動發(fā)揮精細調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程。

研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）在創(chuàng)面愈合過程中起著重要的作用。能直接刺激成纖維細胞合成基質(zhì)蛋白(包括纖維連接蛋白)、膠原、胺基葡糖等。并對新合成的細胞基質(zhì)的降解具有明顯的抑制作用，對上皮細胞具有趨化作用。此外TGF-β1是刺激創(chuàng)面肉芽組織形成最有效的細胞因子，對表皮創(chuàng)面愈合有明顯促進作用，可增加傷口組織抗張強度和促使新血管再生[4]。最近，大量的研究發(fā)現(xiàn)CTGF在許多病理情況下與TGF-β1的表達同步增高，并證實CTGF是TGF-β1的下游效應(yīng)因子[2]。

目前，對于創(chuàng)面愈合后瘢痕組織中CTGF的表達情況有較多研究：在病理性瘢痕組織中CTGF呈現(xiàn)特征性的高表達，表達程度與瘢痕增生程度呈成正相關(guān)。在瘢痕的成熟期CTGF的表達明顯下降，甚至檢測不出[5-7]。這些結(jié)果表明病理性瘢痕中CTGF的表達程度與成纖維細胞的增殖和細胞外基質(zhì)的合成程度呈正相關(guān)。然而，目前尚未見CTGF在創(chuàng)面愈合過程中的動態(tài)變化情況的報道。在創(chuàng)面愈合的炎癥期、增殖期和塑形期等三個過程中的表達規(guī)律尚不清楚。創(chuàng)面愈合的增殖期表現(xiàn)為大量的修復(fù)細胞增殖和分化，大量新生血管和成纖維細胞及其合成的基質(zhì)形成肉芽組織。為探討此時的創(chuàng)面組織是否有CTGF的高表達，我們利用植皮殘余創(chuàng)面的實驗研究結(jié)果表明，在正常皮膚細胞內(nèi)有極少量的CTGF基因表達，創(chuàng)面愈合的增生修復(fù)期，創(chuàng)面成纖維細胞及創(chuàng)緣皮膚基底細胞和角質(zhì)形成細胞內(nèi)有強CTGF陽性信號表達。當創(chuàng)面修復(fù)后，組織內(nèi)CTGF的表達水平恢復(fù)至正常水平。動物實驗已經(jīng)證明，在創(chuàng)面第三天組織中富集了大量的中性粒細胞，不斷產(chǎn)生TGF-β1，達到高峰，隨著炎癥期向增生期過渡，TGF-β1的表達逐漸下降，但仍高于正常水平；而CTGF的表達在創(chuàng)面第九天達到高峰[8]。結(jié)合我們的實驗結(jié)果可以認為：創(chuàng)面組織產(chǎn)生TGF-β1，誘導成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞過度表達CTGF，成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞又可通過自分泌和旁分泌的機制促進CTGF的表達達到高峰，CTGF從而促進成纖維細胞增殖、分化、血管增生和細胞外基質(zhì)的沉積，這與創(chuàng)面愈合的增殖期肉芽組織長入的時間相吻合。隨著增殖期的結(jié)束，創(chuàng)面修復(fù)完成，進入到塑形成熟期后，CTGF的表達逐漸降至正常水平。

綜上所述，在創(chuàng)面愈合過程中，CTGF基因有明顯表達，其表達規(guī)律性和創(chuàng)面愈合時間有密切關(guān)系，可能在不同的愈合時間所起的作用有所不同，提示CTGF在創(chuàng)面愈合過程中發(fā)揮著重要作用。但CTGF在創(chuàng)面愈合過程中的動態(tài)規(guī)律性變化特點尚需要進一步的動物實驗觀察。

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[收稿日期]2008-10-14[修回日期]2009-01-08

編輯/張惠娟