黃凱豐 江解增

（1.揚(yáng)州大學(xué)水生蔬菜研究室，江蘇揚(yáng)州，225009；2.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物遺傳育種研究所）

重金屬鎘、鉛脅迫對茭白DNA交聯(lián)的影響

黃凱豐1,2江解增1

（1.揚(yáng)州大學(xué)水生蔬菜研究室，江蘇揚(yáng)州，225009；2.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物遺傳育種研究所）

以單季茭白品種蔣墅茭和雙季茭白品種葑紅早為試材，對Cd2+、Pb2+的單一及其復(fù)合脅迫，進(jìn)行有機(jī)肥和無機(jī)肥處理，測定了兩茭白品種葉片中DNA的提取量以及DNA增色效應(yīng)的變化。試驗結(jié)果表明，Cd2+、Pb2+脅迫均能顯著降低兩茭白品種葉片中DNA提取的量及DNA增色效應(yīng)的程度。不同脅迫處理方式間以復(fù)合脅迫處理下茭白葉片中DNA提取的量顯著低于單一脅迫處理，復(fù)合脅迫處理時茭白葉片DNA的增色效應(yīng)下降的幅度顯著大于單一脅迫處理。不同肥料處理間則以無機(jī)肥處理時DNA提取的量顯著低于有機(jī)肥處理；而無機(jī)肥處理時茭白葉片DNA增色效應(yīng)下降的幅度顯著大于有機(jī)肥處理。品種間同比均以蔣墅茭較高。

重金屬 復(fù)合脅迫 DNA提取量 DNA增色效應(yīng)

分析目前有關(guān)重金屬污染對作物傷害機(jī)理的研究資料，不難發(fā)現(xiàn)，極大部分研究報告均集中于研究重金屬脅迫條件下作物生長發(fā)育的外在表型、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、酶活性差異及過氧化脅迫過程，即著重于研究環(huán)境污染物對作物傷害的生理、生化后果，對其成因，尤其是對作物DNA毒性及與此相關(guān)的基因組正常表達(dá)的干擾的研究相當(dāng)少，有的甚至還是空白。

目前關(guān)于重金屬離子脅迫對DNA的傷害主要集中在動物和人體的細(xì)胞。Corvetti等[1]，Whiting等[2]的研究發(fā)現(xiàn)，重金屬離子脅迫可導(dǎo)致動物和人體細(xì)胞期外DNA合成速率的大幅度提高；Popp等[3]，Stearns等[4]，Tama等[5]發(fā)現(xiàn)，重金屬離子脅迫可導(dǎo)致動物和人體細(xì)胞DNA的斷裂；同時重金屬離子脅迫也可造成動物和人體細(xì)胞DNA產(chǎn)生DNA-蛋白質(zhì)、DNA鏈間交聯(lián)[6～8]，進(jìn)而干擾基因組的正常表達(dá)，導(dǎo)致癌和其他疾病的發(fā)生。那么，重金屬污染是否也對茭白（Zizania latifoliaTurcz.）的DNA產(chǎn)生損傷呢？因此，本文以江蘇省特色水生蔬菜茭白為研究對象，研究了其在不同肥料處理下，Cd2+，Pb2+單一及其復(fù)合脅迫對茭白葉片細(xì)胞中DNA交聯(lián)的影響，以期為重金屬離子對茭白傷害機(jī)理的研究提供一些科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試重金屬離子為：Cd2+（CdCl2·2.5H2O）、Pb2+[Pb（NO3）2]均為分析純。

供試茭白品種：單季茭品種蔣墅茭、雙季茭品種葑紅早。

表1 重金屬對茭白葉片DNA提取量和增色效應(yīng)的影響

1.2 種植管理

試驗在揚(yáng)州大學(xué)水生蔬菜試驗水池中進(jìn)行。2007年4月24日，將取自揚(yáng)州大學(xué)水生蔬菜試驗田的土壤 （Cd2+含量0.16 mg/kg；Pb2+含量0.17 mg/kg，pH值7.54）按20 cm的厚度，鋪設(shè)到每個水泥池中，每個水池長1.5 m、寬1 m、深0.5 m，在各池中分別施有機(jī)肥（菜籽餅：1500 kg/hm2）和無機(jī)肥（與菜籽餅N，P，K含量相當(dāng)?shù)娜獜?fù)合肥：750 kg/hm2）做基肥，灌水至30 cm，并在試驗過程中通過不斷的灌自來水來保持該水位。5月13日，選擇大田中上年種植的、具有典型種性的茭墩分墩移栽，每墩帶有3～5支新生分蘗并有少量老墩，均勻栽植于水池中，行距 30 cm，株距35 cm，每池中均栽兩品種茭白各6墩，品種間用濾網(wǎng)分隔。

待茭白植株返青成活、長出新葉后，于5月25日，按土壤和水的總體積為準(zhǔn)設(shè)置重金屬濃度，Cd2+：100 mg/L(以 Cd 100表示)；Pb2+：1000 mg/L（以 Pb 1000表示)、Cd2+-Pb2+復(fù)合污染（Cd2+100 mg/L，Pb2+1000 mg/L，以Cd-Pb表示），向池中均勻投放高濃度的CdCl2·2.5H2O、Pb（NO3）2母液，并攪拌均勻，設(shè)空白對照，3次重復(fù)。茭白生長過程中，分別在返青、分蘗期、孕茭期，按225 kg/hm2用量施三元復(fù)合肥在無機(jī)肥處理的水池中；按450 kg/hm2的用量施菜籽餅在有機(jī)肥處理的水池中。管理過程中所有枯葉均放入水池中漚爛，以盡量避免重金屬的損失。保持水池中的水位，水池上方2.5～3.5 m覆蓋塑料薄膜，以防止降雨。

1.3 樣品處理及測定

于2007年6月2日，在各處理小區(qū)中隨機(jī)選擇兩茭白品種的倒三片功能葉，洗凈并吸干表面的水珠，取葉尖約1 cm位置，剪碎混勻，以1.00 g每包，在液氮中處理5～10 min，取出后放入-80℃冰箱中保存。

采用CTAB法[9]提取茭白葉片中的DNA，并于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用葛才林等[10]的方法，測定DNA增色效應(yīng)指標(biāo)，用以研究重金屬引起的DNA交聯(lián)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬脅迫對茭白葉片DNA提取量的影響

由表1可以看出，Cd2+，Pb2+脅迫能顯著降低兩茭白品種葉片中DNA提取的量，說明重金屬離子脅迫能顯著增加茭白葉片中不能被提取的DNA的量。不同脅迫處理間以復(fù)合脅迫處理下茭白葉片中DNA提取的量顯著低于單一脅迫處理。不同重金屬離子脅迫間則以Pb2+脅迫下提取的DNA的量顯著高于Cd2+脅迫處理。不同肥料處理間表現(xiàn)為：有機(jī)肥處理下茭白葉片DNA提取的量顯著高于無機(jī)肥處理。品種間存在差異，以蔣墅茭同比高于葑紅早。

2.2 重金屬脅迫對茭白葉片DNA增色效應(yīng)的影響

由表1可以看出，重金屬離子脅迫能顯著降低兩茭白品種葉片DNA增色效應(yīng)的程度。不同脅迫處理間以復(fù)合脅迫處理下茭白葉片DNA增色效應(yīng)下降的幅度顯著大于單一脅迫處理，相差達(dá)2～3倍。Cd2+、Pb2+脅迫間相比，以Pb2+脅迫處理下茭白葉片DNA增色效應(yīng)下降的幅度顯著小于Cd2+脅迫處理。不同肥料處理間相比表現(xiàn)為：有機(jī)肥處理下茭白葉片DNA增色效應(yīng)下降的幅度顯著小于無機(jī)肥處理。品種間則以蔣墅茭同比高于葑紅早。

3 小結(jié)與討論

葛才林等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，重金屬離子脅迫能降低水稻、小麥葉片中DNA提取的量，且不同重金屬離子脅迫間存在差異，本試驗得出相似的結(jié)果。夏壽萱[11]認(rèn)為，在進(jìn)行DNA提取時，不能被提取部分的比例增大，即提取DNA量的減少，其主要原因是DNA和蛋白質(zhì)之間形成了交聯(lián)。從本試驗的結(jié)果可以看出，DNA和蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)，在茭白葉片中同樣存在，且以無機(jī)肥處理和復(fù)合脅迫處理時，其交聯(lián)的程度分別大于有機(jī)肥處理和單一脅迫處理。

Duguid等[6]的研究表明，二價金屬離子（如Cd2+, Ni2+，Co2+，Mn2+，Ca2+，Mg2+）能造成兩條不同DNA鏈的交聯(lián)，引起小牛胸腺DNA“片段”的凝聚，使DNA的熔解溫度Tm大大提高，且不同二價陽離子促使DNA鏈間交聯(lián)的能力也不相同。從本試驗的結(jié)果可以看出，不同重金屬離子脅迫均能顯著降低茭白葉片DNA的增色效應(yīng)，這可能是因為重金屬離子脅迫能促進(jìn)DNA“片段”的凝聚，使茭白葉片中的DNA發(fā)生鏈間交聯(lián)，從而使DNA的熔解溫度顯著提高，導(dǎo)致在加熱至70℃時，DNA仍不能解鏈，因而70℃條件下仍未見明顯的DNA增色效應(yīng)。本試驗中無機(jī)肥處理、復(fù)合脅迫處理下DNA增色效應(yīng)的程度分別顯著低于有機(jī)肥處理、單一脅迫處理，說明茭白在無機(jī)肥處理、復(fù)合脅迫處理下，其DNA交聯(lián)的程度大于有機(jī)肥處理、單一脅迫處理。

[1]Corvetti G,Fornaro M,Geuna S,et al.Unscheduled DNA synthesis in rat adult myenteric neurons:an immunohistochemical study[J].Neuroreport,2001,12:2165-2168.

[2]Whiting R F,Wei L,Stich H G.Enhancement by transition metals of unscheduled DNA synthesis induced by isoniazid and related hydrazines in cultured normal and xeroderma pigmentosum human cells [J].MutatRes,1979,62:505-515.

[3]Popp W,Vahrenholz C,Schmieding W,et al.Investigations of the frequency of DNA strand breakage and cross-linking and of sister chromatid exchange in the lymphocytes of electric welders exposed to chromium-and nickel-containing fumes [J].Int Arch Occup Environ Health,1991,63: 115-120.

[4]Stearns D M,Kennedy L J,Giangrande P H,et al.Reduction of chromium(Ⅵ)by ascorbate leads to chromium-DNA binding and DNA strand breaks in vitro [J].Biochemistry, 1995,34:910-919.

[5]Tawa R,Takami M,Imakura Y,et al.Breaks in doublestrand DNA by Cu(Ⅱ)complexes of etoposide(VP-16)and its derivatives,as evaluated by S1 nuclease treatment[J]. BiolPharmBull,1997,20:1002-1005.

[6]Duguid J G,Bloomfield V A.Aggregation of melted DNA by divalent metal ion-mediated cross-linking [J].Biophys J,1995,69:2642-2648.

[7]Mattagajasingh S N,Misra H P.Mechanisms of the carcinogenic chromium (Ⅵ)-induced DNA-protein cross-linking and their characterization in cultured human cells[J].J Biol Chem,1996,271:33550-33560.

[8]Misra M,Olinski R,Dizdaroglu M,et al.Enhancement by L-histidine of nickel(II)-induced DNA-protein cross-linking and oxidative DNA base damage in the rat kidney[J]. Chem Res Toxicol,1993,6:33-37.

[9]上海植物生理學(xué)會.植物生理學(xué)實驗手冊 [M].上海：上?？萍汲霭嫔纾?985：191-192.

[10]葛才林，楊小勇，孫錦荷，等.重金屬脅迫引起的水稻和小麥幼苗DNA損傷[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報，2002，28（6）：419-424.

[11]夏壽萱.放射生物學(xué)[M].北京：軍醫(yī)醫(yī)學(xué)出版社，1998：87-88.

Effect of Cadmium and Lead Stress on the DNA Cross-linking inZizania latifolia

HUANG Kaifeng1,2,JIANG Jiezeng1
(1.Institute of Aquatic Vegetable Research,Yangzhou University,Yangzhou 225009; 2.Institute of Plant Genetics and Breeding,School of Life Sciences,Guizhou Normal University)

To study the contents of dietary fiber(DF)and crude fiber in gall's ofZizania latifoliagrown in stress with Cd2+100 mg/L,Pb2+1000 mg/L and their combined stress,a single-harvested cultivar Jiangshujiao and a double-harvested cultivar Fenghongzao ofZizania latifoliawere cultured in soil with organic fertilizer(OF)and inorganic fertilizer(IF).The results showed that,Cd2+and Pb2+stress could reduce the amount of extracted DNA and the hyperchromicity of DNA in the leaves ofZizania latifoliaremarkably.Treated with combined stress of Cd2+and Pb2+,the amount of extracted DNA in the leaves ofZizania latifoliawas lower than single stress.The hyperchromicity of DNA had a larger descendent range when treated with combined stress than single stress.Treated with inorganic fertilizer,the amount of extracted DNA in the leaves ofZizania latifoliawas lower than treated with organic fertilizer.The hyperchromicity of DNA had a larger descendent range when treated with inorganic fertilizer than organic fertilizer.The amount of extracted DNA and the hyperchromicity of DNA in leaves of Jiangshu were higher than that of Fenghongzao at the same treatment.

Heavy metal;Combined stress;Amount of extracted DNA;Hyperchromicity of DNA

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.14.014

國土資源部與江蘇省政府合作項目[(2003)019-01]，江蘇省農(nóng)業(yè)三項工程項目[sx(2005)089]

黃凱豐（1979-），男，博士，研究方向為污染生態(tài)，電話：0851-6780646，13608585660。E-mail：hkf1979@163.com

江解增，通信作者

2009-03-12