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(1.南京市婦幼保健院，江蘇 南京 210004；2.中國藥科大學制藥有限公司，江蘇 南京 210009)

在分析化學中，化學發(fā)光是當基態(tài)分子吸收化學反應中釋放的能量躍遷到激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子以光輻射的形式返回到基態(tài)時產(chǎn)生的光。基于化學發(fā)光強度和被測物含量之間的關系建立的分析方法叫化學發(fā)光分析法，化學發(fā)光與高效液相色譜、毛細管電泳、免疫分析等技術的結合，具有靈敏度高，線性范圍寬，儀器簡單、操作簡便等特點，已廣泛地應用于環(huán)境、臨床、食品和工業(yè)分析中[1-4]。將化學發(fā)光與免疫分析方法相結合，綜合了化學發(fā)光的高靈敏度和免疫分析的高選擇性，近年來，成為研究的熱點。

1 化學發(fā)光免疫分析的分類

化學發(fā)光免疫分析根據(jù)發(fā)光體系應用于免疫分析中的方式不同可分為：直接標記發(fā)光物質的免疫分析、酶催化化學發(fā)光免疫分析和電化學發(fā)光免疫分析。

1.1 直接標記發(fā)光物質的免疫分析 該方法是用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體。常用于標記的化學發(fā)光物質有吖啶酯類化合物，是有效的發(fā)光標記物，其通過起動發(fā)光試劑的作用而發(fā)光，強烈的直接發(fā)光在1 s內完成,為快速的閃爍發(fā)光。吖啶酯作為標記物用于免疫分析，其化學反應簡單、快速、無需催化劑；檢測小分子抗原采用競爭法，大分子抗原則采用夾心法，非特異性結合少，本底低；與大分子的結合不會減小所產(chǎn)生的光量，從而增加靈敏度。張皓等[4]采用直接化學發(fā)光技術進行的全自動雙抗夾心免疫測定方法，對130例患者測定血清β-HCG含量法。用化學發(fā)光免疫分析法檢測β-HCG，操作簡便、敏感度高、特異性強，優(yōu)于一般的酶聯(lián)免疫法和放射免疫法，適合于臨床實驗室推廣使用。

1.2 酶催化化學發(fā)光免疫分析 從標記免疫分析角度，酶催化化學發(fā)光免疫分析應屬酶免疫分析，只是酶反應的底物是發(fā)光劑，操作步驟與酶免疫分析完全相同：以酶標記生物活性物質(如酶標記的抗原或抗體)進行免疫反應，免疫反應復合物上的酶再作用于發(fā)光底物，在信號試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測定。目前常用的標記酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)，它們有各自的發(fā)光底物。辣根過氧化物酶常用的底物為魯米諾或其衍生物如異魯米諾,魯米諾的氧化反應在堿性緩沖液中進行，在過氧化物酶及活性氧(過氧化陰離子、單線態(tài)氧、羥自由基、過氧化氫)存在下,生成激發(fā)態(tài)中間體，當其回到基態(tài)時發(fā)光，其波長為425 nm。鈕心怡等[1]采用特異性的兩株C-P單克隆抗體,辣根過氧化物魯米諾酶促增敏化學發(fā)光體系，利用雙抗體夾心法檢測。敏感度為0.102 μg/L；檢測線性范圍為0.102～20 μg/L;多人次檢測證實試劑盒批內變異均小于10%，分析間變異小于15%；與18 μg/L人胰島素原、2000 mIU/L的人胰島素無顯著交叉反應。

堿性磷酸酶所用底物為環(huán)1，2-二氧乙烷衍生物，用于化學發(fā)光酶免分析底物而設計的分子結構中包含起穩(wěn)定作用的基團——金剛烷基，其分子中發(fā)光基團為芳香基團和酶作用的基團,在酶及起動發(fā)光試劑作用下引起化學發(fā)光。馮艷銘等[3]采用雙抗體異位點一步夾心法，以甲胎蛋白單克隆抗體作為固相包被，采用改良過碘酸鈉法進行甲胎蛋白多克隆抗體與堿性磷酸酶偶聯(lián)制備酶標抗體；以金剛烷胺衍生物CSPD作為底物，優(yōu)化CSPD與Sapphire II發(fā)光體系用國家標準品校定定量標準品，建立了人血清AFP的化學發(fā)光免疫定量分析法。利用化學發(fā)光酶免疫分析方法，以堿性磷酸酶作為標記物，環(huán)1，2-二氧乙烷衍生物AMPPD為發(fā)光底物，測定血清中的糖抗原50，檢出限為1.0 umL-1,線性范圍為0～300 umL-1。批內精密度<7%，批內精密度為11%。

1.3 電化學發(fā)光免疫分析 電化學發(fā)光免疫分析的反應在電極表面進行，發(fā)光底物為三聯(lián)吡啶釕，用另一反應物三丙胺來激發(fā)光反應。在陽極表面，這兩種物質可同時失去電子，發(fā)生氧化反應。在電極板上二價的三聯(lián)吡啶釕迅速被氧化成三價三聯(lián)吡啶釕，與此同時三丙胺也在電極板上被氧化成三丙胺陽離子自由基，三丙胺陽離子自由基自發(fā)地釋放一個質子而變成三丙胺非穩(wěn)定分子，將一個電子遞給三價三聯(lián)吡啶釕，形成激發(fā)態(tài)的二價三聯(lián)吡啶釕。激發(fā)態(tài)的二價三聯(lián)吡啶釕在衰減的同時發(fā)射一個波長為620 nm的光子，重新回到基態(tài)二價三聯(lián)吡啶釕。這一過程在電極表面反復進行，產(chǎn)生高效、穩(wěn)定的連續(xù)發(fā)光，并不斷增強。張繼東[5]用電化學發(fā)光免疫分析法在檢測乙肝標志物,發(fā)現(xiàn)用電化學方法檢測，靈敏度更高，專屬性更強。

2 新進展

化學免疫分析方法的新進展主要表現(xiàn)在新的標記物以及標記技術的應用，新型固相載體的應用以及聯(lián)用技術。

2.1 新的標記物 近年來，科學家們致力于化學發(fā)光物質的研究，通過往發(fā)光體系中加入增加化學增強劑來增加量子產(chǎn)率以及發(fā)光時間。同時一些學者將目光集中于新的標記發(fā)光物的開發(fā)中。并取得了相應成果。目前已證明從棕櫚樹和大豆中提取的HRP的陰離子型同工酶(HRP2A)在沒有增強劑的情況下可以高效、常時間催化luminol-H2O2體系發(fā)光[6]，并且HRP-A比HRP-C穩(wěn)定性更好[7-9]，這在酶標記物的儲存中是非常重要的。而白細胞堿性磷(Leukocyte Alkaline Phosphatase，LAP)與ALP一樣，也有催化性能，并已用于化學發(fā)光的檢測[10]。此外，還通過合成技術合成了吖啶酯類化學發(fā)光試劑。Zhuang等[11]合成了一種新型雙吖啶化合物：10，10′2二甲基23，3′2二磺基29，9′2二雙吖啶(DMDSBA)，并詳細研究了它的化學發(fā)光性質。DMDSBA被用于標記抗-CEA抗體。標記的比率接近1.15～1.32，平均標記比例是1.25。結果表明，連接到抗-CEA抗體后，標記抗體的免疫反應活性與DMDSBA的量子效率沒有明顯改變。建立了一種新的夾心化學發(fā)光免疫方法，測定人血清中CEA的線性范圍為1.0～100 ng/mL，檢測限0.53 ng/mL。

2.2 新標記技術的應用 固相標記方法的應用，減少游離標記物以及聚合蛋白質；納米技術與生物分析的結合，即利用Au、Ag等陽離子對化學發(fā)光具有催化放大作用，提高檢測靈敏度。Honglan Q等[12]利用電化學發(fā)光免疫分析方法，將N-氨丁基-N-異魯米諾(ABEI)作為發(fā)光標記試劑標記在金毫微粒改性的石蠟活化的石墨電極上,測定人體IgG。電化學發(fā)光的強度大大增強，ABEI檢出限為2×10-14mol/L(S/N=3)，IgG的檢出限為1×10-11g/mL(S/N=3)。線性范圍為3.0×10-11～1.0×10-9g/mL。在濃度為1.0×10-10g/mL時的RSD為3.1%。說明金微粒化學發(fā)光的催化放大作用在化學發(fā)光免疫分析方法中有很大的應用前景。量子點(quantumdots，QDs)又稱半導體納米微晶體，是一種由Ⅱ-Ⅵ族或Ⅲ-Ⅴ族元素組成的能夠接受激光產(chǎn)生熒光的半導體納米顆粒，直徑約為2～6 nm。與CLIA常用標記酶和熒光素相比，QDs不易失活，受外部環(huán)境影響小，性質穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，激發(fā)光譜范圍寬，而發(fā)射光譜窄且對稱，是不可多得的標記物。

2.3 新固相材料的應用 新固相材料主要體現(xiàn)在:(1)表面有與蛋白結合的官能團，可以充分固定抗體-抗原；(2)表面性質要保證不影響結合后蛋白的免疫反應活性；(3)比表面積要足夠大以固定足夠量蛋白；(4)應具有親水性以避免與待測物和樣品基質的非共價結合；(5)在載液的沖擊下保持表面的抗體結合活性。目前用于FIIA的固相材料主要有尼龍、瓊脂糖凝膠、磁性粒子，以及二氧化硅[13]、可控孔度玻璃(Controlled pore glass，CPG)和玻璃微珠[14]等有機硅材料。

2.4 與其他技術聯(lián)用 目前研究最多的是毛細管電泳-化學發(fā)光免疫分析技術(CE-CLIA)結合了CE對生物樣品分離的高效分離和CLIA的高靈敏度檢測。王軍華等[2]利用毛細管電泳免疫化學發(fā)光檢測鼠血管平滑肌細胞中zmol骨形成蛋白-2，采用辣根過氧化物酶(HRP)催化魯米諾-過氧化氫，以對碘苯酚增強其化學發(fā)光反應，HRP檢出限為4.4 pmol/L(53zmol)，是目前報道檢測HRP的最高靈敏度之一。用毛細管電泳化學發(fā)光免疫方法測定了人血清中乙肝表面抗原和抗體，并與酶免疫分析方法比較，驗證了毛細管電泳化學發(fā)光免疫技術用于臨床的可行性[15]。

流動注射化學發(fā)光免疫技術流動注射化學發(fā)光分析技術是將化學發(fā)光分析和流動注射相結合的一種高靈敏度的微量及痕量分析技術，其分析速度快、儀器設備簡單，是當前分析化學領域中研究的熱點[16]。利用順序流動注射技術分析非離子型表面活性劑，線性范圍0～1 000 ppb，最低檢出限為10 ppm。每個樣品的分析時間為15 min,已經(jīng)被成功用于河水中anti-ApnEOs的檢測[17]。

3 結語

化學發(fā)光免疫分析方法作為一種高選擇、高靈敏度檢測方法，已經(jīng)被廣泛應用臨床檢測和藥物分析中。隨著新的發(fā)光試劑，新固相材料的研制以及新標記技術應用，化學發(fā)光免疫分析方法的靈敏度，重現(xiàn)性將大大提高。各種聯(lián)用技術的出現(xiàn)，如毛細管電泳-化學發(fā)光免疫技術的聯(lián)用，大大提高了化學發(fā)光免疫的選擇性和重現(xiàn)性。被廣泛應用于臨床檢測和藥物分析中，并朝著自動化、智能化、微型化方向發(fā)展。

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[3]馮艷銘,馬俊芬,吳 飚,等.甲胎蛋白化學發(fā)光免疫定量分析方法的建立[J].第四軍醫(yī)大學學報,2007,28(14):1291-1293.

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