王加付

摘要：隨著科學(xué)的不斷發(fā)展，運用質(zhì)譜法進行蛋白質(zhì)的分析日益增多，本文簡要綜述了肽和蛋白質(zhì)等生物大分子質(zhì)譜分析的特點、方法及蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的原理、方式和應(yīng)用，并對其發(fā)展前景作出展望。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析應(yīng)用

0引言

蛋白質(zhì)是生物體中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物細(xì)胞，約占細(xì)胞干質(zhì)量的50％以上，作為生命的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。蛋白質(zhì)在催化生命體內(nèi)各種反應(yīng)進行、調(diào)節(jié)代謝、抵御外來物質(zhì)入侵及控制遺傳信息等方面都起著至關(guān)重要的作用，因此蛋白質(zhì)也是生命科學(xué)中極為重要的研究對象。

1質(zhì)普分析的特點

質(zhì)譜分析用于蛋白質(zhì)等生物活性分子的研究具有如下優(yōu)點：很高的靈敏度能為亞微克級試樣提供信息，能最有效地與色譜聯(lián)用，適用于復(fù)雜體系中痕量物質(zhì)的鑒定或結(jié)構(gòu)測定，同時具有準(zhǔn)確性、易操作性、快速性及很好的普適性。

2質(zhì)譜分析的方法

近年來涌現(xiàn)出較成功地用于生物大分子質(zhì)譜分析的軟電離技術(shù)主要有下列幾種：①電噴霧電離質(zhì)譜；②基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜：③快原子轟擊質(zhì)譜：④離子噴霧電離質(zhì)譜；⑤大氣壓電離質(zhì)譜。在這些軟電離技術(shù)中，以前面三種近年來研究得最多，應(yīng)用得也最廣泛。

3蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析

蛋白質(zhì)是一條或多條肽鏈以特殊方式組合的生物大分子，復(fù)雜結(jié)構(gòu)主要包括以肽鏈為基礎(chǔ)的肽鏈線型序列[稱為一級結(jié)構(gòu)]及由肽鏈卷曲折疊而形成三維[稱為二級，三級或四級]結(jié)構(gòu)。目前質(zhì)譜主要測定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數(shù)目和位置。

3.1蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析原理以往質(zhì)譜(MS)僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析，由于新的離子化技術(shù)的出現(xiàn)，如介質(zhì)輔助的激光解析／離子化、電噴霧離子化，各種新的質(zhì)譜技術(shù)開始用于生物大分子的分析。其原理是：通過電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場、磁場將具有特定質(zhì)量與電荷比值(M／Z值)的蛋白質(zhì)離子分離開來，經(jīng)過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的M／Z值，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。

3.2蛋白質(zhì)和肽的序列分析現(xiàn)代研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)越來越多的小肽同蛋白質(zhì)一樣具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽庫是現(xiàn)在的研究熱點之一。因此需要高效率、高靈敏度的肽和蛋白質(zhì)序列測定方法支持這些研究的進行。現(xiàn)有的肽和蛋白質(zhì)測序方法包括N末端序列測定的化學(xué)方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化學(xué)降解法等，這些方法都存在一些缺陷。例如作為肽和蛋白質(zhì)序列測定標(biāo)準(zhǔn)方法的N末端氨基酸苯異硫氰酸酯(Dhenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又稱PTH法)，測序速度較慢(50個氨基酸殘基／天)：樣品用量較大(ntool級或幾十pmol級)；對樣品純度要求很高；對于修飾氨基酸殘基往往會錯誤識別，而對N末端保護的肽鏈則無法測序。C末端化學(xué)降解測序法則由于無法找到PITC這樣理想的化學(xué)探針，其發(fā)展仍面臨著很大的困難。在這種背景下，質(zhì)譜由于很高的靈敏度、準(zhǔn)確性、易操作性、快速性及很好的普適性而倍受科學(xué)家的廣泛注意。在質(zhì)譜測序中，靈敏度及準(zhǔn)確性隨分子量增大有明顯降低，所以肽的序列分析比蛋白容易許多，許多研究也都是以肽作為分析對象進行的。近年來隨著電噴霧電離質(zhì)譜(electrospray ionisation，ESI)及基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption／ionization，MALDI)等質(zhì)譜軟電離技術(shù)的發(fā)展與完善，極性肽分子的分析成為可能，檢測限下降到fmol級別，可測定分子量范圍則高達100000Da，目前基質(zhì)輔助的激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法(MALDI TOF Ms)已成為測定生物大分子尤其是蛋白質(zhì)、多肽分子量和一級結(jié)構(gòu)的有效工具，也是當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域中重大課題——蛋白質(zhì)組研究所，必不可缺的關(guān)鍵技術(shù)之一。目前在歐洲分子生物實驗室(EMB L)及美國、瑞士等國的一些高校已建立了MALDI TOF MS蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)(序列)譜庫，能為解析FAST譜圖提供極大的幫助，并為確證分析結(jié)果提供可靠的依據(jù)。

3.3蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析方式質(zhì)譜用于肽和蛋白質(zhì)的序列測定主要可以分為三種方法：一種方法叫蛋白圖譜(Droteinmapping)，即用特異性的酶解或化學(xué)水解的方法將蛋白切成小的片段，然后用質(zhì)譜檢測各產(chǎn)物肽分子量，將所得到的肽譜數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫，搜索與之相對應(yīng)的已知蛋白，從而獲取待測蛋白序列。將蛋白質(zhì)繪制“肽圖”是一重要測列方法。第二種方法是利用待測分子在電離及飛行過程中產(chǎn)生的亞穩(wěn)離子，通過分析相鄰?fù)M類型峰的質(zhì)量差，識別相應(yīng)的氨基酸殘基，其中亞穩(wěn)離子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用誘導(dǎo)碎裂，第三種方法與Edman法有相似之處，即用化學(xué)探針或酶解使蛋白或肽從N端或C端逐一降解下氨基酸殘基，形成相互間差一個氨基酸殘基的系列肽，名為梯狀測序(Iaddersequencing)，經(jīng)質(zhì)譜檢測，由相鄰峰的質(zhì)量差知道相應(yīng)氨基酸殘基。

3.3.1蛋白消化蛋白的基團越大，質(zhì)譜檢測的準(zhǔn)確率越低。因此，在質(zhì)譜檢測之前，須將蛋白消化成小分子的多肽，以提高質(zhì)譜檢測的準(zhǔn)確率。一般而言，6－20個氨基酸的多肽最適合質(zhì)譜儀的檢測?，F(xiàn)今最常用的酶為胰蛋白酶(trypsin)，它于蛋白的賴氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)處將其切斷。因此，同～蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化后，會產(chǎn)生相同的多肽。

3.3.2基質(zhì)輔助激光解吸電離／飛行時間質(zhì)譜測量法(MAL-DI-TOF MS)簡而言之，基質(zhì)輔助激光解吸電離，飛行時間質(zhì)譜測量儀是將多肽成分轉(zhuǎn)換成離子信號，并依據(jù)質(zhì)量／電荷之比(mass／charge，m／z)來對該多肽進行分析，以判斷該多肽源自哪一個蛋白。

3.3.3電子噴霧電離質(zhì)譜測量法(eIectrosprayion-izationmass spectrometry，ESI—MS)。

4蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的應(yīng)用

1981年首先采用FAB雙聚焦質(zhì)譜測定肽分子量，分析十一肽(Mr=1318)，質(zhì)譜中出現(xiàn)準(zhǔn)分子離子[M+1]+=1319強峰。在蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析中，質(zhì)譜的準(zhǔn)確性(accuracy)對測定結(jié)果有很大影響，因此質(zhì)譜測序現(xiàn)在仍很難被應(yīng)用于未知蛋白的序列測定。肽和蛋白的質(zhì)譜序列測定方法具有快速、用量少、易操作等優(yōu)點，這些都非常適合于現(xiàn)在科學(xué)研究的需要。我們相信，隨著各種衍生化方法和酶解方法的不斷改進，蛋白雙向電泳的應(yīng)用以及質(zhì)譜技術(shù)的不斷完善，質(zhì)譜將會成為多肽和蛋白質(zhì)分析最有威力的工具之一。