魏茂富　盧義生　劉鏡文　劉冠蘭　張彩弟　康東平

[摘要] 目的：探討p21、p27、bcl- 2蛋白在大腸癌、大腸腺瘤及正常大腸黏膜中的表達(dá)及其臨床意義。方法：采用免疫組化方法,分別檢測(cè)20例正常大腸黏膜、22例大腸腺瘤和69例大腸癌中p21、p27、bcl- 2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：p21、p27、bcl- 2蛋白總陽(yáng)性表達(dá)率分別為44.93%、50.72%、52.17%，各種蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率在大腸癌組織與對(duì)照組間存在的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 。其中發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中p21陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；p27蛋白的表達(dá)與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中bcl-2陽(yáng)性表達(dá)率低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高分化、中分化腺癌與低分化腺癌相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TNM Ⅳ期bcl-2表達(dá)率顯著低于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期（P<0.05）。結(jié)論：p21、p27、bcl- 2蛋白與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，聯(lián)合檢測(cè)p21、p27、bcl-2對(duì)于臨床診斷大腸癌及判斷病情、預(yù)后有重要意義。

[關(guān)鍵詞] p21；p27；bcl-2；大腸腺瘤；大腸癌

[中圖分類號(hào)]R735.3+4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B [文章編號(hào)]1674-4721（2009）02（a）-022-04

Study of expression of p21, p27, bcl-2 in colorectal carcinoma, adenoma and normal tissues

WEI Mao-fu1,LU Yi-sheng2,LIU Jing-wen1,LIU Guan-lan1,ZHANG Cai-di1,KANG Dong-ping3

(1. Department of Pathology, Humen Hospital, Dongguan 523900,China;2. Department of Pathology, Peoplep's Hospital of Dongguan, Dongguan 523018,China;3.Department of Pathology, Taiping Hospital, Dongguan 523900,China)

[Abstract] Objective:To investigate the relationship between the expression of p21, p27, bcl-2 in the normal colorectal mucous membrane, colorectal adenoma ,carcinoma and clinicopathologic features. Methods:The expression of p21, p27, bcl-2 was detected respectively in 69 patients with colorectal carcinoma , 22 with colorectal adenoma and 20 normal colorectal mucous membrane by the immunohistochemical staining. Results:The frequency of p21, p27, bcl-2 staining in carcinoma tissues is 44.93%、50.72%、52.17%, respectively , being significantly difference in positive rates of these protein of control sample (P<0.05). The positive rate of p21 immunostaining was 70.83% in patients with lymphytic metastasis being significantly higher than that of in patients without lymphytic metastasis 31.11%(P<0.05) . A statistically significant difference in p27 staining was found in relation to the histologic grade (P<0.05). The positive rate of bcl-2 immunohistochemical staining was 33.33% in patients with lymphytic metastasis, compared with 62.22% in patients without lymphytic metastasis (P=0.022 1). A statistically significant difference in bcl-2 staining was found in relation to the histologic grade(P<0.05). Staining frequency for bcl-2 in TNM Ⅳ was significantly lower than those of TNM Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ(P<0.05) . Conclusion:The results suggest that p21, p27, bcl-2 protein have relations with the genesis and development of colorectal carcinoma. The detection for these proteins will play an important part in clinical diagnosis and prognosis.

[Key words] p21; p27; bcl-2; Colorectal adenoma; Colorectal carcinoma

分子生物學(xué)研究表明大腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素共同參與的多階段復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程, 其與癌基因激活, 抑癌基因失活密切相關(guān)。為此我們對(duì)大腸癌組織中p21、p27、bcl-2 基因同時(shí)進(jìn)行檢測(cè), 以探討各基因在大腸癌組織中表達(dá)的臨床意義以及相互關(guān)系。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源

收集我院及東莞市太平人民醫(yī)院2003年3月～2008年3月手術(shù)切除經(jīng)病理證實(shí)的大腸腺瘤標(biāo)本22例,大腸癌標(biāo)本69例，另外選取正常大腸黏膜標(biāo)本20例作為對(duì)照觀察。69例大腸癌標(biāo)本中, 男38例,女31例，年齡28～82歲，平均年齡59.1歲,術(shù)前均未作任何抗腫瘤治療。高分化腺癌5例,中分化腺癌17例,低分化腺癌47例。24例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。TNM分期:Ⅰ期10例、Ⅱ期27例、Ⅲ期23例、Ⅳ期9例。

1.2試劑及免疫組化染色方法

鼠抗人p21、p27、bcl-2單克隆抗體、抗體稀釋液及試劑盒均購(gòu)自基因公司。p21稀釋度為1∶50，P27、bcl-2稀釋度為1∶200。所有標(biāo)本均用10 %中性甲醛固定,石蠟包埋,4 μm 連續(xù)切片,按二步法法進(jìn)行免疫組化染色,染色前標(biāo)本切片進(jìn)行抗原修復(fù)處理，一抗在室溫孵育1 h，二抗在室溫下孵育0.5 h，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染。用已知陽(yáng)性的大腸癌標(biāo)本作p21、p27、bcl-2抗體的陽(yáng)性對(duì)照，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3判斷標(biāo)準(zhǔn)

所有免疫組化片子用奧林帕斯BX50顯微鏡進(jìn)行定性和半定量評(píng)估。請(qǐng)3個(gè)高職稱病理醫(yī)生在不知道臨床信息的情況下獨(dú)立的對(duì)所有免疫組化片子進(jìn)行評(píng)估。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核、細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞膜出現(xiàn)了黃色或棕黃色顆粒狀,并用陽(yáng)性片作為對(duì)照。每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野,40×10 高倍顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

p21參照文獻(xiàn)[1]方法根據(jù)染色的強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量分別記分。A :染色強(qiáng)度，不著色為0 分,淡黃色為1 分,黃色為2 分,棕黃色為3 分。B :陽(yáng)性細(xì)胞所占百分率，<5%為0分，5%～25%為1分，26％～50％為2分，51％～75％為3分，>75％為4分。根據(jù)染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)得分之和分為4級(jí),即(－)為0分,弱陽(yáng)性( + )為1～2分,陽(yáng)性(++)為3～4分,強(qiáng)陽(yáng)性(+++)為5～6分。將A×B作為其染色的計(jì)數(shù),只有A×B>3分才算免疫反應(yīng)陽(yáng)性,并按乘積分?jǐn)?shù)將染色結(jié)果分為4個(gè)等級(jí):- (0～2分)、+ (3～5分) 、+ + (6～8) 分和+ + + (9～12) 分?！?分為高表達(dá), < 6分為低表達(dá)。

p27參照文獻(xiàn)[2]，a：染色強(qiáng)度(0分為陰性,1 分為淡黃色，2分為棕黃色,3分為棕褐色)；b：陽(yáng)性細(xì)胞所占百分率(0分為陰性,1 分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤25%，2分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)26%～50%，3分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)51%～74%，4分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥75%) 。將a×b作為其染色的計(jì)數(shù),只有a×b> 3分才算免疫反應(yīng)陽(yáng)性,并按乘積分?jǐn)?shù)將染色結(jié)果分為4個(gè)等級(jí):- (0～2分) 、+ (3～5分) 、+ + (6～8) 分和+ + + (9～12) 分。≥6分為高表達(dá), <6分為低表達(dá)。

bcl-2參照文獻(xiàn)[3]方法根據(jù)染色的強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量分別記分。不著色為0分,淺黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分。無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞染色為0 分,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于30%為1分,31%～70%為2分,70%以上為3分。根據(jù)染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)得分之和分為4級(jí),即(-)為0分,弱陽(yáng)性(+) 為1～2分,陽(yáng)性(++)為3～4分,強(qiáng)陽(yáng)性(+++) 為5～6分。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

p21、p27陽(yáng)性表達(dá)主要表現(xiàn)為胞核染色，bcl-2陽(yáng)性表達(dá)主要表現(xiàn)為胞質(zhì)染色。p21、p27、bcl-2蛋白總陽(yáng)性表達(dá)率分別為44.93%、50.72%、52.17%，各種蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率在大腸癌組織與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) （表1）。

p21表達(dá)在69例大腸癌中陽(yáng)性表達(dá)率為44.93%（圖1）；22例大腸腺瘤中陽(yáng)性表達(dá)率為18%；20例正常大腸黏膜中陽(yáng)性表達(dá)率為15%。正常黏膜與大腸腺瘤的陽(yáng)性表達(dá)率基本相同（P=0.890 1）,兩者的陽(yáng)性表達(dá)率與大腸癌相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)（表1）。在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中p21陽(yáng)性表達(dá)率為70.83%,高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中p21 (31.11%)的陽(yáng)性表達(dá)率,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與臨床其他病理因素均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)（表2）。

p27表達(dá)在69例大腸癌中陽(yáng)性表達(dá)率為50.72%（圖2）; 22例大腸腺瘤中陽(yáng)表達(dá)率為86%; 20例正常黏膜中陽(yáng)性表達(dá)率為90%。正常黏膜與大腸腺瘤的陽(yáng)性表達(dá)率基本相同(P>0.05)，兩者的陽(yáng)性表達(dá)率與大腸癌相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) （表1） 。在高、中、低分化腺癌中p27kip1 表達(dá)率分別是100.00%、88.24%和31.91%，高分化腺癌與中分化腺癌相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000),而兩者與低分化腺癌相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與臨床其他病理因素均無(wú)相關(guān)性(P>0.05) （表2）。

bcl-2表達(dá)在69例大腸癌中陽(yáng)性表達(dá)率為52.17%（圖3）;22例大腸腺瘤中陽(yáng)表達(dá)率為50%;20例正常黏膜中陽(yáng)性表達(dá)率為20%。大腸癌與腺瘤的陽(yáng)性表達(dá)率基本相同（P=0.859 0），兩者的陽(yáng)性表達(dá)率與正常大腸黏膜相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) （表1）。在大腸癌組織中bcl-2 表達(dá)率與性別、年齡和腫瘤大體類型均無(wú)相關(guān)性。但在高、中和低分化腺癌中bcl-2 表達(dá)率分別是100.00%、82.35％、36.17％,高分化、中分化腺癌與低分化腺癌相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.023 2、0.001 1)；TNM臨床分期Ⅳ期bcl-2 表達(dá)率顯著低于Ⅰ期（P＝0.019 8）、Ⅱ期（P＝0.049 1）、Ⅲ期（P＝0.044 3），相互比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中bcl-2表達(dá)率為33.33％ ,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者為62.22％，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022 1)（表2）。

3討論

p21是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界腫瘤治療中受關(guān)注的焦點(diǎn)[4]。p21的過(guò)表達(dá)可使細(xì)胞周期阻滯于G1期、G2期或S期[5]。大腸癌中p21蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均顯著高于大腸腺瘤和正常大腸黏膜(P<0.05) ，正常黏膜與腺瘤的陽(yáng)性表達(dá)率基本相同（P=0.890 1）。在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中p21陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；pP21陽(yáng)性表達(dá)與臨床其他病理因素均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。從而表明p21能夠預(yù)測(cè)大腸癌預(yù)后,可以作為腫瘤的一個(gè)標(biāo)記物，并可作為一種臨床診斷標(biāo)記,便于早期發(fā)現(xiàn),早期診斷,也可作為潛在的治療靶點(diǎn),進(jìn)而有效地降低腫瘤的生物學(xué)惡性程度,提高患者的生存質(zhì)量,并延長(zhǎng)其生存時(shí)間,有一定的臨床意義。

p27是近年發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的重要基因, 其表達(dá)產(chǎn)物p27蛋白參與細(xì)胞的增殖、分化調(diào)控和凋亡, 對(duì)細(xì)胞周期具有負(fù)調(diào)控作用, 被認(rèn)為是抑癌基因[6]。Loda等[7]采用免疫組化的方法分析了149例原發(fā)性結(jié)腸癌中p27的表達(dá)，應(yīng)用多因素分析表明,p27是獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。尤其在Ⅱ期腫瘤,p27kipl缺乏對(duì)結(jié)腸癌是一個(gè)有力的負(fù)性預(yù)后指標(biāo), 有助于確定哪些病人可進(jìn)行輔助治療, 使p27kipl無(wú)表達(dá)或低表達(dá)者從中受益。本組研究中, 正常大腸黏膜、大腸腺瘤和大腸癌中均有p27kipl表達(dá), 腺瘤及正常大腸黏膜的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，大腸癌的陽(yáng)性表達(dá)率與大腸腺瘤及正常大腸黏膜比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。我們的研究表明高分化腺癌與中分化腺癌相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000),而兩者與低分化腺癌相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明p27的表達(dá)與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)，而與臨床其他病理因素均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，故p27蛋白檢測(cè)可作為評(píng)價(jià)大腸癌惡性程度的重要指標(biāo)。