枯草芽孢桿菌抑菌作用的實驗研究

范永瑞

【摘要】 枯草芽孢桿菌抗均蛋白對很多病菌都有抑制或殺滅作用，實驗中對大腸桿菌的拮抗作用進行了研究。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌大腸桿菌拮抗作用較為明顯。

【關(guān)鍵詞】 枯草芽孢桿菌；大腸桿菌；紫外線誘變

芽孢桿菌在自然界分布非常廣泛，多數(shù)芽孢桿菌的抗菌物質(zhì)具有抗菌譜廣，對酸堿度要求不高，熱穩(wěn)定性好，易于進行分子加工等特點，這些都為開發(fā)新型天然防腐劑以及生物防治劑提供了很好的條件?？莶菅挎邨U菌可由稻草中分離得到，對許多植物病原生物具有拮抗作用的非病原微生物。研究枯草芽孢桿菌對大腸桿菌的拮抗作用，并通過紫外誘變手段篩選出高抗大腸桿菌的菌株。

一、材料與方法

1、供試菌種

實驗菌種 ：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌

2、培養(yǎng)基

液體種子培養(yǎng)基：為牛肉膏蛋白凍培養(yǎng)基（不加瓊脂粉）。

固體種子培養(yǎng)基：在液體種子培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入18g/L的瓊脂粉。

3、枯草芽孢桿菌的制備

取稻草約500g，浸泡在清水中2h，再將其煮沸30min，后37℃下培養(yǎng)。24h后再將其煮沸30min，吸取液體1ml于9ml無菌水中，搖勻制成菌懸液，將菌懸液滴兩滴在固體種子培養(yǎng)基上，涂布均勻，37℃下培養(yǎng)48h。最后挑單菌落于液體種子培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)48h。

4、枯草芽孢桿菌的紫外誘變

取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的枯草芽孢桿菌菌液離心（10000r/min，20min），取沉淀收集細(xì)胞，用無菌生理鹽水洗滌2次。玻璃珠振蕩15min。分別取10ml菌懸液于5個直徑9cm的無菌培養(yǎng)皿中，搖勻。無菌條件下在30W，60CM的紫外燈下打開培養(yǎng)皿蓋分別照射60s，90s，120s，150s，180s。不同誘變時間處理的菌懸液各取1ml加入液體種子培養(yǎng)基中37℃黑暗下培養(yǎng)24h。同時取1ml未誘變的菌懸液培養(yǎng)作為對照。致死率=（對照組菌數(shù)-此誘變時間下菌數(shù)）÷對照組菌數(shù)×100%

5、誘變菌株的篩選

培養(yǎng)24h的枯草芽孢桿菌吸取1ml于裝有9ml無菌水的試管中，搖勻；再從中吸取1ml菌懸液，重復(fù)上個步驟，直至稀釋到10-4。用異步培養(yǎng)法挑選高產(chǎn)單菌落。即將稀釋到10-5的菌懸液涂布平板，然后將其倒扣于裝有一薄層氯仿的培養(yǎng)皿蓋熏蒸50min，讓菌落固定在固體種子培養(yǎng)基表面。移去培養(yǎng)皿蓋，讓平板中的氯仿?lián)]發(fā)40min。再取0.5ml 107-108cfu/ml的大腸桿菌菌懸液涂布在此平板上。待平板晾干后37℃培養(yǎng)72h。取所有平板中抑菌圈最大的單菌落擴大培養(yǎng)。

二、結(jié)果與分析

1、不同培養(yǎng)時間對抑菌效果的影響

圖1 抑菌圈隨培養(yǎng)時間的變化

枯草芽孢桿菌隨著培養(yǎng)時間的增加，他的抑菌效果總的來說呈上升趨勢，但其中有抑菌圈變小的過程，這不是說明抗菌蛋白的效果降低了，而可能是由抗菌蛋白的產(chǎn)生時間于大腸桿菌的擴增時間的差別造成的?？咕鞍资且娇莶菅挎邨U菌的平穩(wěn)期時才會產(chǎn)生，在這之前是由于接種液中含有抗菌蛋白，它在抑制大腸桿菌的生長。當(dāng)它逐漸消耗而枯草芽孢桿菌處于非平穩(wěn)期，沒有新的抗菌蛋白產(chǎn)生時，大腸桿菌處于快速增殖的過程，大腸桿菌就會逐漸蔓延，掩蓋部分抑菌圈，就表現(xiàn)為抑菌圈的減小。當(dāng)枯草芽孢桿菌達(dá)到平穩(wěn)期后，抗菌蛋白大量產(chǎn)生，使大腸桿菌死亡，抑菌圈就逐漸擴大。

2、不同接種量芽孢桿菌對大腸桿菌的抑制效果

圖2 不同接種量對抑菌效果的影響

經(jīng)過不同劑量的枯草芽孢桿菌抑制大腸桿菌，經(jīng)測量發(fā)現(xiàn)抑菌圈先隨劑量的增加而增加，200μl的時候達(dá)到最大；后就逐漸變小。其原因是劑量越多，它含的枯草芽孢桿菌就越多，產(chǎn)生的抗菌蛋白越多，所以抑菌效果越好；但達(dá)到一定數(shù)量后，在有限的營養(yǎng)中枯草芽孢桿菌之間會產(chǎn)生競爭關(guān)系，反而會抑制菌群的生長，降低了抗菌蛋白的產(chǎn)生量。

3、不同紫外誘變不同時間的結(jié)果

在30W，60CM處誘變不同時間，60s時致死率最低，但其正突變率太小。隨時間的增加，致死率越來越大，180s時菌種幾乎全被殺死。90s，120s，150s三個時段的致死率相差不大，而且在可接受范圍內(nèi)。但150s時其正突變率達(dá)到104%，是最高的，所以150s誘變時間比較合適。

四、討論

枯草芽孢桿菌抗均蛋白對很多病菌都有抑制或殺滅作用，實驗中對的拮抗作用進行了研究。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌大腸桿菌拮抗作用較為明顯。在農(nóng)林和經(jīng)濟作物的病蟲害防治以及蓄禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖中傳染病的防治方面，芽孢桿菌及其抗菌物質(zhì)展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。利用芽孢桿菌尤其是枯草芽孢桿菌進行生物防治或者生產(chǎn)微生物殺菌劑以代替劇毒化學(xué)藥品是一種可行的策略。

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